来自于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶的改良酶变体的制作方法

来自于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶的改良酶变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有乳糖酶活性的变体多肽。本发明还涉及编码此类变体多肽的核酸序列，包含所述核酸序列的核酸构建体，包含所述核酸构建体的重组表达载体和包含所述表达载体的重组宿主细胞。进一步地，本发明涉及经由使用此类宿主细胞生产乳糖酶变体的方法。而且，本发明涉及生产乳糖酶多肽变体的方法。本发明进一步涉及包含乳糖酶变体的组合物，在乳制品的制备中此类乳糖酶变体的用途或含乳糖酶变体的组合物的用途，生产乳制品的方法及所得乳制品。
【专利说明】来自于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶的改良酶变体 发明领域
[0001 ]本发明涉及具有乳糖酶活性的变体多肽。本发明还涉及编码此类变体多肽的核酸 序列，包含所述核酸序列的核酸构建体，包含所述核酸构建体的重组表达载体和包含所述 表达载体的重组宿主细胞。进一步地，本发明涉及经由使用此类宿主细胞生产乳糖酶变体 的方法。而且，本发明涉及生产乳糖酶多肽变体的方法。本发明进一步涉及包含乳糖酶变体 的组合物，在乳制品的制备中此类乳糖酶变体的用途或含乳糖酶变体的组合物的用途，生 产乳制品的方法及所得乳制品。
[0002] 发明背景
[0003] 本发明涉及乳糖酶。乳糖酶或β-半乳糖苷酶(E.C:3.2.1.23)是一种催化乳糖(一 种二糖)水解成其组分单糖葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖存在于乳制品中并且更具体地存在 于乳、脱脂乳、乳酪、冰淇淋、发酵乳制品例如酸奶、许多未成熟干酪和其它乳制品中。在幼 年哺乳动物(其中包括人)的肠壁内通过自然存在的乳糖酶发生乳糖的分解。仅一小部分成 年群体尚未丧失这种性能并且仍然可以消化乳糖。在大多数成体中由乳糖引起的营养和功 能问题是由乳糖酶的缺乏而引起并且众所周知且有描述。此类群体的成员不能使乳糖水 解，在这种情况下乳糖进入大肠，在这里其导致脱水、钙吸收差、肠胃气胀、嗳气和痉挛，并 且，在严重的情况下，甚至水性爆发性腹泻。
[0004] 乳糖酶重要的工业应用是在用于乳糖不耐受个体的乳糖水解乳制品的生产中。此 类水解乳制品包括巴氏灭菌乳、UHT乳及用或不用中间加工步骤(例如蛋白水解）由其全部 或部分原始组成部分复原的乳。用乳糖酶处理可在热处理乳之前或之后进行。可通过将酶 添加到乳中或其含乳糖的组成部分之一中进行乳糖酶处理。
[0005] 乳糖的溶解特性使得可能导致其在以高浓度存在时结晶，在乳制品例如炼乳、淡 奶、乳粉、冻乳、冰淇淋和在具有高乳含量的甜食产品中产生沙粒状或颗粒状质地。乳糖被 乳糖酶全部或部分水解消除了这个问题，从而提供具有均匀质地的产品并且因此消费者接 受程度更高。
[0006] 乳糖酶的另一种工业应用是增加含乳糖的产品如乳或酸奶中的甜味。此类产品中 乳糖的水解由于生成葡萄糖而导致甜味增加，而产品的热量值不增加。相反，乳糖酶的使用 还可减少变甜的乳制品中的糖添加，而不会损害甜味。
[0007] 乳糖酶的另一种工业应用是含有乳组分的乳糖产品例如面包的水解。在此类产品 中添加乳糖以增强风味、保持水分、提供褐变和改善烘烤特性。水解的乳糖糖浆有望例如增 强面包皮显色、改善风味和香气、改变质地、延长保存期限和加强面包结构。
[0008] 发酵乳制品例如酸奶中乳糖被乳糖酶水解将增加甜味。同样，在发酵过程开始之 前添加乳糖酶时，可提高酸发展的速率并且因此减少加工时间。乳或乳源性产品例如乳清 的乳糖酶处理使得此类产品适合应用于动物饲料和宠物食品中用于乳糖不耐受动物，例如 猫。乳糖水解允许生产更高浓度的乳清并且同时预防与早先关于乳糖缺陷患者描述的问题 类似的肠道问题。浓缩乳糖水解乳清以生产含有70-75%固体的糖浆并且用作冰淇淋、面包 和甜食产品中的食品成分。
[0009] 乳糖酶已有描述并且从多种生物，包括微生物中分离。乳糖酶常常是微生物如克 鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)和杆菌属(Bacillus)的细胞内组分。克鲁维酵母菌属并且 尤其是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，和其它酵母例如念珠 菌属(Candida)、圆酵母属(Torula)和球拟酵母属(Torulopsis)的酵母是酵母乳糖酶的常 见来源，而凝结芽孢杆菌(B. coagulans)、环状芽孢杆菌(B. circulans)或乳酸菌是众所周 知的细菌乳糖酶来源。源自这些生物的几种商用乳糖酶制剂可用，例如Maxilact?(来自于 乳酸克鲁维酵母，由荷兰代尔夫特DSM生产）。这些乳糖酶是所谓的中性乳糖酶，因为其具有 介于pH=6和pH=8之间的最适pH。
[0010] 虽然酵母中性乳糖酶常常在工业上用于生产无乳糖或乳糖减少的乳制品，但酶处 理的使用成本往往很高。酶的使用成本相对较高的主要原因是：
[0011] ?为了维持生产工厂内的卫生状况，在低温下进行培育。在这个温度下工业上使 用的乳糖酶不是很活跃并且应按相对高的剂量添加。
[0012] ?目前使用的乳糖酶在用乳糖酶培育后期，受其产物，尤其是半乳糖抑制。当需要 具有低残留乳糖浓度的产品时，必须添加额外的酶以补偿由于半乳糖积累而引起的活性降 低。
[0013] ?目前使用的乳糖酶在乳中具有相对较低的比活性，在应用中需要使用高酶剂 量。
[0014] 因此，生产乳糖减少和无乳糖的产品的酶剂量和成本相对较高。
[0015] 显然需要一种或多种能够克服以上提到的至少一种缺点的乳糖酶变体。

【发明内容】

[0016] 本发明涉及具有乳糖酶活性的变体多肽，即涉及乳糖酶变体。本发明的乳糖酶变 体与参考多肽相比可具有一种或多种改良的特性，所述参考多肽通常具有乳糖酶活性。参 考多肽可为野生型乳糖酶，例如来自于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶。本发明的变体多肽可称 为"乳糖酶变体"、"改良乳糖酶"等等。已生成克鲁维酵母中性乳糖酶的变体，其具有导致在 乳糖减少或无乳糖的乳制品生产中此类乳糖酶的使用成本降低的特性。具有关于乳制品生 产的改良特性的乳糖酶变体可展示：
[0017] ?针对0NPG更高的比活性；
[0018] ?针对乳糖更高的比活性；
[0019] ?在低温乳中的针对乳糖更高的活性；
[0020] ?半乳糖抑制降低;和/或
[0021] ?在乳中更高的G0S产量。
[0022] 与参考多肽相比，可测定这些改良中的每一种。而且，与参考多肽相比，本发明的 变体多肽可具有至少2种或3种或4种改良特性。表1提供了改良特性组合的实例。
[0023] 因此本发明提供了具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基酸序 列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于第
[0024] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，
[0025]所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 相比具有一种或多种改变的特性并且其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60%序列同一 性。
[0026] 本发明还提供了：
[0027] -编码本发明的变体的核酸序列；
[0028] -包含此类核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列与能够指导乳糖酶在合适表达 宿主中的表达的一个或多个控制序列可操作性连接；
[0029] -包含此类核酸构建体的重组表达载体;和
[0030] -包含此类表达载体的重组宿主细胞。
[0031] 本发明还涉及生产乳糖酶的方法，其包括在有助于乳糖酶生成的条件下培养本发 明的宿主细胞并且回收乳糖酶。
[0032] 此外，本发明涉及生产乳糖酶多肽变体的方法，所述方法包括：
[0033] a)选择具有乳糖酶活性的多肽；
[0034] b)取代对应于
[0035] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的至少一个氨基酸残基，
[0036] 所述位置参照SEQ ID N0:2定义；
[0037] c)任选地取代如b)中所限定的一个或多个另外的氨基酸；
[0038] d)制备由步骤a)_c)产生的变体；
[0039] e)测定变体的特性;及
