鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列、引物和试剂盒及方法

文档序号:10528858阅读:449来源:国知局
鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列、引物和试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及鉴别金针菇的技术领域,具体涉及鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列、引物和试剂盒及方法。鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列,基本上包含SEQ ID NO.1或其一部分,或突变率不大于5%的SEQ ID NO.1或其一部分。本发明提供一种快速鉴别芬娜金针菇的特征氨基酸序列、引物、试剂盒以及方法,特异性高,方法简单,对芬娜金针菇的商业化及利用具有重要意义。CCTCC NO: M 201617920160407
【专利说明】
鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列、引物和试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明涉及鉴别金针菇的技术领域,具体涉及鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序 列、引物和试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 金针燕(Flammulina velutipes)是目前人工广泛栽培的食用菌之一,也是一种经 济价值很高的食药用真菌。金针菇含有多种营养成分,其中人体生长所需的8种氨基酸含量 较高,尤以赖氨酸和精氨酸含量特别丰富,能促进儿童的健康成长和智力发育,因此常被称 为"增智菇"。金针菇含有朴菇素,具有显著的抗癌功能,经常食用金针菇还可以预防高血 压,治疗肝炎及肠胃溃疡等疾病。
[0003] DNA是生物遗传信息的载体,每个生物物种乃至个体具有独特的特征性核苷酸序 列,且具有一定的稳定性,基本不会受环境或培养等条件的影响而改变,是该生物物种或个 体区别于其它生物物种或个体的重要标志,因而是用来鉴定物种或个体的可靠依据。
[0004] 随着分子生物学技术的快速发展以及计算机辅助分析技术的诞生,真菌的快速检 测已成为可能。目前常用的检测方法主要有随机扩增多态性(RAPD)、限制性片段长度多态 性分析(RFLP)、rDNA序列分析和聚合酶链式反应(PCR)检测等。
[0005] 现有技术中没有芬娜金针菇的鉴别方法、特征核苷酸序列、引物以及试剂盒,因 此,存在难以特异性并且讯速地检测芬娜金针菇的问题。

【发明内容】

[0006] 第一方面,本发明提供一种鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列,所述特征核苷酸 序列基本上包含SEQ ID NO. 1或其一部分,或突变率不大于5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。
[0007] 进一步地,鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列,所述芬娜金针菇为芬娜金针菇 Flammulina fennae,保藏编号为CCTCC Μ 2016179。
[0008] 第二方面,本发明提供一种鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物,所述引物筛选自 上述第一方面提供的鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列,
[0009] 进一步地,一种鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物,所述引物选自SEQ ID Ν0.2、 SEQ ID N0.4中的一个,及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一个,优选为SEQ ID N0.2、及SEQ ID Ν0·5〇
[0010] 进一步地,鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物,所述芬娜金针菇为芬娜金针菇 Flammulina fennae,保藏编号为CCTCC Μ 2016179。
[0011] 第三方面,本发明提供一种鉴别芬娜金针菇的试剂盒,包含上述第二方面提供的 鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物。
