用于检测cav1基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒的制作方法【专利摘要】本发明公开了用于检测CAV1基因突变的引物组，包括CAV1基因第1至第3外显子区、3’UTR和启动子对应的PCR扩增引物组和PCR测序引物。本发明还公开了所述引物组的用途、以及包含所述引物组的试剂盒。所述的引物组可以专一性鉴别CAV1基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。【专利说明】用于检测CAV1基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒
技术领域：
[0001]本发明涉及引物组，具体涉及用于检测CAV1基因突变的引物组。本发明还涉及该引物组的用途，以及包含该引物组的试剂盒。【
背景技术：
】[0002]CAV1(caveolaeprotein)，21kDa至24kDa的跨膜蛋白，参与构成细胞膜结构caveolae，其82-101氨基酸残基区域称为Caveolin-scaffoldingDomain(SCD)，是与其他多种分子相互作用的结构基础。CAV1广泛分布于机体终末分化细胞或静止细胞中。不仅能参与对信号转导的调节，抑制细胞生长和转化，还参与小泡运输(包括胞吞作用、胞饮作用和跨胞作用）和胆固醇稳态的维持。它突变能引起遗传性肺动脉高压（heritablepulmonaryarterialhypertensionPAH)〇[0003]肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压(meanpulmonaryarterialpressure，mPAP)^25mmHg的一组临床病理生理综合征。肺动脉高压可以作为一种疾病而独立存在，更常见的是很多疾病进展到一定阶段的病理生理表现。由于肺血管重塑引起肺循环血流动力学改变，最终可导致右心衰竭，甚至死亡。这是一种极度恶性的疾病，七成多患者是年轻人，几乎每个人都知道癌症预后差，但没有人知道肺动脉高压室一种极度恶性疾病，它的病因复杂、发病率高、误诊率高、危害性强，其愈后是灾难性的，可以说，这种病就是心血管疾病中的癌症。这种疾病平均发病年龄是36岁，75%患者集中于20-40岁年龄段，还有15%患者年龄在20岁以下，几岁的孩子也会发病。世界上该病的发病率在1X10-5~1X10-6之间，其中约32%为可遗传性的。2013年2月，在法国尼斯召开的第五界世界肺高血压论坛中，在肺高压诊断和指南中导致遗传性肺动脉高压相关基因增加了CAV1基因的突变。CAV1基因突变的肺动脉高压患者大于占遗传型肺动脉高压的0.25%左右。遗传性肺动脉高压具有遗传早现现象，即在世代传递过程中有发病年龄逐渐超前和病情逐代加剧的现象，且一旦发病，病情进展迅速，很难控制。目前，传统上采用荧光定量PCR的方式检测突变，这个方法局限性很大，它只能检测已经知道的突变位点，并且一次荧光定量PCR只能检测一个点的突变，且准确率不高。CAV1基因突变对不同的人突变的位置和方式是不一样的，用荧光定量PCR方法不能达到检测的目的。【
发明内容】[0004]本发明的目的之一是提供一种用于检测CAV1基因突变的引物组。[0005]CAV1基因的第1到第3外显子区，3'UTR和启动子中的任意一个区域在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，都视为CAV1基因发生了突变。因而，根据CAV1基因第1到第3外显子区，3'UTR和启动子序列分别设计出能专一性鉴别CAV1基因是否突变的特异性引物组。可通过PCR扩增和测序测定CAV1基因上述区域是否发生改变，以鉴定CAV1基因是否发生突变。因此，本发明的用于检测CAV1基因突变的引物组可以是CAV1基因第1到第3外显子区、3'UTR和启动子分别对应的引物组中的一组或两组以上的组合。[0006]本发明第一个目的提供的用于检测CAV1基因突变的引物组，包括CAV1基因第1到第3外显子区，3'UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组，即选自CAV1基因第1到第3外显子区、3'UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组，具体地，所述引物组选自CAV1基因的第1外显子区（Exonl)的PCR扩增引物组、第2外显子区（Exon2)的PCR扩增引物组、第3外显子区(Exon3)的PCR扩增引物组、3'UTR的PCR扩增引物组和启动子的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的组合，所述的上述各PCR扩增引物组为表1所示。[0007]本发明所述的引物组还包括CAV1基因第1到第3外显子区、3'UTR和启动子分别对应的PCR测序引物组中的一组或两组以上的组合。[0008]本发明所述的PCR测序引物组如表2所示。[0009]本发明的目的之二是提供使用上述PCR扩增引物组和PCR测序引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测CAV1基因是否突变的试剂中的用途。[0010]本发明的目的之三是提供一种用于检测CAV1基因突变的试剂盒，以方便采用DNA测序技术检测导致PAH疾病的CAV1基因是否突变。具体地，该用于检测CAV1基因突变的试剂盒，包括CAV1基因的第1到第3外显子区，3'UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组，所述的各PCR扩增引物组为表1所示。[0011]本发明所述的试剂盒还包括如表2所示的CAV1基因的的第1到第3外显子区，3'UTR和启动子分别对应的PCR测序引物组中的一组或两组以上的PCR测序引物组。