[0040] f)选择与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶相比具有改变特性的变体并选 择与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性的变体，从而产生乳糖酶多肽变体。
[0041]进一步地，本发明涉及：
[0042] -组合物，其包含本发明的变体或通过本发明的方法能够获得的变体；
[0043] -在乳制品的制备中根据本发明的变体乳糖酶或本发明的组合物的用途；
[0044] -生产乳制品的方法，所述方法包括向乳中添加有效量的根据本发明的变体乳糖 酶或本发明的组合物并且进行适当的进一步乳制品生产步骤;及
[0045] -能够通过此类方法或用途获得的乳制品。
[0046] 序列表简述
[0047] SEQ ID N0:1列出了来自于乳酸克鲁维酵母的野生型乳糖酶基因序列的核酸序列 [0048] SEQ ID N0:2列出了来自于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶序列的氨基酸序列
[0049] 发明详述
[0050] 贯穿本说明书和所附权利要求，词语"包含"、"包括"和"具有"应包容性地解释。 即，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未具体叙述的其它要素或整体。
[0051] 在本文中不使用数量词修饰时用于指一个或一个以上（即一个或至少一个）的对 象。举例而言，"要素"可意为一种要素或一种以上的要素。
[0052]在本文中，"乳糖酶"或β-半乳糖苷酶(E. C. 3.2.1.23)是一种催化乳糖(一种二糖） 水解成其组分单糖葡萄糖和半乳糖的酶。由于乳糖酶的转移酶活性在这个反应期间可形成 半乳-寡聚糖(G0S)。
[0053]在幼年哺乳动物的肠道中，以及在植物、真菌、酵母和细菌中，发现乳糖酶。
[0054] 乳糖酶可为中性或酸性乳糖酶。在一个优选的实施方式中，本发明的变体多肽具 有中性乳糖酶活性，即其具有介于pH=6和pH=8之间的最适pH。
[0055] 乳糖酶可为细胞内或细胞外产生的乳糖酶。在一个优选的实施方式中，乳糖酶是 细胞内产生的乳糖酶。
[0056] 编码乳糖酶(例如本发明的变体)的基因或cDNA可经克隆并在宿主生物中过表达。 可用于乳糖酶过表达的公知宿主生物包括曲霉菌（Aspergillus)、克鲁维酵母菌 (Kluyveromyce)、木霉(Trichoderma)、大肠杆菌(Escherichia coli )、毕赤酵母(Pichia)、 糖酵母（Saccharomyces)、耶氏酵母（Yarrowia)、链抱霉（Neurospora)、乳球菌 (Lactococcus)或杆菌（Bacillus) 〇
[0057] 在本文中，可取代以获得本发明的变体的位置参照为乳酸克鲁维酵母乳糖酶的 SEQIDN0:2定义。
[0058] 本发明涉及与具有乳糖酶活性的参考多肽相比，具有乳糖酶活性的变体多肽。参 考多肽通常可为具有乳糖酶活性的野生型多肽，例如SEQ ID N0:2或相关序列的乳糖酶。参 考多肽也可称为亲本多肽或对比多肽。
[0059] 更具体地，本发明涉及具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基 酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于 第
[0060] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性并且其中所述变 体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0061] 野生型参考多肽可从任何适合生物获得。通常，野生型参考多肽可从微生物，优选 其中自然产生乳糖酶的微生物获得。
[0062] 此类微生物包括酵母例如克鲁维酵母菌。参考多肽可为乳酸克鲁维酵母野生型序 列。
[0063]优选地，参考多肽为SEQ ID N0:2中列出的乳糖酶。
[0064] 如本文所描述的变体多肽通常为非自然存在的多肽。
[0065] 因此本发明提供了具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基酸序 列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于第
[0066] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比具有一种或多种改 变的特性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0067] 变体多肽与参考多肽相比通常将具有至少一种改良特性，尤其是就关于变体多肽 在制备乳制品的方法中的用途的特性而论。
[0068] 具体而言，改良特性可涉及活性或比活性或涉及半乳糖抑制的降低或在乳中更高 的G0S产量。
[0069] 表1列出了影响本发明的变体乳糖酶的具体特性的位置。
[0070] 表1:相对于SEQID N0:2定义的优选取代。指出了不同特性如针对作为底物的0NPG 或乳糖的比活性、在低温乳中的活性、半乳糖对乳糖酶活性抑制的降低及在乳中更高的半 乳-寡聚糖产量。
[0072] 本发明的变体多肽针对0NPG可展示出更高的比活性。
[0073] 本发明因此提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基 酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于 第
[0074] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对0NPG具有更高 的比活性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0075] 优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述 氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对 应于第415、483、619、621、622或633位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代， [0076]所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比针对0NPG具有更高的比活性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。优选对应于第415和/或619位氨基酸中的任一个的氨基酸 残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义。
[0077] 更优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下 述氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含 选自
[0078] 了415(：、了4154、44835、￥6191、1621￥、]\16221^或了6336的至少一个取代，
[0079]所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比针对0NPG具有更高的比活性并且其中所述变体与SEQ ID NO: 2具有至少60%序列同一性。优选取代T415C和/或V619I，所述位置参照SEQ ID NO: 2定 义。
[0080] 本发明的另一种变体多肽针对乳糖可展示出更高的比活性。因为乳糖是乳制品中 乳糖酶的天然底物，所以变体多肽的更高比活性可导致酶的所需剂量减少并且因此可导致 处理成本更低。通过减少应用中的酶剂量，也减少了增加的副活性的量，并且因此预期更高 品质的最终乳制品。
[0081] 本发明因此提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基 酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于 第
[0082] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对乳糖具有更高 的比活性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0083] 优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述 氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对 应于第