[0012] 进一步地,一种鉴别芬娜金针菇的试剂盒,还包括聚合酶链式反应试剂、和/或基 因组提取试剂、和/或说明书。
[0013] 进一步地,一种鉴别芬娜金针燕的试剂盒,还包括DNA Marker、和/或凝胶电泳试 剂。
[0014] 进一步地,鉴别芬娜金针菇的试剂盒,所述芬娜金针菇为芬娜金针菇Flammulina fennae,保藏编号为CCTCC Μ 2016179。
[0015] 第四方面,本发明提供一种鉴别芬娜金针菇的方法,方法包括:对样品的基因组进 行PCR扩增,得到约350bp-550bp条带的样品为芬娜金针菇,优选约420-520bp条带的样品为 芬娜金针菇,进一步优选约460-500bp条带的样品为芬娜金针菇,或更优选为上述第一方面 提供的特征核苷酸序列的样品为芬娜金针菇。
[0016] 进一步地,一种鉴别芬娜金针菇的方法,方法包括:采用上述本发明的第二方面提 供的的特征核苷酸引物对样品的基因组进行PCR扩增,得到约350bp-550bp条带的样品为芬 娜金针菇,优选约420-520bp条带的样品为芬娜金针菇,进一步优选约460-500bp条带的样 品为芬娜金针菇,或更优选为上述第一方面提供的特征核苷酸序列的样品为芬娜金针菇。
[0017] 更进一步地,在一个优选的实施例中,一种鉴别芬娜金针菇的方法,所述PCR扩增 条件包括:所述PCR扩增条件包括:94 °C 5min; (94°C 30s,56 °C (每个循环降1°C ) 30s,72 °C 4〇8)6个循环;(941€3〇8,5〇1€3〇8,721€4〇8)32个循环 ;721€511^11。
[0018] 更进一步地,一种鉴别芬娜金针菇的方法,基因组为基因组总DNA。
[0019] 更进一步地,一种鉴别芬娜金针菇的方法,基因组包括基因组总DNA的提取来源不 限,优选提取自菌丝体或子实体中。
[0020] 进一步地,鉴别芬娜金针菇的方法,所述芬娜金针菇为芬娜金针菇Flammulina fennae,保藏编号为CCTCC Μ 2016179。
[0021 ]芬娜金针燕(Flammulina fennae)与普通金针燕相比,具有栽培性状佳、有效成分 高、菌柄底部不粘连,不形成褐变、菇质脆嫩鲜美等优点,具有较好的开发利用前景,所以快 速且准确地鉴别芬娜金针菇子实体及菌丝体是其商业化生产的重要技术保障,对其开发利 用具有重要的意义。
[0022] 本发明提供一种快速鉴别芬娜金针菇的特征氨基酸序列、引物、试剂盒以及方法, 特异性高,方法简单,对芬娜金针菇的商业化及利用具有重要意义。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明实施例2中获得的芬娜金针菇的特征核苷酸序列。
[0024] 图2为本发明实施例3中鉴别方法得到的扩增产物的凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0025]以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0026]芬娜金针菇及其栽培方法
[0027] 芬娜金针燕(Flammul ina f ennae),属担子菌门(Basidiomycota),伞菌目 (Agaricaies),口蘑科(Trichofomataceae),小火焰菌属(Flammulina) 〇
[0028] 在本发明优选的一些实施例中,包括芬娜金针菇的特征核苷酸序列、特征核苷酸 引物、试剂盒以及鉴别方法的实施例中,提供一种芬娜金针菇新菌种,分离自蒙古乌素图国 家森林公园的腐木上,经形态学及分子生物学鉴定为芬娜金针燕Flammulina fennae新菌 种,通过进行组织分离得到原始菌株,命名为芬娜金针燕Flammulina fennae HMGIM- M140658,已于2016年4月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,湖北省武汉市洪 山区八一路,武汉大学),保藏号为:CCTCC Μ 2016179。
[0029] 对本发明的芬娜金针菇新菌种CCTCC Μ 2016179的子实体DNA基因组进行提取, PCR扩增进行鉴定,发现与芬娜金针燕(Flammulina fennae)相似性高达95%以上,经过形 态学鉴定,鉴定结果为芬娜金针燕(?]^1111]1111;[1^€6111^6)的新菌种。
