一种检测猪nlrp6的核苷酸序列及应用
【专利摘要】本发明公开了检测猪NLRP6的核苷酸序列及应用，该检测猪NLRP6的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示，其中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2分别为检测猪NLRP6的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO.3为检测猪NLRP6的荧光探针。本发明进一步公开了利用上述引物和探针检测猪NLRP6的方法，结果显示：该法特异性好，灵敏度高，能够快速、准确的检测猪组织器官样本中NLRP6的表达，在研究NLRP6炎性体时能够对NLRP6进行实时监测，及时了解和掌握炎症的发生过程和发展进程，具有重要的理论意义和实践意义。
【专利说明】
一种检测猪NLRP6的核苷酸序列及应用
技术领域
[0001 ]本发明属于畜牧业动物医学技术研究领域，涉及基于TaqMan水解探针荧光RT-PCR 检测猪NLRP6的核苷酸序列和方法，适用于猪组织样本，包括胃、小肠、大肠等消化道组织以 及肝脏、脾脏、淋巴结、肺脏等组织器官中NLRP6的准确检测，更具体的说是用于猪组织器官 中NLRP6mRNA的表达分析、炎症反应机制研究和肠道屏障功能研究等方面的应用。
【背景技术】
[0002] N0D-样受体(NOD-like receptors，NLRs)是先天性免疫中的一大类病原模式识别 受体。机体依靠 NLRs识别病原感染的信号，启动免疫应答，发挥抵抗病原微生物感染的作 用。NLRP6是NLRs家族的一个成员，广泛存在于消化道组织、免疫器官组织以及免疫细胞中， 参与病原识别和炎性体组成。炎性体活化后激活胱冬肽酶(caspase-Ι)，调控白细胞介素 1 (interleukin-1，IL-1)家族中促炎性细胞因子IL-lb、IL-18和IL-33的生成，参与调节机体 炎症反应和肠道黏膜屏障功能。
[0003] 促炎性细胞因子的释放，能够促进局部炎性细胞浸润，减轻或加重组织炎性损伤 状态。适度炎症反应有助于消除内外源致病因素，使机体内环境处于稳态;慢性、失调的炎 症反应则持续地损伤细胞和组织，促使组织器官异常重构，最终导致器官功能衰竭甚至丧 失。因此，研究不同病原体引起炎症的机制，有利于控制炎症的发生以及炎症的进程，使炎 症反应朝向对机体有益的方向发展，促进机体顺利恢复到健康的状态和水平。
[0004] NLRP6是近两年来研究较多的一种病原识别受体，主要集中在模型动物小鼠的研 究上，在人上的研究也仅有少量报道，但是在猪上的研究还未见报道。很多动物病原体感染 猪后，都会引起炎症反应，但不同的感染类型其引起炎症反应的机制也各不相同。中国是养 猪大国，猪的健康养殖关系和影响着食品安全问题。因此，研究研究猪疫病炎症反应的发生 机制，控制炎症反应的进程，使猪只早日恢复健康，就显得非常重要。一方面，可以减少药物 尤其是抗生素类药物的使用量，保证猪肉食品的安全，另一方面，还可以降低养殖成本，提 高养猪业的经济效益。
[0005] 在本研究中，我们采用TaqMan荧光RT-PCR方法建立了检测猪NLRP6的检测技术，对 反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选、Mg2+使用浓度的优化、引物及探针 使用浓度的优化。建立了特异的能够用于检测猪NLRP6 mRNA表达的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测猪NLRP6的核苷酸序列， 包括引物序列和TaqMan水解探针序列。
[0007] 本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的检测猪NLRP6 mRNA表达的方 法。
[0008] 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案： 一组检测猪NLRP6的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1至 SEQIDN0.3所示，其中SEQIDN0.1至SEQIDN0.2分别为检测猪NLRP6的正义引物和反义 引物，序列SEQ ID NO.3为检测猪NLRP6的荧光探针。所述探针序列SEQ ID NO.3的5'端标记 报告荧光基团FAM，3 '端标记淬灭荧光基团TAMRA。