[0084] 415、440或483位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照 SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多 肽)相比针对乳糖具有更高的比活性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列 同一性。优选对应于第415和/或483位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代(这 种优选是基于对包含取代组合的乳糖酶变体的分析），所述位置参照SEQ ID N0:2定义。
[0085] 更优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下 述氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含 选自
[0086] T415C、T415A、Y440F 或 A483S 的至少一个取代，
[0087]所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比针对乳糖具有更高的比活性并且其中所述变体与SEQ ID 勵:2具有至少60%序列同一性。优选取代了4154、了415(：和/或44833(这种优选是基于对包含 取代组合的乳糖酶变体的分析），所述位置参照SEQ ID N0:2定义。
[0088] 甚至更优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具 有下述氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列 包含对应于第
[0089] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少两个、三个、四个或五个取代
[0090] 所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比针对乳糖具有更高的比活性并且其中所述变体与SEQ ID NO: 2具有至少60 %序列同一性。
[0091] 此类突变体的实例为表5中描述的突变体16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35或36。
[0092]优选在低温下（优选地所述低温在4_12°C的范围内），本发明的再一种变体多肽可 针对乳中的乳糖展示出更高的活性。因为乳糖酶常常用于低温乳中，所以在这种特定应用 中变体多肽的活性增强可导致酶剂量降低，并且因此而降低成本。另外，变体多肽更高的活 性可导致乳加工时间减少并且因此而降低可能的微生物腐败的风险。
[0093] 本发明因此提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基 酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于 第
[0094] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对低温乳中的乳 糖展示出增强的活性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0095] 优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述 氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对 应于第
[0096] 233、257、258、263、274、284、297、440、619、633、862或1004位氨基酸中的任一个的 氨基酸残基的至少一个取代，
[0097]所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对低温乳中的乳糖展示出增强的活性并且其中所述变体 与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。优选(至少)对应于第440位氨基酸的氨基酸残基 的取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义(这种优选是基于对包含取代组合的乳糖酶变体的 分析）。优选的取代组合是位置440和619处的取代。
[0098] 更优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下 述氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含 选自
[0099] D233V、D257G、A258T、N263S、K274E、N284S、E297G、Y440F、V619I、T633G、L862VS A1004P的至少一个取代，
[0100]所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对低温乳中的乳糖展示出增强的活性并且其中所述变体 与SEQIDN0:2具有至少60%序列同一性。优选取代为（至少)Y440F，所述位置参照SEQID N0: 2定义（这种优选是基于对包含取代组合的乳糖酶变体的分析）。优选的取代组合是 Y440F+V619L·
[0101] 虽然，对应于第
[0102] 233、257、258、263、274、284、297、440、619、633、862或1004位氨基酸中的任一个的 氨基酸残基的至少一个取代的存在(所述位置参照SEQ ID N0:2定义)足以获得具有乳糖酶 活性并且针对低温乳中的乳糖进一步显示出增强的活性的变体多肽，但是本文显示双重突 变或三重突变多肽变体针对低温乳中的乳糖也展示出增强的活性。
[0103] 因此，本发明还提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述 氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述变体包含的氨基酸 序列在与SEQ ID腸：2中列出的序列比对时，包含选自263、274或284(更优选地似633、 K274E或N284S)的至少两个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有 乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对低温乳中的乳糖展示出增强的 活性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0104] 本发明还提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基酸 序列，在与包含SEQ ID N0: 2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述变体包含的氨基酸序列在 与SEQ ID N0:2中列出的序列比对时，包含在位置263、274和284处的取代(更优选地所述取 代为 N263S、K274E 和 N284S)
[0105] 所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对低温乳中的乳糖展示出增强的活性并且其中所述变体 与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0106] 本发明还提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基酸 序列，在与包含SEQ ID N0: 2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述变体包含的氨基酸序列在 与SEQ ID N0:2中列出的序列比对时，包含在位置257和297处的取代(优选地所述取代为 D257G和E297G)，
[0107]所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对低温乳中的乳糖展示出增强的活性并且其中所述变体 与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0108] 本发明还提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基酸 序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于第
[0109] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少三个、四个或五个取代
[0110]所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比针对低温乳中的乳糖展示出增强的活性并且其中所述变体 与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0111] 此类突变体的实例为表5中描述的突变体15、17、18、19、20、21或22。
