一种用于检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重pcr引物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，本发明根据NCBI (National Center for Biotechnology Information）数据库中鸭疫里默氏菌CH3株全基因序列，对该菌的TonB依赖受体（TbdR1）、OmpA、TonB1蛋白、TonB2蛋白和载铁体相互作用蛋白（SIP）等毒力基因的保守序列进行引物设计，于国内外率先建立鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，该方法灵敏度高、特异性强，最低可检测169pg的核酸。
【专利说明】
一种用于检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，属于兽医传染病学领域。
【背景技术】
[0002]鸭疫里默氏菌(RiemereI la anatipestifer，RA)是能引起雏鸭急性或慢性、败血性传染病的病原，主要侵害2-7周龄各品种雏鸭。通常将该病原引起的疾病称为鸭疫里默氏菌感染或者鸭传染性浆膜炎，该病的特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎及脑膜炎，其发病率为5 %-90 %不等，病死率高达80 %。目前该病已成为危害养全世界养鸭业的一种主要疾病。
[0003]鸭疫里默氏菌为革兰氏阴性杆菌，无运动性、不形成芽孢。目前报道的鸭疫里默氏杆菌的毒力因子有铁载体相互作用蛋白(SIP)(Tu J, Lu F，Miao S，Ni X，Jiang P, Yu
H,Xing L, Yu S， Ding C， Hu Q.The siderophore—interacting protein is involvedin iron acquisit1n and virulence of Riemerella anatipestifer strain CH3.VetMicrob1l.2014.168(2-4):395-402.)、0mpA(Qinghai Hu , Xiangan Han, Xiaoj inZhou, Chan Ding, Yinyu Zhu, Shengqing Yu.0mpA is a virulence factor ofRiemerella anatipestifer.Veterinary Microb1logy.2011.150:278_283)、TonBl和TonB2蛋白(Miao S, Xing L, Qi J, Yu H, Jiang P, Sun B, Cui J, Ou C, Hu Q.Roles of the TonBl and TonB2 proteins in haemin iron acquisit1n andvirulence in Riemerella anatipestifer.Microb1logy.2015.161(8):1592-9)、TonB依赖受体(TbdRl)(Lu F, Miao S, Tu J, Ni X，Xing L, Yu H, Pan L, Hu Q.The roleof TonB-dependent receptor TbdRl in Riemerella anatipestifer in ironacquisit1n and virulence.Vet Microb1l.2013.167(3-4): 713-8.)等，明确RA的毒力因子是阐明RA致病复杂性的关键环节，而疾病的发生通常是由多种毒力因子的相互作用而引起的，鉴于此，本发明建立了鸭疫里默氏菌主要毒力因子多重PCR方法，旨在快速检测该菌的毒力基因，弥补单基因PCR检测方法的不足，该法还可应用于该菌的诊断及分子流行病学的调查，对于鸭疫里默氏菌中毒力基因的监测及分布情况具有重要的生物学意义。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物。
[0005]为达到上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种用于检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，其特征在于，所述引物序列如下:
第一组:TbdR-Fl:5’ CACAATATGGCTCTGATGCT 3’，
TbdR-Rl: 5’ GCTCCTACCATTACTACCTG 3’；第二组:OmpA-Fl: 5’ TTTGAGACACGACTATACAGG 3’，
OmpA-Rl: 5，CTAAAGCAGCTACTACAGA 3 ’.；
第三组:TonBl-Fl:5’ AGCCAAACCATAAATACATCGG 3’，
TonBl-Rl: 5’ TTGCCCGCTTTATCTACCAC 3’；
第四组:TonB2-Fl: 5’ AAGAACCTATTTTGGAGCAAC 3’，
TonB2-Rl: 5’ TGGCATTCTAAATCTTGAACGA 3’；
第五组:SIP-Fl:5’ GGTAAAACCGCACTTCGTA 3’，
SIP-Rl: 5’ GTATTTCGTAAGTTGGCAAT 3’。
