一种烟曲霉菌的pcr检测的引物及方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟曲霉菌的PCR检测的引物，包括正向引物F2625，引物序列为CGATCGTGGTCTCTTCCGA和反向引物R3438，引物序列为CTGCCGGGTCAGAATCTGT，本发明还公开了一种烟曲霉菌的PCR检测方法，包括CTAB法提取样品真菌菌株的基因组DNA；利用上述引物，以所述基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以便获得真菌菌株的基因组DNA的扩增产物；以及琼脂糖凝胶电泳检测所述基因组DNA的扩增产物，EB染色观察。本发明提供的检测方法能快速、准确、高效检测出待测物中的烟曲霉菌。
【专利说明】
一种烟曲霉菌的PCR检测的引物及方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及一种真菌的PCR检测及方法，更具 体地，涉及一种烟曲霉菌的PCR检测的引物及方法。
【背景技术】
[0002] 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是自然界中广泛存在的腐生真菌，也是重要的 机会致病菌。随着免疫受损人群的增多，系统性曲霉病的90 %是由烟曲霉引起的。同时，烟 曲霉产生的毒素严重污染粮食与饲料制品，危害人和动物的健康，造成重大的经济损失，烟 曲霉已成为临床医学和医学微生物家们关注的热点。
[0003] 烟曲霉的检测技术经历了传统培养鉴别、层析法及色谱法等化学方法检测、免疫 学检测、分子生物学检测等。随着PCR和DNA测序技术的发展，多基因座序列分析得到广泛承 认。目前应用于曲霉的遗传标记主要有rDNA ITSl-5.8S-ITRS2，calmodulin gene(CaM)和 beta-tubulin gene(benA)。
[0004] 然而，目前对于烟曲霉的检测技术的研究仍有待改进。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于 提供了一种能够有效检测出烟曲霉菌的PCR检测的引物和方法，具有快速、准确、高效等特 点。
[0006] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0007] 根据本发明的一个方面，本发明提出了一种烟曲霉菌的PCR检测的引物，所述引物 为：正向引物F2625,引物序列为CGATCGTGGTCTCTTCCGA;反向引物R3438,引物序列为 CTGCCGGGTCAGAATCTGT 〇
[0008] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种烟曲霉菌的PCR检测方法，包括以下步 骤：
[0009] CTAB法提取样品真菌菌株的基因组DNA;以及
[0010] 利用权利要求1所述的引物，以所述基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以便获得 真菌菌株的基因组DNA的扩增产物；以及
[0011]琼脂糖凝胶电泳检测所述基因组DNA的扩增产物，EB染色观察。
[0012] 进一步地，所述PCR扩增的退火温度为50摄氏度至55摄氏度。
[0013] 进一步地，所述基因组DNA的扩增产物的长度为814bp。
[0014] 本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
[0015] 本发明提供的引物和检测方法包括烟曲霉在内的20个分类单元34个菌株，结果表 明，只有烟曲霉扩增出814bp的单一扩增产物，表现为阳性，其他18个供试的曲霉种未能得 到扩增产物，均表现为阴性。说明本发明的引物和方法具有良好的特异性。
[0016] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中 变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0017] 图1为根据本发明的一个实施例的真菌通用引物ITS1/ITS4扩增7种曲霉的PCR扩 增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0018] 图2为根据本发明的一个实施例的引物F2625/R3438扩增7种曲霉的PCR扩增产物 的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0019]图3为根据本发明的一个实施例的引物F2625/R3438扩增34个曲霉的PCR扩增产物 的琼脂糖凝胶电泳结果。
【具体实施方式】
[0020] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅 用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0021] 1、设计特异性扩增烟曲霉的引物对
[0022] 通过比较曲霉属真菌RPB2基因序列，设计特异性引物10个见表1，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。
[0023] 表1基于RPB2基因设计的引物编号、序列及参数
[0026] 2、待测曲霉菌株的收集或分离及培养
[0027] 待测曲霉菌样品来源于中国科学院微生物研究所真菌学国家实验室、北京大学真 菌和真菌病研究中心及分离物(见表2)，接种至PDA培养基上，置培养箱28 °C培养。
[0028] 表2.供试34个曲霉菌株或分离物的编号及其来源
[0029]
[0031] 3、DNA模板制备