[0030] 本发明的芬娜金针菇CCTCC Μ 2016179的外观形态学特征为:菌盖直径1-1.8cm, 凸镜形至平展形,肉质,中央浅褐色,近边缘白色,甚粘,光滑无毛,边缘内卷。菌肉白带黄 色,薄。菌褶白带黄色,盖缘处每厘米13-14片,不等长,直生,褶缘平滑至波状。菌柄中生,圆 柱形,长2-5cm,近柄顶粗l-2mm,空心,白色,被粉末状颗粒或纤毛,具假根。孢子椭圆形,6_ 8.5*3.5-4.5μηι,光滑,无色至微黄色,非淀粉质。担子棒形,26-34*6.2-6.6μηι,4个孢子。未 见典型的囊状体。菌褶菌髓平等。菌盖外皮层为粘皮层,有锁状联合。
[0031] 对芬娜金针菇进行栽培的方法,通常包括:可选地包括组织分离菌种后制作母种, 制作原种,制作生产种,栽培培养,得到成熟的子实体。
[0032] 上述栽培方法步骤在菌种栽培方法中是广泛应用的方法,为本领域技术人员所熟 知。
[0033]本发明进一步对芬娜金针菇CCTCC Μ 2016179的栽培方法进行优化,得到一种产 量较高,整齐度较好,生物转化率较高的栽培方法。
[0034]在一个优选的实施例中,芬娜金针菇CCTCC Μ 2016179的栽培方法包括:
[0035] (1)将芬娜金针菇新菌种CCTCC Μ 2016179子实体接种至分离培养基25°C±1°C暗 培养至菌丝基本长满培养基得到组织分离的菌种,将组织分离的菌种接种至母种培养基25 °C ± 1°C暗培养至菌丝基本长满斜面得到母种;
[0036]其中,分离母种培养基例如可以为:按照质量百分比计包括马铃薯18-20%、葡萄 糖1.5-2%、琼脂1.8-2%、磷酸二氢钾0.15-0.3%、硫酸镁0.05-0.15%、维生素 B1微量,其 余为水;
[0037]其中,母种培养基例如可以为:按照质量百分比计包括马铃薯18-20%、葡萄糖 1.5-2 %、琼脂1.8-2 %、磷酸二氢钾0.15-0.3 %、硫酸镁0.05-0.15 %、维生素 B1微量,其余 为水;
[0038] (2)将母种埋入至原种料中25°C ±1°C暗培养至菌丝基本覆满料得到原种;
[0039]其中,原种料例如可以为:按照质量百分比计包括38-42%棉籽壳、35-40%木肩、 18-20 %麸皮、1-2 %碳酸钙;
[0040] (3)将原种埋入生产料中25°C ±1°C暗培养至菌丝基本覆满料得到生产种;
[00411其中,生产种料例如可以为:按照质量百分比包括38-42%棉籽壳、35-40%木肩、 18-20 %麸皮、1-2 %碳酸钙;
[0042] (4)将生产种接种至栽培料袋中,栽培培养至子实体成熟;
[0043]其中,栽培料例如可以为:按质量百分比计包括48-52%棉籽壳、28-32%木肩、16-20%麸皮、1-2%糖、1-2%碳酸钙。
[0044]其中,栽培培养例如包括:将生产种接种至栽培料袋,在25°C ± 1°C、相对湿度60-70 %避光培养,待菌丝长满栽培料后,25 ± 1°C、相对湿度95 %避光培养3-4天,在避光培养 过程中,在菌面出现水滴后,优选更换新风,包括每天2次,每次1小时,避光培养后,调节温 度5-6°C、相对湿度85-90%条件下,每天光照2小时,维持3-4天后,控制温度16-20°C、相对 湿度85-90 %、二氧化碳浓度小于5 %,培养至子实体成熟,可以对子实体进行采摘,在培养 至子实体成熟过程中,其中一种方法可以观察菌盖开始平展,则可能说明子实体已趋于成 熟,此时就可以开始采收,得到芬娜金针菇新菌种CCTCC Μ 2016179的子实体。
[0045] 上述栽培方法的总体生物转化率约在70%以上,进一步地,约在80%以上。
[0046]本发明示例性地给出了的芬娜金针菇CCTCC Μ 2016179,以及优选的芬娜金针菇 的栽培方法,该栽培方法可以用于栽培芬娜金针菇CCTCC Μ 2016179,也可以用于栽培芬娜 金针菇的其它菌种,应该理解,其它优化的栽培方法,或者本领域公知的栽培方法,只要能 栽培得到芬娜金针菇,同样适用于选择用来本发明中芬娜金针菇的获得。
[0047] 基因组提取
[0048] 芬娜金针菇的基因组进行提取的方法,采用通常的真菌基因组提取方法即可,提 取得到的基因组总DNA用于PCR扩增的模板,较高质量的基因组总DNA可以使得PCR扩增变得 更加有效率和容易完成,目前,常见的真菌基因组的提取方法主要包括例如:酶解法、研磨 法、冻融法、微波法、十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)、十二烷基苯磺酸钠(SDS)法、试剂 盒方法等。这些方法通常都可以提出较高质量的基因组DNA,能够满足后续的如PCR反应的 基因操作需求,在本发明中用于芬娜金针菇的分子鉴别或者用于芬娜金针菇的特征核苷酸 序列的得到。
[0049] 芬娜金针菇的基因组提取的原料,在本发明中,例如:菌丝体,或者例如:子实体。 目前,真菌基因组提取的试剂盒已经非常普通,效果也非常突出,在本发明的实施例中亦有 选用。当然,本发明的基因组提取并不需要限定某种特定的方法,只要能得到满足后续基因 操作需求的基因组DNA。