[0006]所述5组引物根据各毒力基因的保守序列来设计合适大小的片段，分别用于检测鸭疫里默氏菌五个主要的毒力因子。该引物组合不仅能准确地检测出相应的毒力因子，还能根据片段大小来判别毒力因子。
[0007]所述5组引物主要用来检测鸭疫里默氏菌五个主要的毒力因子。第一组引物所扩增的产物为TonB依赖受体(TbdRl)，片段大小为1179 bp;第二组引物所扩增的产物为外膜蛋白A(OmpA)基因，片段大小为843 bp;第三组引物所扩增的产物为TonBl蛋白基因，片段大小为723 bp;第四组引物所扩增的产物为TonB2蛋白基因，片段大小576 bp;第五组引物所扩增的产物为载铁体相互作用蛋白(SIP)基因，片段大小为315 bp ο
[0008]利用本发明的引物可用于对鸭疫里默氏菌主要毒力因子进行检测，通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR方法。
[0009]具体操作方法如下:
1、引物设计
参考鸭疫里默氏菌CH3株五个毒力基因的核苷酸序列，利用Lasergene v 7.1 DNAStar软件进行同源性分析比较，利用Oligo 7.0软件，分别在保守区设计引物，并采用BLAST工具进行检索，验证其特异性。
[0010]2、反应体系的优化
优化出的25 yL最佳反应体系为:2 XGoTaq Master Green Mix 12.5 yL、五对上、下游引物(20 410各0.5 yL、模板I yL、灭菌去离子水补足至终体积25 yL。最佳反应条件为:94 °C 5 min；94 °C 30 s、53 °C 30 s、72 °C 60 s，35 个循环;72 °C lOmin。
[0011]3、多重PCR的建立
以优化的反应体系进行多重PCR扩增，该方法可用于鸭疫里默氏菌的流行病学检测，为疾病的早期预防控制奠定技术基础。同时，该方法的建立为研究该病原的复制动力学提供检测平台。
[0012]本发明的有益效果:
本发明根据鸭鸭疫里默氏菌CH3株基因组序列，设计主要毒力因子的多重PCR引物，于国内外率先建立检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR方法，该方法灵敏度高、特异性强，最低可检测169pg的核酸。
【附图说明】
[0013]图1鸭疫里默氏菌毒力基因多重PCR的建立，I?5:鸭疫里默氏菌单个毒力基因PCR产物，分别是TonB依赖受体(TbdRl)、OmpA、铁载体相互作用蛋白白；M:Marker(DL2000); 6:鸭疫里默氏菌毒力基因多重PCR产物。
[0014]图2鸭疫里默氏菌毒力基因多重PCR特异性试验，M: Marker(DL2000);l:鸭疫里默氏菌;2:禽大肠杆菌;3:禽多杀性巴氏杆菌;4:金黄色葡萄球菌;5:禽沙门氏菌;6:空白对照。
[0015]图3鸭疫里默氏菌毒力基因多重PCR敏感性试验，M: Marker(DL2000)； 1:169 ng/yL ；2:16.9 ng /yL ；3:1.69 ng /yL ；4:169 pg /yL；5:16.9 pg /yL；6:1.69 pg /yL；
7:空白对照。
【具体实施方式】
[0016]实施例1鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR方法的建立一、材料
鸭疫里默氏菌CH3株(GenBank登录号:NZ_CP006649 )，其中:
TonB依赖受体(TbdRl) (GenBank登录号:KC758117.I)；
OmpA (GenBank登录号:JN871502);
铁载体相互作用蛋白(SIP) (GenBank登录号:KF309182);
TonBl (GenBank登录号:KM393215.I)；
TonB2蛋白(GenBank登录号:KM393216.I)。
[0017]二、步骤试剂
pMD18_T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，GoTaq Master Green Mix购自Promega公司，细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收小量试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自Omega公司；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a感受态细胞自制；。
[0018]引物的特异性
引物的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。分别根据NCBI中CH3株中TonB依赖受体(TbdRl)、OmpA、铁载体相互作用蛋白(SIP)、TonBl与TonB2蛋白的基因序列，通过比对分析，设计五组引物。
[0019]单因子PCR方法的建立
按照细菌DNA提取试剂盒说明书方法提取鸭疫里默氏菌DNA，分别扩增五个毒力基因: 第一组:TbdR-Fl:5’ CACAATATGGCTCTGATGCT 3’，
TbdR-Rl: 5’ GCTCCTACCATTACTACCTG 3’；
第二组:OmpA-Fl: 5’ TTTGAGACACGACTATACAGG 3’，
OmpA-Rl: 5，CTAAAGCAGCTACTACAGA 3 ’.；
第三组:TonBl-Fl:5’ AGCCAAACCATAAATACATCGG 3’，