[0032] 挑取直径5mm的待测曲霉菌株菌丝块接种至100ml PD液体培养基中，室温下摇床 培养(250rpm)2 - 4周，收集菌体并用无菌生理盐水冲洗数次，灭菌滤纸吸干。取O.lg菌体在 液氮中迅速研磨成粉末，用2 % (w/v) CTAB缓冲液抽提菌丝DNA，0.8 %琼脂糖凝胶检测DNA样 品浓度，置-20 °C备用。
[0033] 4、特异性PCR检测方法的建立
[0034] PCR检测20μ1 反应体系包括：超纯水 10yl，2XEcoTaq PCR Super Mix(+dye)8yl (TaqDNA聚合酶0.05UAil，4mM MgC12,0.4mM dNTP，Beijing TransGen Biotech·，北京），引 物F2625和R3438(ΙΟμΜ)各0.5μ1，模板DNA ΙμL。
[0035] PCR 反应条件为：94°C 预变性 3min;94°C 变性 3〇8,50°(：(或55°(：)退火3〇8,72°(：延伸 45 8,30个循环；72°(：延伸7111丨11。？01?反应在？1'(：-1501'116^11。。7(3 161(]\^1^8631。11， Masachusetts，USA)进行。
[0036] 5、结果判定
[0037] 发明人选取供试34个曲霉菌株中提取的7种曲霉的DNA样品，进行了 PCR产物琼脂 糖凝胶电泳检测，目的是检验7种曲霉的DNA样品质量。如图1所示，图1为真菌通用引物 ITS1/ITS4扩增7种曲霉的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中1至9点样孔依次是DNA Marker、烟曲霉、棒曲霉、米曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、费希新萨托菌、以双蒸水为空 白模板对照。
[0038]图2为特异引物F2625/R3438扩增7种曲霉的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。图 中1至9点样孔依次是DNA Marker、烟曲霉、棒曲霉、米曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、费希 新萨托菌、以双蒸水为空白模板对照。验证了本发明的引物具有良好的鉴别作用，仅烟曲霉 能扩增出预计的产物。
[0039]供试的34个曲霉菌株隶属20种，经引物F2625和R3438扩增、2 %琼脂糖凝胶电泳检 测，仅A.fumigatus和六.116〇6111口1:;[(3118的11个菌株分别扩增出约80(^口大小的单一产物外， 其它18种23个供试菌株未能得到扩增产物。结果同时暗示，不支持A . fumigatus和 A.neoellipticus在种水平上的差异。
[0040]图 3 中 1 至25点样孔依次是 1 · DNA Marker，2 · 14346Aspergi 1 lus awamori， 3·13907A·clavatus，4·14339A.creber，5·3·14527A·flavus，6-14·A.fumigatus 2810、 9793、13945、14019、14023、14029、14327、NRRL163T、NRRL6113，15.CYHlA.lentulus，16-17.A.neollipticusNRRL5109T、9732，18-19.A.nigerl3527、14348,20-21.A.paraciticus 3.13640,14039,22.13912A.sydowii,23.14347A.tubingensis, 24.13899A.ustus,25.13902Emericella nidulans [0041 ] 6、序列测定验证
[0042] 纯化F2625和R3438扩增产物片段送生工生物工程（上海）股份有限公司，ABI 3730XL测序仪双向测序，序列结果与NCBI公布的烟曲霉RPB2基因序列完全一致。
[0043] 引物F2625/R3438扩增烟曲霉得到的序列为814bp:
[0044]
[0045]在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0046]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种烟曲霉菌的PCR检测的引物，其特征在于，所述引物为： 正向引物F2625,引物序列为CGATCGTGGTCTCTTCCGA; 反向引物R3438,引物序列为CTGCCGGGTCAGAATCTGT。2. -种烟曲霉菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤： CTAB法提取样品真菌菌株的基因组DNA;以及 利用权利要求1所述的引物，以所述基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以便获得真菌 菌株的基因组DNA的扩增产物；以及 琼脂糖凝胶电泳检测所述基因组DNA的扩增产物，EB染色观察。3. 根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的退火温度为50摄氏 度至55摄氏度。4. 根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述基因组DNA的扩增产物的长度 为814bp。
【文档编号】C12N15/11GK105886643SQ201610355146
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】余知和, 周建芬, 曾昭清, 余芸, 程云方
【申请人】长江大学