[0112] 本发明的另一种突变多肽可展示出半乳糖抑制降低。在乳糖浓度低且半乳糖浓度 高时，半乳糖抑制导致在之后的时间点乳糖水解缓慢。因此将期望有半乳糖抑制降低的乳 糖酶，特别是在想要生产乳糖浓度低于〇. 5g/L的乳制品时。
[0113] 本发明因此提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基 酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于 第
[0114] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比展示出降低的半乳 糖抑制并且其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60%序列同一性。
[0115] 优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述 氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对 应于第
[0116] 619、621或622位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照 SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多 肽)相比展示出降低的半乳糖抑制并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同 一性。
[0117] 更优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下 述氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含 选自
[0118] V619I、I621V 或 M622L 的至少一个取代，
[0119] 所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比展示出降低的半乳糖抑制并且其中所述变体与SEQ ID N0: 2具有至少60 %序列同一性。
[0120] 本发明的另一种突变多肽可在乳中展示出增加的G0S产量。G0S(半乳-寡聚糖)是 被定义为不可消化的食品成分的益生元，其通过刺激结肠中有益菌的生长和/或活性而有 益地影响宿主。并非所有乳糖酶都同样非常适于制备G0S。具有能够在乳中存在的低乳糖浓 度(<50g/L)下积累G0S的另一种乳糖酶是所期望的。
[0121] 本发明因此提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基 酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于 第
[0122] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比在乳中展示出增加 的G0S产量并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0123] 优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述 氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对 应于第
[0124] 619或622位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，
[0125] 所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比在乳中展示出增加的G0S产量并且其中所述变体与SEQ ID NO: 2具有至少60 %序列同一性。
[0126] 更优选地，本发明提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下 述氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含 选自
[0127] V619I或M622L的至少一个取代，
[0128] 所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽 (例如SEQ ID NO: 2的多肽）相比在乳中展示出增加的GOS产量并且其中所述变体与SEQ ID NO :2具有至少60 %序列同一性。
[0129] 本发明的变体乳糖酶与亲本相比在除以上指定位置外的位置处也可包含附加修 饰，例如，一个或多个附加取代、添加或缺失。本发明的变体可包含不同类型的这类修饰的 组合。变体可包含一个、两个、三个、四个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25 个、至少30个或更多个此类修饰(其可全部为同一类型或可为不同类型的修饰）。通常，附加 修饰可为取代。因此本发明还提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有 下述氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包 含对应于第
[0130] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义，并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性，并且其中所述变 体多肽包含除限定的那些取代以外的附加取代并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少 60 %序列同一性。
[0131] 根据本发明的变体(例如具有如表1或表2中列出的一个或多个取代的变体)与参 考乳糖酶多肽（例如SEQ ID勵:2的乳糖酶）可具有至少约60%、65%、70%、75%或80%同 源性/同一性，例如与亲本多肽具有至少约85%同源性，例如与亲本多肽具有至少约90%同 源性，与亲本多肽具有至少95%同源性，与亲本多肽具有至少约98%同源性或与亲本多肽 具有至少约99%同源性。此类变体通常将具有如表1或表2中列出的一个或多个取代或多组 取代。
[0132] 因此本发明还提供了一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨 基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应 于第
[0133] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比具有一种或多种改变的特性并且其中所述变 体与SEQ ID N0:2具有至少80%序列同一性。
[0134] 本发明的变体通常将保留乳糖酶活性。即，本发明的变体通常将能够将乳糖转化 为葡萄糖和半乳糖或本发明的变体通常将能够将乳糖转化为葡萄糖和半乳糖并且能够形 成G0S。本发明的变体是通常能够进行乳糖的酶转化并且可用于乳制品，例如乳或酸奶的制 备的变体。
[0135] 优选地，本发明的变体与其所来源的参考乳糖酶多肽相比通常将表现出改良特 性。如果变体按照下文所述来使用的话，例如，在制备乳制品的方法中使用的话，此类改良 特性通常将是相关的性质。
[0136] 表现出相对于参考乳糖酶改良的特性的多肽变体是在相关特性上展示出可测量 的降低或增加的多肽变体，通常使得变体更适合如下使用，例如用于生产乳制品的方法中。
[0137] 所述特性因此可降低至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少 60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %。或者，所述特性可增加至少 10%、至少25%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%或至少1000%。在这种情况下 降低或增加百分比表示与参考乳糖酶多肽比较的降低或增加百分比。技术人员熟知如何测 量此类百分比变化一其是对参考乳糖酶活性和变体乳糖酶活性的比较。
[0138] 本文描述的变体全体包含在术语"根据本发明的多肽"或"根据本发明的变体"中。
[0139] 术语"肽"和"寡肽"被认为是同义的（正如普遍公认的那样)并且当上下文需要指 出通过肽键偶联的至少两个氨基酸的链时，每个术语可交换使用。在本文中对于含有多于 约七个氨基酸残基的链，使用词"多肽"。本文中所有寡肽和多肽的式或序列均从左到右并 且从氨基末端至羧基末端的方向书写。本文所用氨基酸的单字母代码在本领域普遍已知并 且可以在Sambrook等（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY, 1989)中找到。