[0012]本发明所述的试剂盒还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。[0013]所述的PCR扩增试剂包括dNTP、TaqDNA聚合酶等。[0014]所述的PCR产物纯化试剂包括SAP酶、Exo頂每等。[0015]所述的DNA测序试剂包括BigDyemix、EDTA溶液和HIDI溶液等。[0016]本发明的有益效果：(1)本发明根据CAV1基因的第1到第3外显子区、3'UTR和启动子，共5个区域序列设计特异性引物组，可以专一性鉴别CAV1基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。[0017](2)本发明提供的引物组及试剂盒用检测PAH致病基因CAV1基因的突变体，可以快速的检测患者的基因是否突变，可以用于疾病诊断。同时还可以用于CAV1SNP位点与基因功能之间关系的科学研究，以及疾病与基因突变关联方面的研究。[0018](3)本发明扩增的方法简单，不到两个小时可以完成PCR扩增，每个引物扩增的条件类似，可以5个区域分别进行扩增测序，也可以所有区域同时进行扩增测序。这样的测序的方法检测突变比通常荧光定量PCR的方法要更准确，同时检测范围更广泛，测序范围内的任何一个位置突变或插入碱基都能从测序图谱中发现，而荧光定量PCR只能检测目的位点的突变，局限性很大，且准确性不高。[0019](4)采用本发明的DNA扩增测序引物组，可以寻找CAV1基因是否突变有助于查清病因，识别家系中高风险的成员，以及未出生孩子的患病风险，这对提高人口素质，优生优育有重要的意义。对临床上指导用药，寻找病因，基因评估等具有重要的意义。【附图说明】[0020]图1是血液基因组DNA的1%的Agarose电泳图；M:DNADL15000maker，1、2:外周血基因组DNA。[0021]图2是本发明实施例五中的血液样本中的CAV1基因的测序峰图。【具体实施方式】[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。[0023]实施例一依据NCBIGeneBank(NC-000012)公开的CAV1的1~3个外显子区、3'UTR和启动子序列，设计出用于检测CAV1基因是否发生突变的引物组，该引物组包括以上各区域的PCR扩增引物组和PCR测序引物组，结果见表1和表2。[0024]实施例二一种用于检测CAV1基因突变的试剂盒，包括以下成分：CAV1基因的第1到第3外显子区、3'UTR和启动子序列分别对应的PCR扩增引物组与PCR测序引物组，共11对，每条引物10D，各对引物序列参见表1和表2。[0025]本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。[0026]实施例三一种用于检测CAV1基因突变的试剂盒，包括以下成分：(1)CAV1基因第1到第3外显子区、3'UTR和启动子序列分别对应的PCR扩增引物组与PCR测序引物组，共11对，每条引物10D，各对引物序列参见表1和表2。[0027](2)PCR扩增试剂：2.5mMdNTP混合液40μ1、5X扩增缓冲液（含Mg2+)100yl、5Units/ulTaqDNA聚合酶5μ1。[0028](3)PCR产物纯化试剂：1U/ulSAP酶20yl、10U/ulΕχο頂每10μ1。[0029](4)PCR测序试剂：BigDye3.1mix50yl、EDTA溶液（0·125Μ)50μ1、无水乙醇lml、乙醇溶液（75%)1·5mL、HIDI溶液500μ1。[0030]本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。[0031]实施例四一人份检测CAV1基因突变的试剂盒的使用步骤：(1)一份病人的血液lmL，提取血液基因组DNA，使用QIAampDNABloodMiniKit(250)Cat.no.51104提取基因组DNA，该基因组DNA为模板DNAd%Agarose凝胶电泳，结果见图1〇[0032](2)PCR扩增：11对引物共进行11个PCR反应，每个反应体系总体积为20ul，其中，模板DNA150ng2.5mMdNTP1μL上游引物（10μΜ)0.5μL下游引物（10μΜ)0.5μL5Χ扩增缓冲液（含Mg2+)4μLTaqDNA聚合酶（5U/μΙ)0.2μLddΗ2Οupto20μ1PCR循环的反应条件为：(3)PCR产物纯化:共进行11个PCR纯化反应，每个反应体系总体积20μL，包括PCR产物8μ1SAP酶（1U/μΙ)ΙμLExonucleses(10μΜ)ΙμLddΗ2Οupto10μ1〇[0033](4)DNA测序反应：共进行11个测序反应。每个反应的体系包括PCR纯化产物1~2μ1BigDye3.1mix2μ1DNA测序引物(0·4μΜ)2μ1反应条件为：(5)反应结束后纯化测序产物，即分别在每个反应体系加入ΙμL0.125Μ的EDTA和15μ1的乙醇，常温放置15min，4°C1000g/min离心30min，小心倒去上清，加入75%乙醇溶液，4°C1000g/min离心15min，小心倒去上清;室温放置20min。瞭干后在管中加入Hi-Di去离子甲酰胺1〇μ1，放入测序仪中。测序产物上ABI3130XL测序仪，测序文件用Polyphred软件分析，并结合人工校对记录后整理出结果。如果所得测序结果中，CAV1基因第1到第3外显子区、3'UTR和启动子序列中任意一个区域的结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，认为CAV1基因发生了突变，反之则没有发生突变。[0034]实验结果：此样本的CAV1基因并未发生突变。[0035]实施例五与实施例四不同的是：(2)PCR扩增：11对引物共进行11个PCR反应，每个反应体系总体积为20ul，包含基因组DNA(10ngAU)lyl、dNTP混合液（2.5mMeach)lyl、5X扩增缓冲液（含Mg2+)4yl、上下游引物（ΙΟμΜ)各0.5μ1，TaqDNA聚合酶(5υ/μ1)0.2μ1，去离子水12.8μ1。