[0009] 本发明进一步公开了采用一组检测猪NLRP6的核苷酸序列进行检测的方法，其特 征在于，由以下组分作为检测NLRP6所用的必备材料： 1) 裂解液； 2) RT反应液，包括:5?ΤΓ缓冲液、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTPs(each)、200 mM随机引物、 40 U/mL RNase抑制剂、反转录酶200 U/mL M-MLV; 3) qPCR反应液，包括：1(TPCR缓冲液、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTPs( each)、2.5 U/mL Taq DNA聚合酶、20 mM正义引物、20 mM反义引物、20 mM荧光探针； 4) DEPC水:用自来水三次蒸馏获取三蒸水，在三蒸水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37° C 搅拌处理12 h，121°C高压蒸汽灭菌15 min; 5) 猪NLRP6标准品：为体外转录的RNA片段，猪NLRP6标准品的序列为序列表SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列； 其中，正义引物为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，其中5'端标记 报告荧光基团FAM，3 '端标记淬灭荧光基团TAMRA。所述RT反应液中各成分的使用浓度为1' RT缓冲液、2.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、20 mM随机引物、1 U/mL的RNase抑制剂、5 U/mL 的反转录酶M-MLV。所述qPCR反应液中各成分的使用浓度为f PCR缓冲液、3.0 mM MgCl2、 0.2 mM dNTPs、0.05 U/mLTaq DNA聚合酶、0.2 mM正义引物、0.2 mM反义引物、0.1 mM荧光 探针。
[0010] 本发明更加详细的描述如下： 选择猪NLRP6基因的特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针 设计。引物长度为20个碱基左右，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序 列，引物的熔解温度(Tm值)在60° C左右，引物间的Tm值相差小于2°C。探针的长度在25个碱 基左右，探针的Tm值在70°C左右，采用TaqMan修饰，并标记荧光基团。
[0011] -组检测猪NLRP6的核苷酸序列，如下：
其中序列1)和2)分别为检测猪NLRP6的正义引物和反义引物，序列3)为检测猪NLRP6的 TaqMan修饰的焚光探针，探针的5端标记报告焚光基团FAM(6-carboxy_焚光素），3端标记 淬灭荧光基团TAMRA。
[0012]我们采用TaqMan焚光RT-PCR检测技术建立了检测猪NLRP6的检测方法，对反应的 各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选、Mg2+使用浓度的优化、引物及探针使用浓 度的优化、PCR扩增时引物退火温度和延伸时间的优化，得到以下检测方法。
[0013]核苷酸序列表：
本发明提供的一种检测猪NLRP6的方法，由以下内容组成： 1) RNA提取试剂盒:购自天根生化科技(北京)有限公司。
[0014] 2)RT反应液，表1为RT反应液配方： 表1 RT反应液配方
反转录酶M-MLV(200 U/mL)、5'RT缓冲液、随机引物(200 mM)、RNase抑制剂(40 U/mL) 购自大连宝生物生物工程有限公司；dNTPs(2.5 mM each)、MgCl2(25 mM)购自天根生化科 技(北京)有限公司。
[0015] 3)qPCR反应液，表2为qPCR反应液配方： 表2 qPCR反应液配方
Taq DNA 聚合酶（2.5 U/mL)、l(TPCR 缓冲液、dNTPs(2.5 mM each)、MgCl2(25 mM)自天 根生化科技(北京)有限公司，引物和探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0016] 4)DEPC水，用自来水三次蒸馏获取三蒸水，在三蒸水中加入DEPC至终浓度为0.1%， 37°C搅拌处理12 h，121°C高压蒸汽灭菌15 min。
[0017] 5)猪NLRP6标准品：为体外转录的RNA片段。将RT-PCR扩增获得的NLRP6长度为 315bp编码序列克隆于pGEM-T载体，转化T0P10感受态细胞，用质粒小提试剂盒提取质粒 DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-NLRP6。以纯化的质粒为模板，酶 切线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7试 剂盒进行体外转录;将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经Trizol提取后进行测 定，即得到制备猪NLRP6标准品所需的RNA标准品母液。
[0018] 6)猪NLRP6标准品的基因序列如SEQIDN0.4所示。
[0019] 7)RT反应条件：30°C 10 min，42°C 1 h，99°C 5 min，16°C 1 min。
[0020] 8)qPCR反应条件：95°C 4 min;95°C 10 sec，62°C 15 sec，72°C 15 sec，40个循 环，每次循环退火延伸时收集荧光。