[0140] 本发明的多肽可以为经分离的形式，例如基本上经分离的形式。"经分离的"多肽 或蛋白质意指从其天然环境中取出的多肽或蛋白质。例如，出于本发明的目的，在宿主细胞 中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是经过分离的，已用任何合适的技术进行了基本纯 化的重组多肽也被认为是经过分离的。可通过本领域已知的方法从重组细胞培养物中回收 和纯化根据本发明的多肽变体。
[0141] 本发明的多肽包括化学合成过程的产物，及通过重组技术由原核宿主或真核宿主 (包括，例如，细菌、酵母、真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。取决于重组生 产过程中采用的宿主，本发明的多肽可为糖基化的或可为非糖基化的。另外，本发明的多肽 还可包括初始修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况下这由宿主介导的过程导致。
[0142] 本发明特征还在于根据本发明的多肽变体的生物活性片段。将此类片段视为涵盖 在术语"本发明的变体"中。
[0143] 本发明的多肽变体的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸 序列与本发明的变体蛋白的氨基酸序列足够相同或源于本发明的变体蛋白的氨基酸序列， 所述片段包括的氨基酸较之全长蛋白要少，但显示出相应全长蛋白的至少一种生物活性。 通常，生物活性片段包含具有本发明的变体蛋白的至少一种活性的结构域或基序。本发明 的蛋白质的生物活性片段可以是长度为例如1〇、25、50、100个或更多个氨基酸的多肽。而 且，可以通过重组技术制备其中蛋白质的其它区域缺失的其它生物活性部分并且针对本发 明的多肽的天然形式的一种或多种生物活性对其进行评价。
[0144] 通常，本发明的蛋白质片段将包含本文限定的一个或多个取代。
[0145] 本发明特征还在于编码以上生物活性片段的核酸片段(所述生物活性片段本身为 本发明的变体)。
[0146] 本发明还提供了一种编码本发明的变体多肽的核酸序列。因此本发明还提供了编 码具有乳糖酶活性的变体多肽的核酸序列，其中所述变体具有下述氨基酸序列，在与包含 SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于第
[0147] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比具有一种或多种改 变的特性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0148] 本发明还涉及经分离的多核苷酸，其编码本发明的多肽变体的至少一种功能结构 域。通常，此类结构域将包含本文描述的一个或多个取代。
[0149] 在本发明的一个实施方式中，根据本发明的核酸序列编码包含下述氨基酸序列的 多肽，其中，所述氨基酸序列较之亲本乳糖酶而言具有一处或多处截短，和/或至少一处氨 基酸取代、缺失和/或插入。
[0150] 在本文中使用时，术语"基因"和"重组基因"是指包括编码本文所述的变体的开放 阅读框的核酸分子。基因可包括编码序列、非编码序列、内含子和调控序列。即，在本文中使 用时，"基因"可指本文所定义的经分离的核酸分子。因此，在本申请的上下文中，术语"基 因"，不仅仅指天然存在的序列。
[0151] 可以使用本领域技术人员公知的标准分子生物学技术连同本文提供的序列信息 来产生本发明的核酸分子。
[0152] 例如，使用标准的合成技术，可从头合成所需的核酸分子。此类合成工艺通常将是 自动化工艺。
[0153] 或者，可通过使用现有核酸分子，例如野生型核酸分子的定点诱变来产生本发明 的核酸分子。可使用本领域技术人员公知的许多技术进行定点诱变。
[0154] 在一种此类方法中，这里仅以举例的方式提到，使用编码期望取代的寡核苷酸"弓丨 物"在质粒模板上进行PCR。因为引物是新合成的链的末端，所以在第一个循环期间在结合 模板DNA链中应存在错配，在该第一轮之后，基于引物的链(含突变)将与原始模板的浓度相 等。连续循环之后，将呈指数增长，并且在800万：1的区域内在25个循环后将在数量上超过 原始未突变的链，从而产生经突变的扩增片段的几乎均匀的溶液。然后通过酶消化(例如使 用仅切割甲基化DNA的限制酶，例如Dpnl)而消除模板DNA。源自碱裂解质粒制备并因此而甲 基化的模板在这个步骤中被破坏，但突变质粒得到保存，因为它是在体外生成并且因此未 甲基化。
[0155] 在此类方法中，在单次PCR反应中，例如通过使用各自包含一个或多个错配的一个 或多个寡核苷酸可以向核酸分子中引入一个以上突变(编码如本文所述的取代）。或者，可 通过进行一次以上的PCR反应向核酸分子中引入一个以上突变，每次反应引入一个或多个 突变，从而以连续、重复的方式向核酸中引入改变的核酸。
[0156] 可使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板和恰当的错配寡核苷酸引物根据上述 定点诱变技术生成本发明的核酸。以这种方式得到的核酸分子可克隆到恰当载体中并通过 DNA序列分析表征。
[0157] 本发明的核酸序列与亲本乳糖酶相比，可包含一个或多个缺失，即空位。此类缺 失/空位也可使用定点诱变，使用恰当的寡核苷酸生成。生成此类缺失的技术为本领域技术 人员公知。
[0158] 此外，对应于本发明的核苷酸序列或可与本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸可 通过标准的合成技术，例如使用自动化DNA合成仪制备。
[0159]此外，互补核酸分子包括在本发明中。与另一核苷酸序列互补的核酸分子是与另 一核苷酸序列充分互补，使其可以与另一核苷酸序列杂交，从而形成稳定双链体的核酸分 子。
[0160]本发明的一个方面涉及编码本发明的变体或其生物活性片段或结构域的经分离 的核酸分子，以及足以用作杂交探针以鉴定编码本发明的多肽的核酸分子的核酸分子及适 于用作PCR引物用于核酸分子的扩增或突变(例如用于本发明的核酸分子的制备）的此类核 酸分子的片段。
[0161] "经分离的多核苷酸"或"经分离的核酸"是并非紧邻在其所来源的生物自然存在 的基因组中与之紧邻的两个编码序列（一个在5'末端另一个在3'末端）的DNA或RNA。因此， 在一个实施方式中，经分离的核酸包括紧邻编码序列的一些或所有5'非编码(例如，启动 子)序列。因此该术语包括，例如，并入到载体、自主复制质粒或病毒或原核生物或真核生物 的基因组DNA中的重组DNA或独立于其它序列、作为单独分子(例如，通过PCR或限制性内切 核酸酶处理产生的基因组DNA片段)存在的重组DNA。还包括是编码基本上不含细胞物质、病 毒物质或培养基(通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其它化学品（经化学合成时）的附 加多肽的杂合基因的一部分的重组DNA。而且，"经分离的核酸片段"是并非作为片段自然存 在并且不会在自然状态下找到的核酸片段。
[0162] 在本文中使用时，术语"多核苷酸"或"核酸分子"旨在包括DNA分子(例如，cDNA或 基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物。核酸分 子可为单链或双链，但是优选为双链DNA。可使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或硫 代磷酸酯核苷酸)合成核酸。此类寡核苷酸可用于，例如，制备具有改变的碱基配对能力或 增强的核酸酶抗性的核酸。
[0163] 本发明的另一个实施方式提供了与本发明的核酸分子反义的经分离核酸分子。
[0164] 术语"同源性"或"同一性百分比"在本文中可交换使用。为了本发明的目的，在本 文中为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较的目的而比 对序列（例如，可以在第一氨基酸或核酸的序列中引入空位以与第二氨基酸或核酸序列最 佳比对）。然后比较在相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位 置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置相同。 两个序列之间的同一性百分比是序列共有相同位置数量的函数（即，同一性％=相同位置 的数量/位置(即重叠位置)的总数xlOO)。优选地，两个序列为相同长度。
[0165] 可在比较的两个序列的整个长度上或在两个序列的片段上进行序列比较。通常， 将在比较的两个序列的全长上进行比较。然而，可在例如，二十、五十、一百个或更多个连续 氨基酸残基的区域上进行序列同一性。