[0050] 在本发明提供的一些优选实施例中,将芬娜金针菇接种于普通roA培养基上,25°C 暗培养7-10天,收集菌丝体,研磨成粉后采用真菌基因组抽提试剂盒,进行基因组总DNA的 提取。
[0051 ] 引物
[0052]本发明提供一种鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物,所述引物筛选自任一芬娜金 针菇的特征核苷酸序列或其部分,例如筛选自包含SEQ ID NO. 1或其一部分,或突变率不大 于5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。
[0053] 在本发明的一些优选的实施例中,筛选自任一芬娜金针菇的特征核苷酸序列或其 部分的鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物包括SEQ ID NO.2、SEQ ID N0.4中的一个,及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一个。
[0054] 在本发明的一些优选的实施例中,筛选自任一芬娜金针菇的特征核苷酸序列或其 部分的鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物为SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.5,经实验证实,其 用于鉴别的特异性好。
[0055] ITS序列
[0056]本发明提供一种鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列,所述特征核苷酸序列基本上 包含SEQ ID NO. 1(如图1所示)或其一部分,或突变率不大于5%或突变率不大于1%或突变 率不大于0.5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。应该理解,本发明所提供的鉴别芬娜金针菇的 特征核苷酸序列,还包括所提供序列的互补序列,或互补序列的一部分。
[0057] 本发明提供的上述特征核苷酸序列为芬娜金针菇的内转录间隔区(ITS)的DNA。
[0058] 真菌的ITS序列是核糖体DNA上的一个非编码区域,受外界环境因素的影响较小, 进化速度快,因而可以提供较为丰富的信息位点。利用真菌ITS序列在属、种水平上的差异, 设计特异性引物,进行真菌物种的鉴定、检测。
[0059] 术语"核苷酸序列"可与"核酸"或"多核苷酸"交换使用,指的是核苷酸的杂聚物或 这些核苷酸组成的序列。这些术语同样可以指DNA或者RNA,可以是单链或双链,并且可以相 对于cDNA而言代表正义链或负义链。
[0060] 在本发明的核苷酸序列中,碱基包括,A是腺嘌呤,C是胞嘧啶,T是胸腺嘧啶,G是鸟 嘌呤,可以预期,若多核苷酸可以是RNA,那么本发明中所提供的序列中的T(胸腺嘧啶)以U (尿嘧啶)来代替。
[0061] 本发明中芬娜金针菇特征核苷酸序列的获得,可以采用例如以芬娜金针菇基因组 为模板,以通用引物对ITS1(SEQ ID N0.6):5'-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3'和ITS4(SEQ ID NO. 7): 5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '为引物,进行PCR扩增得到。PCR扩增的体系以及扩增 的具体条件可以进行优化,包括在示范性实施例中所提供。特别是PCR扩增条件的筛选对于 特征核苷酸序列的得到具有重要的影响,提供一种优选筛选得到的ITS序列的PCR扩增条 件,包括 :941€5111丨11;94°(:1111丨11,55-581€3〇8-458,72°(:1111丨11,共30个循环 ;721€8111丨11。该扩增 条件中的循环数会影响得到的ITS的量,也许可以根据实际情况进行少量的增加或者减少 循环。PCR扩增得到的样品经测序后得到特征核苷酸序列。测序的方法是本领域的通用方 法,本发明中并不限定。应该理解和知晓,PCR扩增和测序的过程中,核苷酸序列中的碱基有 千分之的到万分之的突变或替换的概率,因此,经测序得到芬娜金针菇特征核苷酸序列应 该允许和原本的芬娜金针菇的基因组中该段核苷酸序列存在一定的突变率,例如不大于 5%,例如不大于1%,例如不大于0.5%,但这并不会影响该特征核苷酸序列在鉴别方法、鉴 另IJ引物和鉴别试剂盒等中的使用。
[0062] 引物设计
[0063] 引物的设计从本发明提供的上述芬娜金针菇的特征核苷酸序列或其部分进行设 计,每一个引物,大约30bp以内,或大约25bp以内,或大约20bp以内,通过多序列比对,在 Genbank中与亲缘关系相近的物种,例如柳生金针菇,例如白色金针菇,例如黄色金针菇等 的ITS的DNA序列进行比较,确定芬娜金针菇的ITS的特征核苷酸序列的特异位点,得到合适 的引物。