[0021] 本发明进一步公开了采用检测猪NLRP6的核苷酸序列检测猪NLRP6的方法在猪组 织器官中NLRP6 mRNA表达方面的应用。实验结果显示:本发明所建立的荧光qPCR检测方法 可以对病毒RNA进行相对定量，根据标准曲线Y=-4.23X+36.13 (X代表Ct值，Y代表NLRP6的相 对含量），可知Ct值越小，NLRP6的表达量相对越高。发病猪不同组织中NLRP6的表达均高于 正常猪不同组织中NLRP6的表达，并且以发病猪淋巴结中NLRP6的表达量为最高。
[0022]本发明公开的检测猪NLRP6的核苷酸序列及应用与现有技术相比所具有的积极效 果在于： 本发明建立了检测猪NLRP6的荧光RT-PCR快速检测方法，该法特异性好，灵敏度高，能 够快速、准确的检测猪组织器官样本中NLRP6,在研究NLRP6炎性体时能够对NLRP6进行实时 监测，及时了解和掌握炎症的发生过程和发展进程，以及采用抗炎药物干预炎症反应的效 果，具有重要的理论意义和实践意义。
【附图说明】
[0023] 图1猪不同组织中NLRP6 mRNA相对定量试验和线性回归结果； 图2 NLRP6荧光PCR检测方法的特异性试验结果。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的 范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本 发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
[0025] 实施例1 猪不同组织中NLRP6 mRNA相对定量试验 (1)猪组织样品处理：用无菌的剪刀和镊子剪去待检组织样品约1.0 g于研钵中充分研 磨，再加入5 mL PBS混勾，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。
[0026] (2)RNA的提取：用RNA提取试剂盒提取不同组织的RNA，按照试剂盒操作说明书进 行，提取的RNA冰上保存备用。
[0027] (3)RNA反转录为cDNA:从冰箱中取出M-MLV(200 U/mL)、5'RT缓冲液、随机引物 (200 mM)、RNase抑制剂（40 U/mL)、dNTPs(2.5 mM each)、MgCh(25 mM)，在室温下融化后， 2 000 rpm离心10 sec。设所需PCR管数为n(n=样本数+1管阴性对照），每个测试反应体系需 要10 mL RT反应液，其中含有4 mL 5??Τ缓冲液，2mLMgCl2(25 mM)，2 mL dNTPs(2.5 mM each)，l mL随机引物（200 mM)，0.5mLRNase抑制剂（40 U/mL)，0.5mL反转录酶M-MLV(200 U/mL)。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各 分装10 mL。在各设定的普通PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10 mL，盖紧管盖，于1000 rpm离心10 sec。将PCR管排好放入普通PCR仪内进行反转录。反应参数设置:30°C 10 min， 42°C 1 h，99°C 5 min，16°C 1 min。反转录结束后，取出cDNA冰上保存备用。
[0028] (4)qPCR反应:从冰箱中取出Taq DNA聚合酶(2.5 U/mL)、l(TPCR缓冲液、正义引物 (20 mM)、反义引物（20 mM)、荧光探针（20 mM)、dNTPs(2.5 mM each)、MgCl2(25 mM)，在室 温下融化后，2 000 rpm离心10 sec。设所需PCR管数为n(n=样本数+1管阴性对照+10管阳性 标准品），每个测试反应体系需要15mL qPCR反应液，其中含有2 mL 1(TPCR缓冲液、2.4 mL MgCh(25 mM)，1.6 mL dNTPs(2.5 mM each)，0.4 mLTaq DNA聚合酶（2.5 U/mL)，0.2 mL正 义引物（20 mM)，0.2 mL反义引物（20 mM)，0.1 mL荧光探针（20 mM)，8.1 mL DEPC水。计算 好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向每个qPCR管中各分装15mL。 在各设定的qPCR管中分别加入制备的cDNA各5mL，盖紧管盖，于1000 rpm离心10 sec。将 qPCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置:95° C 4 min; 95° C 10 sec，62°C 15 sec，72°C 15 sec，40个循环，每次循环退火延伸时收集焚光。