[0166] 技术人员将意识到几种不同的计算机程序可用于测定两个序列之间的同源性的 事实。例如，序列的比较和两个序列之间同一性百分比的测定可以使用数学算法完成。在一 个优选的实施方式中，使用已经并入Accelrys GCG软件包(在http ://www.accelrys. com/ products/gcg/上可用）中的GAP程序中的Needleman和Wunsch( J.Mol · Biol · (48): 444-453 (1970))算法，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、 3、4、5或6的长度权重测定两个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比。技术人员将认识到 所有这些不同的参数将产生略有不同的结果，但是使用不同算法时两个序列的总体同一性 百分比无显著改变。
[0167] 本发明的蛋白质序列或核酸序列可进一步用作"查询序列"以进行对公用数据库 的搜索以（例如）鉴定其它家族成员或相关序列。此类搜索可使用Altschul等人（1990) 夂]?〇13丨〇1.215:403-10的^^5了财口81^5了?程序(2.0版本)进行。可用81^5了?程序、得分= 50、字长=3进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于 比较的目的，为获得空位比对，如Altschul等人（1997)Nucleic Acids ResJSdThSSSg-SdO 2 中所述 ，可利 用空位BLAST 。 当利用BLAST 和空位 BLAST 程序时 ，可以 使用各个程序 (例如 BLASTP和BLASTN)的默认参数。参见http://www.ncbi · nlm.nih.gov/上国家生物技术信息 中心（National Center for Biotechnology Information)的主页。
[0168] 本发明还提供了一种核酸构建体，其包含编码具有乳糖酶活性的变体多肽的核酸 序列，其中所述变体具有下述氨基酸序列，在与包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比 对时，所述氨基酸序列包含对应于第
[0169] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代，所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中 所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比具有一种或多种改 变的特性并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性，其中所述核酸序列 与能够指导乳糖酶在合适表达宿主细胞中的表达的一个或多个控制序列可操作性连接。
[0170] 本发明的另一个方面涉及含有编码本发明的变体乳糖酶多肽的核酸的载体，优选 表达载体。
[0171]在本文中使用时，术语"载体"是指能够将另一核酸转运到与之相连的核酸上的核 酸分子。一种类型的载体为"质粒"，是指附加 DNA区段可连入其中的环状双链DNA环。另一种 类型的载体为病毒载体，其中附加 DNA区段可连入病毒基因组中。某些载体能够在其被引入 的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其 它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞之后整合到宿主细胞的基因组中， 并从而连同宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与之可操作性连接的基因的表 达。本文将此类载体称为"表达载体"。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体常常呈质粒 形式。术语"质粒"和"载体"在本文中可交换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本 发明旨在包括此类其它形式的表达载体，例如起到等效功能的病毒载体(例如，复制缺陷型 逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒）。
[0172] 本发明的重组表达载体包含呈适于核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明的核 酸，这意味着重组表达载体包括基于要用于表达的宿主细胞而选择的、与要表达的核酸序 列可操作性连接的一个或多个调控序列。在重组表达载体中，"可操作性连接"旨在表示目 标核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体引入宿主细 胞时在宿主细胞中）的方式与调控序列连接。术语"调控序列"旨在包括启动子、增强子和其 它表达控制元件（例如，多聚腺苷酸化信号）。例如，在Goeddel ; Gene Express ion Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego，CA( 1990)中描述 了此类调控序列。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的 调控序列及指导核苷酸序列仅在某一种宿主细胞中的表达的调控序列（例如，组织特异性 调控序列）。本领域的技术人员将认识到，表达载体的设计可取决于诸如要转化的宿主细胞 的选择、期望蛋白质的表达水平等因素。本发明的表达载体可引入宿主细胞中，从而产生如 本文所述的核酸所编码的蛋白质或肽(例如，SEQ ID N0: 2的乳糖酶变体，例如功能等同物 或片段、或包含一个或多个此类变体的融合蛋白）。
[0173] 本发明的重组表达载体可设计为本发明的变体蛋白在原核细胞或真核细胞中表 达。例如，本发明的变体蛋白可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达 载体）、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。在Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego,CA(1990)中进一步讨论了适合 的宿主细胞。或者，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7 聚合酶。
[0174]用于本发明的表达载体包括染色体来源的载体、附加体来源的载体和病毒来源的 载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒例如杆状病毒、乳多 空病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆转录病毒的载体，及源自其组合的载 体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件(例如粘粒和噬菌粒)的载体。
[0175] DNA插入物应与适当的启动子，例如菌体ApL启动子，大肠杆菌lac、trp和tac启 动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTR启动子等可操作性连接。其它适合的启动子 将为技术人员所知。在一个特定实施方式中，优选能够指导乳糖酶在丝状真菌中的高表达 水平的启动子。此类启动子在本领域已知。表达构建体可含有用于转录起始、终止的位点， 并且在转录区域中，含有用于翻译的核糖体结合位点。构建体表达的成熟转录物的编码部 分将包括在起点处的翻译起始AUG和适当地位于要翻译的多肽末端的终止密码子。
[0176] 载体DNA可经由传统转化或转染技术引入原核细胞或真核细胞中。在本文中使用 时，术语"转化"和"转染"意在指各种本领域公认的将外源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞的 技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子 脂质介导的转染或电穿孔。在Sambrook等人(Molecular Cloning:ALaboratory Manual， 2nd,ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，Davis等人Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其 它实验室手册中可以找到转化或转染宿主细胞的适合方法。