[0064] 在引物设计时,还可以利用现有的一些引物设计软件,例如Primer-BLAST,进行引 物的设计,设计得到的引物还可以进一步在Genbank中进行引物特异性验证,进一步筛选出 特异性好的引物。
[0065]在本发明提供一些优选的实施例中,一种设计筛选芬娜金针菇引物的方法包括, 将测序得到的芬娜金针菇ITS序列在Genbank中与近缘种的ITS序列进行比较分析,确定芬 娜金针^ITS序列的特异位点,利用Primer-Blast软件设计引物,并且在Genbank中进行引 物特异性验证,筛选得到可用于鉴别芬娜金针菇的特异性引物。
[0066]本发明的鉴别芬娜金针菇的引物例如筛选自包含SEQ ID NO. 1或其一部分,或突 变率不大于5%或突变率不大于1%或突变率不大于0.5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。 [0067]在本发明的一些优选的实施例中,筛选自任一芬娜金针菇的特征核苷酸序列或其 部分的鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4中的一个,及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一个。
[0068] 在本发明的一些优选的实施例中,筛选自任一芬娜金针菇的特征核苷酸序列或其 部分的鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物为SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.5,经实验证实,其 特异性好。
[0069] 试剂盒
[0070] 本发明中所述的"试剂盒"为了开展本发明的方法的试剂盒,更加具体而言,是鉴 别芬娜金针菇的试剂组合。"试剂盒"可以更加方便地使用,也可以商业化。
[0071] 更加具体而言,本发明的试剂盒优选包含鉴别芬娜金针菇的引物,例如上述的选 自SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4中的一个,及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一个组成的引物 对,或者更具体地例如SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.5的特异性引物对。
[0072] 本发明的试剂盒,除包括上述鉴别芬娜金针菇的引物以外,其他任意在鉴别芬娜 金针菇的过程中需要的任意试剂或者辅助材料都可以包括在试剂盒中。
[0073] 在一些鉴别芬娜金针菇的优选试剂盒中,还可以包括聚合酶链式反应试剂,或者 还可以进一步包括基因组提取试剂,或者还可以包括DNA Marker,或者还可以包括凝胶电 泳试剂,或者还可以包括任意的操作说明书,或者上述这些试剂的任意组合。
[0074] 鉴别方法(PCR)
[0075] 本发明提供的鉴别芬娜金针菇的方法,采用PCR扩增方法进行鉴别,进行特异性条 带扩增,确认有无扩增产物,得到扩增产物或特异性扩增产物的样品为芬娜金针菇,进行特 异性条带扩增时,采用特异引物对,例如本发明提供的特征核苷酸引物。
[0076] -种鉴别芬娜金针菇的方法,包括:采用上述本发明提供的特征核苷酸引物对样 品的基因组进行PCR扩增,得到约350-550bp条带的样品为芬娜金针菇,优选约420-520bp条 带的样品为芬娜金针燕,进一步优选约460-500bp条带的样品为芬娜金针燕,例如约480bp 左右条带的样品为芬娜金针菇,或优选为芬娜金针菇的特征核苷酸序列或其部分的样品为 芬娜金针菇。
[0077] 鉴别方法对于扩增产物的确认,可以采用测序,或者电泳例如琼脂糖凝胶电泳的 方法,也可以采用其他常规的扩增产物的确认方法,只要能满足确认该扩增产物的大小即 可。
[0078]在一些优选的实施例中,一种鉴别芬娜金针菇的方法,每50μ1 PCR扩增的体系包 括:DNA模板lng_500ng、每个引物0· 1-1 Opmol、DNA聚合酶Taq polymerase 5units/yl、dNTP (dATP,dGTP,dTTP 和 dCTP) 2mM/每 dNTP,水等。
[0079] 在一个优选的实施例中,一种鉴别芬娜金针菇的方法,以特征引物1( SEQ ID N0.2)和特征引物4(SEQIDN0.5)作为引物,50μlPCR扩增的体系为:DNA模板(50ng/ul)2μ 1,单个引物(l〇ymol/L)2yl,2XTaq PCR Master mix(天根生化科技(北京)有限公司或生 工生物工程(上海)股份有限公司等)25μ1,双蒸水19μ1。