反应条件为反应条件为:98°C反应5min;98°C反应15s，55°C反应40s，72°C反应lmins，共35个循环反应；最后72〇C延伸反应2min。[0036]测序结果如图2所示，箭头指出的位置有明显双峰，说明是此样本在外显子3的这个位点有突变，即突变碱基为c.299A>G氨基酸突变为p.Lysl04Glu。[0037]本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制，本发明的试剂盒还可以是CAV1基因第1到第3外显子区、3'UTR和启动子中分别对应的PCR扩增引物组中的一组，每条引物10D;或者是上述引物组中的两组以上的组合。[0038]本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。【主权项】1.用于检测CAVl基因突变的引物组，其特征在于，包括CAVl基因第1至第3外显子区、3'UTR和启动子对应的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组包括：(1)所述启动子的PCR扩增引物组:包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物PFl和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列所示的引物PRl的引物组、SEQIDNO.3所示的核苷酸序列所示的引物PF2的引物组和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物PR2的引物组、SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物PF3的引物组和SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物PR3的引物组、SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的引物PF4和SEQIDNO.8所示的核苷酸序列的引物PR4的引物组；(2)所述Exonl的PCR扩增引物组:包括SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的引物PF5和SEQIDNO.IO所示的核苷酸序列的引物PR5的引物组；(3)所述Exon2的PCR扩增引物组：SEQIDNO.11所示的核苷酸序列的引物PF6和SEQIDNO.12所示的核苷酸序列的引物PR6的引物组；(4)所述Exon3的PCR扩增引物组:包括SEQIDNO.13所示的核苷酸序列的引物PF7和SEQIDNO.14所示的核苷酸序列的引物PR7的引物组；(5)所述3'UTR的PCR扩增引物组:包括SEQIDNO.15所示的核苷酸序列的引物PF8和SEQIDNO.16所示的核苷酸序列的引物PR8的引物组、SEQIDNO.17所示的核苷酸序列的引物PF9和SEQIDNO.18所示的核苷酸序列的引物PR9的引物组、SEQIDNO.19所示的核苷酸序列的引物PFlO和SEQIDNO.20所示的核苷酸序列的引物PRlO的引物组、SEQIDNO.21所示的核苷酸序列的引物PFl1和SEQIDNO.22所示的核苷酸序列的引物PRl1的引物组。2.用于检测CAVl基因突变的引物组，其特征在于，还包括CAVl基因第1至第3外显子区、3'UTR和启动子对应的PCR测序引物，所述的PCR测序引物包括：(6)所述启动子的PCR测序引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物PFl、SEQIDNO.3所示的核苷酸序列所示的引物PF2、SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物PF3和SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的引物PF4;(7)所述Exonl的PCR测序引物组包括SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的引物PF5;(8)所述Exon2的PCR测序引物组包括SEQIDNO.11所示的核苷酸序列的引物PF6;(9)所述Exon3的PCR测序引物组包括SEQIDNO.13所示的核苷酸序列的引物PF7;(10)所述3'UTR的PCR测序引物组包括SEQIDNO.15所示的核苷酸序列的引物PF8、SEQIDNO.17所示的核苷酸序列的引物PF9、SEQIDNO.19所示的核苷酸序列的引物PF10、SEQIDNO.21所示的核苷酸序列的引物PFll。3.权利要求1所述的CAVl基因第1至第10外显子区、3'UTR和启动子对应的PCR扩增引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测CAVl基因是否突变的试剂中的用途。4.包含权利要求1的引物组的用于检测CAVl基因突变的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的CAVl基因第1至第3外显子区、3'UTR和启动子对应的PCR扩增引物组。5.根据权利要求4所述的用于检测CAVl基因突变的试剂盒，其特征在于，还包含权利要求2所述的CAVl基因第1至第3外显子区、3'UTR和启动子对应的PCR测序引物。6.根据权利要求4或5所述的用于检测CAVl基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。【文档编号】C12Q1/68GK105886633SQ201610306413【公开日】2016年8月24日【申请日】2016年5月11日【发明人】卢文菊,张晨婷,王健【申请人】广州医科大学附属第医院,广州医科大学附属第一医院