[0177] 对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知取决于所用的表达载体和转染技术，仅一小 部分细胞可将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些组成部分，通常将编码选择 性标记(例如，抗生素抗性）的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。优选的选择性标记包 括赋予对药物，例如G418、潮霉素(hygromycin)和甲氨蝶呤(methatrexate)的抗性的选择 性标记。可将编码选择性标记的核酸引入宿主细胞内与编码本发明的变体蛋白的核酸相同 的载体上或可引入单独载体上。可通过药物选择鉴定经引入的核酸稳定转染的细胞(例如 已经并入选择性标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡）。
[0178]蛋白质在原核生物中的表达常常在具有含有指导融合蛋白或非融合蛋白表达的 组成型启动子或诱导型启动子的载体的大肠杆菌中进行。融合载体向其中编码的蛋白质， 例如向重组蛋白的氨基末端添加了许多氨基酸。此类融合载体通常起到三种用途：1)增加 重组蛋白的表达;2)增加重组蛋白的溶解性;和3)通过在亲和纯化中起到配体的作用而有 助于重组蛋白的纯化。常常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的接合处引入蛋白 水解切割位点以使得在融合蛋白纯化之后重组蛋白能够与融合部分分离。
[0179]如本文所示，表达载体将优选含有选择性标记。此类标记包括:用于真核细胞培养 的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素或氨苄 青霉素抗性。恰当宿主的代表性实例包括细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌 (Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)和某些芽抱杆菌(Bacillus) 种，例如枯草芽孢杆菌(13.811131：；[118)、解淀粉芽孢杆菌(13.311171011卩1161^(^6118)、地衣芽孢 杆菌（B. licheniformis)和克劳氏芽孢杆菌（B.clausii);真菌细胞例如曲霉菌 (八8卩6找；111118)种，例如黑曲霉(厶.111861')、米曲霉(厶.(^5^&6)和构巢曲霉(厶.111(1111&118)， 和/或镰孢菌(Fusarium)种例如镶片镰孢菌(F · venenatum)，和/或木霉菌(Trichoderma)种 例如里氏木霉(T.reesei);酵母细胞例如克鲁维酵母菌，例如乳酸克鲁维酵母和马克斯克 鲁维酵母(K.marxianus)和/或毕赤酵母，例如毕赤氏巴斯德酵母(P.pastoris)和/或糖酵 母，例如酿酒酵母（S . cerevisiae)，和/或汉逊酵母（Hansenula)，例如多形汉逊酵母 (H.polymorpha);昆虫细胞例如果绳S2(Drosophila S2)和草地贪夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9);动物细胞例如CH0、C0S和Bowes黑色素瘤;及植物细胞。适于上述宿主细胞的培养基和 条件在本领域已知。
[0180] 优选用于细菌的载体是例如W0-Al-2004/074468(通过引用并入本文）中所公开的 那些。其它适合的载体对本领域技术人员而言是显而易见的。
[0181] 适用于本发明的已知的细菌启动子包括W0-Al-2004/074468(通过引用并入本文） 中公开的启动子。
[0182] 可通过将增强子序列插入载体中而增加高等真核生物对编码本发明的变体的DNA 的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，其在指定宿主细胞类型中起到增 加启动子转录活性的作用。增强子的实例包括位于复制起点后侧100至270bp处的SV40增强 子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
[0183] 为了使翻译的蛋白质分泌到内质网腔、细胞周质间隙或细胞外环境中，可将恰当 的分泌信号并入表达的多肽中。信号对多肽而言可以是内源的或其可为异源信号。
[0184] 本发明的变体可呈使其可包括附加异源功能区（例如分泌信号）的形式表达。本发 明的变体也可包含，例如，添加到多肽N-端的附加氨基酸(尤其是带电氨基酸)的区域，例如 用以提高在纯化期间或在后续处理和储存期间在宿主细胞内的稳定性和持久性。此外，可 向本发明的变体添加肽部分以促进纯化，例如通过添加组氨酸残基或T7标签。
[0185] 本发明的变体，例如本发明的蛋白质或其功能等同物，例如其生物活性部分和片 段，可以与非变体多肽(例如，异源氨基酸序列)可操作性连接以形成融合蛋白。关于这一点 "非变体多肽"是指具有对应于和本发明的变体乳糖酶并非基本上同源的蛋白质的氨基酸 序列的多妝。
[0186] 在融合蛋白中，本发明的变体可与本发明的多肽的全长序列或生物活性片段相对 应。在一个优选实施方式中，本发明的融合蛋白包含至少两个生物活性部分。在融合蛋白 中，术语"可操作性连接"旨在表明变体多肽和非变体多肽以符合读码框的方式相互融合。 非变体多肽可与变体多肽的N-端或C-端融合。
[0187] 可通过使变体呈融合蛋白的形式表达而增强变体乳糖酶的表达和分泌。关于这一 点，核酸序列可编码包含乳糖酶的融合蛋白。更具体地，融合伴侣可为葡糖淀粉酶或其片 段。在一个实施方式中，乳糖酶或其融合蛋白经过宿主细胞膜分泌。
[0188] 例如，在一个实施方式中，融合蛋白是其中变体序列与GST序列的C-端融合的融合 蛋白。此类融合蛋白可促进根据本发明的重组变体的纯化。在另一个实施方式中，融合蛋白 是在其N-端含有异源信号序列的本发明的变体。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物和酵母宿 主细胞)中，可通过使用异源信号序列而增加本发明的变体的表达和/或分泌。
[0189]在另一实例中，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可用作异源信号序列（Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编，John Wiley&Sons，1992)。真核异源信 号序列的其它实例包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列（Stratagene;La Jolla， California)。再一实例中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等人，同 上）和蛋白质A分泌信号（Pharmacia Biotech;Piscataway，New Jersey)。
[0190] 信号序列可用于促进本发明的变体的分泌和分离。信号序列通常特征在于疏水性 氨基酸的核，其通常在分泌期间在一个或多个切割事件中从成熟蛋白上被切割掉。此类信 号肽含有在其通过分泌途径时允许信号序列从成熟蛋白上被切割掉的加工位点。信号序列 可指导变体分泌，例如从转化进表达载体的真核宿主分泌，信号序列可随后或同时被切割 掉。然后可通过已知方法容易地从胞外介质纯化本发明的变体。或者，可使用促进纯化的序 列，例如用GST结构域将信号序列连接到目标变体上。因此，例如，编码本发明的变体的序列 可与标记序列，例如编码促进本发明融合变体的纯化的肽的序列融合。在本发明这个方面 的某些优选实施方式中，标记序列为六-组氨酸肽，例如PQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的标 签，其中，许多在市场上可买到。如Gentz等人，Proc. Natl .Acad. Sci .USA 86:821-824 (1989)中所述，例如，六-组氨酸提供了对融合蛋白的方便纯化。HA标签是用于纯化的另一 种肽，其与已经由例如Wi 1 son等人，Ce 11 37:767 (1984)描述的源自流感病毒血凝素蛋白的 表位相对应。
[0191] 本发明的融合蛋白可通过标准的重组DNA技术生成。例如，根据常规技术将编码不 同多肽序列的DNA片段以符合读码框的方式连接在一起，例如通过采用平末端或交错切口 末端进行连接，采用限制性酶消化以提供适当末端，视情况而定填充粘性末端，采用碱性磷 酸酶处理以避免不期望的连接，及采用酶促连接。在另一实施方式中，可通过常规技术包括 自动化DNA合成仪合成融合基因。或者，可以使用锚定引物来对基因片段进行PCR扩增，所述 引物能在两个连续的基因片段之间产生互补突出端，随后可以进行退火和再次扩增以产生 嵌合基因序列（参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology，编辑Ausubel等人 John Wiley&Sons: 1992)。而且，已经编码融合部分(例如，GST多肽)的许多表达载体在市场 上可买到。可将编码变体的核酸克隆到此类表达载体中，使得融合部分以符合读码框的方 式与所述变体连接。