[0080] 鉴别芬娜金针菇的方法,除了引物的特异性对于鉴别的特异性具有重要的影响 外,鉴别的PCR扩增条件也对鉴别的特异性具有重要影响,本发明对PCR扩增条件进行大量 筛选,得到一个特异性好的PCR扩增优选条件如下。
[0081] 更进一步地,一种鉴别芬娜金针菇的方法,所述PCR扩增条件包括:所述PCR扩增条 件包括:941€5111丨11;(941€3〇8,56°(:(每个循环降1°(:)3〇8,72 1€4〇8)6个循环;(941€3〇8,5〇1€ 3〇8,721€4〇8)32个循环;721€511^11。
[0082] 在一个优选的实施例中,鉴别芬娜金针菇的方法包括:以芬娜金针菇基因组为模 板,以特征引物l(SEQIDN0.2)和特征引物4(SEQIDN0.5)作为引物,反应体系溶液为50μ 1总体积:芬娜金针菇基因组0财(50叫/111)2111,每个引物(1(^111〇1/1^)2以1,2\了 &9?〇? Master Mix(天根生化科技(北京)有限公司或生工生物工程(上海)股份有限公司等)25μ1, ddH20 19μ1。将反应体系溶液第一步骤94°C变性5min后;第二步骤是:溶液在94°C变性30 秒,56 °C退火30s,72 °C延长40秒,在第二步骤条件下循环6次,并且每循环一次第二步骤下 的退火温度降低1°C,再第三步骤是:溶液在94°C变性30秒,50°C退火30s,72°C延长40秒,在 第三步骤条件下循环32次;最后进一步72°C延长5min,确保延长结束,将得到的扩增产物进 行回收后测序或者进行琼脂糖凝胶电泳,得到大小约460-500bp的扩增产物的样品就鉴别 为芬娜金针菇。
[0083] 本发明的鉴别方法,或鉴别试剂盒,可以用于鉴别芬娜金针菇、其部分、其菌丝体、 其子实体,或其后代的这些都可以使用本发明的方法进行鉴别。
[0084] 实施例
[0085]实施例1:芬娜金针菇新菌种CCTCC Μ 2016179的栽培方法及得到的子实体及菌丝 体
[0086] 一、栽培方法如下:
[0087] 1、培养基制作:
[0088] (1)分离培养基为:按照质量百分比计马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、蛋白胨 0.5%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素 Β1微量,其余为水;
[0089] (2)母种培养基为:按照质量百分比计马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢 钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素 Β1微量,其余为水;
[0090] (3)原种料为:按照质量百分比计40 %棉籽壳、38 %木肩、20 %麸皮、2 %碳酸钙;
[0091 ]原种料袋的制备过程为:称取棉籽壳,经水泡湿过夜,按比例混入木肩、麸皮、碳酸 钙,装入13cm*25cm耐高温的透明聚丙稀菌种袋中,折合每袋装干料250-300g,装好料后在 袋口套上塑料环,扣上配套的盖子,在0.147MPa大气压、128 °C高温高压湿热灭菌90min,冷 却备用,得到可以直接使用的原种料袋;
[0092] (4)生产种料为:按质量百分比计40%棉籽壳、38%木肩、20%麸皮、2%碳酸钙;
[0093]生产种料袋的制作过程基本与原种料袋相同,但所用菌种袋为15cm*30cm耐高温 的透明聚丙稀菌种袋。折合每袋装干料350-400g;
[0094] (5)栽培料为:按质量百分比计50 %棉籽壳、30 %木肩、18 %麸皮、1 %糖、1 %碳酸 钙;
[0095] 栽培料袋的制作过程基本与原种料袋相同,但配方中在混入木肩、麸皮、碳酸钙时 按比例一并混入糖,所用菌种袋采用15cm*30cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋,折合每袋装干 料300-350g;
[0096] 2、组织分离菌种:将芬娜金针菇新菌种CCTCC Μ 2016179子实体接种至分离培养 基25°C ± 1°C暗培养至菌丝基本长满培养基得到组织分离的菌种;
[0097] 3、将组织分离的菌种接种至母种培养基,25°C 土 1°C暗培养至菌丝基本长满斜面 得到母种,母种长满的时间约需要10天至15天;
[0098] 4、将母种接种至原种料袋中,确保母种埋入原种料中,25°C ± 1°C暗培养至菌丝基 本吃满料得到原种,该过程约需要30天左右;
[0099] 5、将原种接种至生产料袋中,确保原种埋入生产料中,25°C±1°C暗培养至菌丝基 本吃满料得到生产种,该过程约需要30天左右;