[0029] (5)结果的判定:结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好 超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标 准，阴性对照无 Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应￡35.0,并出现特定的扩增曲线。如 阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
[0030] (6)猪不同组织中NLRP6 mRNA相对定量统计分析:对3头健康猪和3头致病性大肠 感染猪不同的组织脏器qPCR的检测数据进行统计分析，结果见表3。
[0031] 表3 NLRP6 qPCR检测同一头猪不同组织脏器的结果统计
我们建立的荧光qPCR检测方法可以对病毒RNA进行相对定量，根据标准曲线Y=-4.23X+ 36.13 (X代表Ct值，Υ代表NLRP6的相对含量），可知Ct值越小，NLRP6的表达量相对越高。从表 3可以看出，发病猪不同组织中NLRP6的表达均高于正常猪不同组织中NLRP6的表达，并且以 发病猪淋巴结中NLRP6的表达量为最高。
[0032] 实施例2 检测方法的特异性试验 用实施例1中所述方法对猪肠组织及环境中常见的几种病原体(包括大肠杆菌、沙门氏 菌、葡萄球菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒)进行检测，结果表明所建立的方法与病原体均无 交叉反应，特异性良好(图2)。
【主权项】
1. 一组检测猪NLRP6的核苷酸序列，其特征在于，改核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. I 至SEQ ID NO.3所示，其中SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO.2分别为检测猪NLRP6的正义引物和反 义引物，序列SEQ ID NO.3为检测猪NLRP6的荧光探针。2. 权利要求1所述的检测猪NLRP6的核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQ ID NO. 3的5 '端标记报告荧光基团FAM，3 '端标记淬灭荧光基团TAMRA。3. -种采用权利要求1所述的核苷酸序列检测猪NLRP6的方法，其特征在于，由以下组 分作为检测NLRP6所用的必备材料： 1) 裂解液； 2. RT反应液，包括:5?ΤΓ缓冲液、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTPs(each)、200 mM随机引物、 40 U/mL RNase抑制剂、200 U/mL反转录酶M-MLV; 3. qPCR反应液，包括：1(TPCR缓冲液、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTPs( each)、2.5 U/mL Taq DNA聚合酶、20 mM正义引物、20 mM反义引物、20 mM荧光探针;4)DEPC水：用自来水三次 蒸馏获取三蒸水，在三蒸水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37°C搅拌处理12 h，121° C高压蒸 汽灭菌15 min; 5 )猪NLRP6标准品：为体外转录的RNA片段，猪NLRP6标准品的序列为序列表SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列； 其中，正义引物为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，其中5'端标记 报告荧光基团FAM，3 '端标记淬灭荧光基团TAMRA。4. 权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述RT反应液中各成分的使用浓度为1 ?ΤΓ 缓冲液、2.5 111]\11^(：12、0.25 111]\1(11?1^、2〇1111随机引物、11]/11^的1?^86抑制剂、5 1]/11^的 反转录酶M-MLV。5. 权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述qPCR反应液中各成分的使用浓度为f PCR缓冲液、3.0 mM MgCl2、0.2 mM dNTPs、0.05 U/mL Taq DNA聚合酶、0.2 mM正义引物、 0.2 mM反义引物、0.1 mM荧光探针。6. 权利要求3所述采用检测猪NLRP6的核苷酸序列检测猪NLRP6的方法在猪组织器官中 NLRP6 mRNA表达方面的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105886655SQ201610466215
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】李海花, 乔家运, 张全红, 朱琪, 赵向华, 王文杰
【申请人】天津市畜牧兽医研究所