TonBl-Rl: 5’ TTGCCCGCTTTATCTACCAC 3’；
第四组:TonB2-Fl: 5’ AAGAACCTATTTTGGAGCAAC 3’，
TonB2-Rl: 5’ TGGCATTCTAAATCTTGAACGA 3’；
第五组:SIP-Fl:5’ GGTAAAACCGCACTTCGTA 3’，
SIP-Rl: 5’ GTATTTCGTAAGTTGGCAAT 3’。
[0020]每组引物所扩增的毒力基因片段大小分别为1179 bp,843 bp,723 bp、576bp、315 bp ο
[0021]扩增体系为50 yL，其中2XGoTaq Master Green Mix 25 yL、五对上、下游引物(20 μΜ)各lyL、模板2 yL、补充灭菌去离子水至终体积50 yL。反应条件为94°C预变性5min，随后进行94°C 30 s、53°C 30 s、72°C60s循环35次后，72°C延伸10 min。反应结束后，取PCR产物5 41^，在1.0 %琼脂糖凝胶上电泳。将五个PCR产物经胶回收试剂盒纯化后与PMD18-T载体连接，转化DH5a感受态细胞，用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒。阳性重组质粒进行序列测定。测序结果表明，阳性重组质粒符合预期。
[0022]多重PCR方法的建立
按照细菌DNA提取试剂盒说明书方法提取鸭疫里默氏菌DNA，并利用五组引物同时扩增五个毒力基因:
第一组:TbdR-Fl:5’ CACAATATGGCTCTGATGCT 3’
TbdR-Rl: 5’ GCTCCTACCATTACTACCTG 3’
第二组:OmpA-Fl: 5 ’ TTTGAGACACGACTATACAGG 3 ’;
OmpA-Rl: 5’ CTAAAGCAGCTACTACAGA 3'
第三组:TonBl-Fl: 5 ’ AGCCAAACCATAAATACATCGG 3 ’;
TonBl-Rl: 5’ TTGCCCGCTTTATCTACCAC 3’.第四组:TonB2-Fl: 5 ’ AAGAACCTATTTTGGAGCAAC 3 ’;
TonB2-Rl: 5’ TGGCATTCTAAATCTTGAACGA 3’.第五组:SIP-Fl: 5 ’ GGTAAAACCGCACTTCGTA 3 ’;
SIP-Rl: 5’ GTATTTCGTAAGTTGGCAAT 3’.所扩增的毒力基因片段为1179 bp,843 bp,723 bp、576bp、315 bp(见图1)。
[0023]反应条件的优化
采用25 yL反应体系2XGoTaq Master Green Mix 12.5yL、五对上、下游引物(20 μΜ)各0.5 yL、模板I yL、补充灭菌去离子水至终体积25 yL。对退火温度(53?64 °C)、引物终浓度(0.1?I μΜ)进行优化。
[0024]特异性检测
用优化的条件分别检测禽大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和禽沙门氏菌进行检测，对其特异性进行评价。结果检测均为阴性，PCR产物电泳均未见条带(见图2)。
[0025]敏感性检测
基因组DNA敏感性试验:分别提取鸭疫里默氏菌的基因组DNA，测定DNA含量为16.9yg /此，依次稀释至以下浓度:1690 ng /yL、169 ng /yL、16.9 ng /yL、1.69 ng /yL、169pg AiL、16.9 pg /yL、1.69 pg /yL，各取分别取I yL已稀释的DNA为模板进行多重PCR扩增，试验结果表明:多重PCR最低可检测169 pg的核酸(见图3)。
[0026]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种用于检测鸭疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，其特征在于，所述引物序列如下: 第一组:TbdR-Fl:5’ CACAATATGGCTCTGATGCT 3’， TbdR-Rl: 5’ GCTCCTACCATTACTACCTG 3’； 第二组:OmpA-Fl: 5’ TTTGAGACACGACTATACAGG 3’， OmpA-Rl: 5，CTAAAGCAGCTACTACAGA 3 ’.； 第三组:TonBl-Fl:5’ AGCCAAACCATAAATACATCGG 3’， TonBl-Rl: 5’ TTGCCCGCTTTATCTACCAC 3’； 第四组:TonB2-Fl: 5’ AAGAACCTATTTTGGAGCAAC 3’， TonB2-Rl: 5’ TGGCATTCTAAATCTTGAACGA 3’； 第五组:SIP-Fl:5’ GGTAAAACCGCACTTCGTA 3’， SIP-Rl: 5’ GTATTTCGTAAGTTGGCAAT 3’。2.如权利要求1所述的引物在制备检测鸭疫里默氏菌试剂中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105886658SQ201610483937
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】陈红梅, 黄瑜, 程龙飞, 施少华, 傅光华, 万春和, 傅秋玲, 陈翠腾, 刘荣昌
【申请人】福建省农业科学院畜牧兽医研究所