[0100] 6、将生产种接种至栽培料袋中,在25°C ± 1°C、相对湿度60-70 %避光培养,待菌丝 长满栽培料后(该过程约需要30天左右),打开栽培袋盖子,将栽培袋竖排放置,袋与袋之间 适当留有空隙,25 ± 1°C、相对湿度95%避光培养,待菌面出现水滴后,每天更换新风2次,每 次1小时,3-4天后,调节温度5-6°C、相对湿度85-90%条件下,每天光照共2小时,分早、中、 晚分别进行,维持3-4天后,控制温度18°C、相对湿度85-90%、二氧化碳浓度小于5 %,培养, 约经1-2天原基即可长出,待幼菇长至3-4cm后,将袋口竖起,直至菌柄长至12cm以上,菌盖 开始平展,说明子实体已趋成熟,即可采收,从长出幼菇到子实体成熟约需5-7天。
[0101] 实施例2:芬娜金针菇的特征核苷酸序列以及特征核苷酸引物的获得
[0102] 1、芬娜金针菇基因组DNA模板的提取
[0103]芬娜金针菇新菌种CCTCC Μ 2016179接种于普通PDA培养基(马铃薯200g,葡萄糖 20g,琼脂20g,水1000ml)上,25°C暗培养7-10天,收集菌丝体,研磨成粉后采用Ezup柱式真 菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)进行总DNA提取,获得芬娜金针菇的基因组总DNA。
[0104] 2、芬娜金针菇的rDNA ITS序列扩增及测序
[0105] 以芬娜金针菇基因组总D N A为模板,以通用引物对I T S 1 : 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ' 和 ITS4:5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ' 为引物,反应体系为 50μ1 总体积:2XTaq PCR Master mix(生工生物工程(上海)股份有限公司)25yl,DNA模板 (50ng/ul) lul,ddH20 20μ1,每个引物(10ymol/L)2μ1 JCR反应条件为:94°C5min; 94°C lmin,55°C45s
[0106] PCR扩增得到,ITS-PCR产物,将ITS-PCR产物进行条带回收,测序,获得序列长 764bp,如SEQ ID N0.1 或图 1 所示。
[0107] 3、基于ITS序列的特异性引物对的设计及获得
[0108] 将获得的芬娜金针菇的ITS序列(SEQ ID N0.1序列)与GenBank数据库中芬娜金针 菇及其近缘种的ITS序列进行比较分析,确定芬娜金针菇ITS序列上的特异位点,利用NCBI 中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)设计引物并同时在GenBank数据库中进行引 物特异性验证,最终筛选出芬娜金针菇特异性引物共四个,如表1所示。
[0109] 表1:筛选得到的芬娜金针菇特异性引物
[0111]将得到的引物对在芬娜金针菇和近缘种的几种金针菇上进行PCR扩增验证,其中, 特征引物1、特征引物2作为上游引物,特征引物3、特征引物4作为下游引物,两两组合,确认 获得的4个引物组成的引物对可以实现芬娜金针菇的特异性鉴别。
[0112]实施例3:芬娜金针菇的鉴别方法 [0113](一)实验样品:
[0114] 实验样品分别为市场上购买或野外采集到的金针菇菌种,共12个菌种,包括:样品 1金针菇E141398;样品2柳生金针菇E141531;样品3柳生金针菇W141696;样品4柳生金针菇 W141699;样品5金针菇S140014;样品6芬娜金针菇新菌种CCTCC Μ 2016179;样品7柳生金针 菇Ε141870;样品8柳生金针菇Ν140864;样品9金针菇Ν140982;样品10柳生金针菇 (Flammulina rossica)N140925;样品 11柳生金针燕附40951;样品 12金针^(Flammulina velutipes)S140271。
[0115] (二)鉴别方法:
[0116] 1、基因组DNA模板的提取
[0117]分别收集各样品的菌丝体,研磨成粉后采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒 (上海生工)进行总DNA提取,获得各样品的基因组总DNA。
[0118] 2、特异性条带的扩增
[0119] 以各样品的基因组DNA作为模版,以特征引物1(SEQ ID N0.2)和特征引物4(SEQ IDN0.5)作为引物,反应体系分别为50μl总体积:2XTaqPCRMastermix(天根生化科技 (北京)有限公司、生工生物工程(上海)股份有限公司)25yl,DNA模板(50ng/ul)lul,ddH 20 20μ 1,引物(1 Ομπιο 1 /L) 2μ 1 X 2。PCR反应条件:
[0121] 将扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,其结果如图2所示。
[0122] 图2按照样品1-12的顺序分别编号为1-12泳道,13泳道为DNA Marker D,编号为Μ, 从下往上长度分别代表l〇〇bp,250bp,500bp,750bp,lOOObp,2000bp。
[0123] 由图2可以看出,采用特征引物1(SEQ ID NO.2)和特征引物4(SEQ ID NO.5)时,只 有第6泳道(样品6)能够扩增出大小为接近500bp的特异性片段,而其他样品均没有扩增到 任何片段,表明样品6为芬娜金针菇新菌种CCTCC Μ 2016179,结论准确,特异性高。
[0124] 所以本发明中采用特征引物1(SEQ ID Ν0.2)和特征引物4(SEQ ID Ν0.5)进行芬 娜金针菇的鉴别具有极高的特异性,因此可以用于芬娜金针菇菌丝体、子实体及其相关制 品的快速鉴定。
[0125] 以上所述,仅为本发明的较佳的具体实施例,但本发明的保护范围并不局限于此, 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其 构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列,其特征在于,所述特征核苷酸序列基本上包含 SEQ ID NO. 1或其一部分,或突变率不大于5%的SEQ ID NO. 1或其一部分。2. 鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物,其特征在于,所述引物筛选自权利要求1所述的 特征核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸引物,其特征在于,所述引物选 自SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4中的一个,及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5中的一个,优选为SEQ ID NO.2、及SEQ ID NO.5。4. 鉴别芬娜金针菇的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含所述权利要求2或3的引物。5. 根据权利要求4所述的鉴别芬娜金针菇的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括聚 合酶链式反应试剂、和/或基因组提取试剂、和/或说明书、和/或DNA Marker、和/或凝胶电 泳试剂。6. 鉴别芬娜金针菇的方法,其特征在于,所述方法包括:对样品的基因组进行PCR扩增, 得到约350bp-550bp条带的样品为芬娜金针菇,优选约420-520bp条带的样品为芬娜金针 菇,进一步优选约460-500bp条带的样品为芬娜金针菇,或更优选为权利要求1所述的特征 核苷酸序列的样品为芬娜金针菇。7. 根据权利要求6所述的鉴别芬娜金针菇的方法,其特征在于,所述方法包括:采用权 利要求2-4中任一权利要求所述的特征核苷酸引物对样品的基因组进行PCR扩增,得到约 350bp-550bp条带的样品为芬娜金针菇,优选为约420bp-520bp条带的样品为芬娜金针菇, 进一步优选约460-500bp条带的样品为芬娜金针菇,或更优选为权利要求1所述的特征核苷 酸序列的样品为芬娜金针菇。8. 根据权利要求7所述的鉴别芬娜金针菇的方法,其特征在于,所述PCR扩增条件包括: 941€5111丨11 ;(941€3〇8,56°(:(每个循环降1°(:)3〇8,721€4〇8)6个循环 ;(941€3〇8,5〇1€3〇8,72 °〇4〇8)32个循环 ;721€511^11。9. 根据权利要求6-8中任一权利要求所述的鉴别芬娜金针菇的方法,其特征在于,所述 基因组为基因组总DNA;和/或所述基因组中DNA提取自菌丝体。10. 根据权利要求1所述的鉴别芬娜金针菇的特征核苷酸序列,其特征在于,所述芬娜 金针燕为芬娜金针燕Flammulina fennae,保藏编号为CCTCC M 2016179。
【文档编号】C12N15/11GK105886647SQ201610373090
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】胡惠萍, 谭武平, 黄龙花, 刘远超, 黄志勇, 吴丽霞
【申请人】广东省微生物研究所, 广东粤微食用菌技术有限公司
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