[0192] 术语"功能等同物"和"功能变体"在本文中可交换使用。根据本发明的功能等同物 是编码表现出如本文所定义的变体的特定功能的多肽的经分离的DNA片段。因此功能等同 物也涵盖生物活性片段并且本身涵盖在本发明的术语"变体"中。
[0193] 优选地，本发明的功能等同物包含本文所述的一个或多个取代。然而，除上述取代 外，功能等同物可包含一个或多个修饰。
[0194] 功能核酸等同物通常可含有沉默突变或不改变编码的多肽的生物学功能的突变。 因此，本发明提供了编码含有对特定生物活性并非必需的氨基酸残基的变化的变体乳糖酶 蛋白的核酸分子。此类变体蛋白在氨基酸序列上不同于它们所来源的亲本乳糖酶序列，而 保持其至少一种生物活性，优选地它们至少保持乳糖酶活性。在一个实施方式中，经分离的 核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含与参考氨基酸序列（例如SEQ ID 吣:2中所示的序列）至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高同源的基本上同源的氨基酸序列。
[0195] 如本文所定义，术语"基本上同源"是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够或最小 数量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同（例如，具有类似侧链）的氨基酸或核苷酸， 使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同结构域。例如，含有具有约60%，优选65%， 更优选70%，甚至更优选75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或更 高的共同结构域的氨基酸或核苷酸序列本文定义为足够相同。
[0196] 技术人员将认识到，可通过突变向根据本发明的核苷酸序列引入变化，从而在所 得蛋白质的氨基酸序列中产生变化，而基本上不改变此类蛋白质的功能。
[0197] 因此，本发明的乳糖酶变体优选为包含与参考氨基酸序列（例如SEQ ID N0:2中所 示的序列）至少约 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 更高同源的氨基酸序列的蛋白质，并且通常还保持了参考多肽的至少一种功能活性。也可 (例如)通过筛选本发明蛋白质的突变体，例如截短突变体的组合文库的乳糖酶活性而鉴定 本发明的变体，例如根据本发明的蛋白质的功能等同物。在一个实施方式中，通过在核酸水 平上的组合诱变产生变体的多样化文库。通过(例如)将合成寡核苷酸混合物酶促连接到基 因序列中，使得一组简并的潜在蛋白质序列可作为单独多肽或者作为一组更大的融合蛋白 (例如对于噬菌体展示而言)表达，从而产生变体的多样化文库。存在可以用于由简并寡核 苷酸序列产生本发明多肽的潜在变体文库的各种方法。合成简并寡核苷酸的方法在本领域 已知（参见，例如，Narang( 1983 )Tetrahedron 39 : 3 ; Itakura 等人（1984) Annu .Rev.Biochem.53:323; Itakura等人（1984)Science 198:1056;Ike 等人（1983) Nucleic Acid Res.ll:477)〇
[0198] 另外，编码本发明多肽的序列的片段文库可用于产生多样化的多肽群用于筛选随 后的变体选择。例如，可以如下产生编码序列片段的文库:通过在其中每个分子大约仅发生 一次切刻的条件下用核酸酶处理目标编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性 以形成可包括来自于不同切刻产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理从重新 形成的双链体去除单链部分，并且将所得片段文库连接到表达载体中。通过这种方法，可得 到编码目标蛋白质不同大小的N-端和内部片段的表达文库。
[0199] 在本领域中已知有几种技术用于筛选通过截短的点突变而产生的组合文库的基 因产物，和用于筛选cDNA文库中具有选定特性的基因产物。用于筛选大基因文库的、适用于 高通量分析的、最广泛使用的技术通常包括:将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所 得载体文库转化适当的细胞，和在下述条件下表达组合基因，所述条件下期望活性的检测 促进编码其产物被检测到的基因的载体的分离。递归整体诱变（Recursive ensemble mutagenesis，REM)，一种增强文库中功能突变体频率的技术，可以与筛选试验组合使用以 鉴定本发明蛋白质的变体(Arkin和Yourvan( 1992)Proc ·Natl · Acad· Sci ·USA 89 : 7811-7815 ;Delgrave等人（1993)Protein Engineering6(3): 327-331) 〇
[0200] 根据本发明的多核苷酸的片段还可包含不编码功能性多肽的多核苷酸。此类多核 苷酸可起到用于PCR反应的探针或引物的作用。
[0201] 根据本发明的核酸，不管它们是否编码功能多肽或非功能性多肽，均可用作杂交 探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有乳糖酶活性的多肽的本发明核酸分子的用 途尤其包括(1)与中期染色体涂片原位杂交(例如FISH)以提供乳糖酶编码基因的精确染色 体定位，如Verma等人，Human Chromosomes : a Manual of Basic Techniques，Pergamon ?^88，如*￥〇4(1988)所述；（2州〇1'1:1161'11印迹分析，用于检测乳糖酶1111?祖在特定组织和/ 或细胞中的表达;和(3)可作为诊断工具使用的引物和探针，以分析能在给定的生物(例如， 组织)样品中与此类探针或引物杂交的核酸是否存在。
[0202]可通过以下标准程序获得给定参考乳糖酶的变体：
[0203]-变体的合成或诱变（易错、掺杂寡核苷酸(doped oligo)、示踪寡核苷酸（spiked oligo))
[0204] -在例如大肠杆菌或乳酸克鲁维酵母中转化
[0205] -转化株的培养、转化株的选择
[0206] -表达
[0207] -任选的纯化和浓缩
[0208] -初步筛选
[0209] -改良变体(例如，关于比活性)的鉴定。
[0210] 在一个实施方式中，本发明涉及一种生产根据本发明的乳糖酶多肽变体的方法， 所述方法包括：
[0211] a)选择参考乳糖酶多肽；
[0212] b)取代对应于 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、 862或1004中的任一个的至少一个氨基酸残基，
[0213] 所述位置参照SEQ ID N0:2定义；
[0214] c)任选地取代如b)中所限定的一个或多个另外的氨基酸；
[0215] d)制备由步骤a)_c)产生的变体；
[0216] e)确定所述变体的特性，例如如实施例中所示；
[0217] f)选择与参考乳糖酶多肽相比具有改变的特性的变体，并且其中所述变体与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0218] 在生产根据本发明的乳糖酶多肽变体的方法中的优选实施方式中，参考乳糖酶多 肽具有SEQ ID N0:2中列出的序列。
[0219] 更优选地在根据本发明的方法的步骤b)中，取代对应于
[0220] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004中的 任一个的至少一个氨基酸残基，
[0221] 所述位置参照SEQ ID N0:2定义。参考多肽可与SEQ ID N0: 2具有至少约80%同源 性。
[0222] 在另一个实施方式中，本发明特征在于含有本发明所涵盖的核酸的细胞，例如经 转化的宿主细胞或重组宿主细胞。"经转化的细胞"或"重组细胞"是已经借助于重组DNA技 术向其中（或向其祖代中）引入了根据本发明的核酸的细胞。包括原核细胞和真核细胞两 者，例如，细菌、真菌、酵母等，特别优选来自于酵母，例如乳酸克鲁维酵母的细胞。宿主细胞 还包括但不限于哺乳动物细胞系如CH0、VER0、BHK、HeLa、C0S、MDCK、293、3T3、WI38和脉络丛 细胞系。
[0223] 适合的细菌宿主生物的实例为革兰氏阳性细菌种例如芽孢杆菌科 (Bacillaceae)，包括枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、迟缓芽抱杆菌(Bacillus lentus)、短芽抱杆菌(Bacillus brevis)、嗜热 脂肪芽抱杆菌（Bacillus stearothermophilus)、嗜喊芽抱杆菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amylol i quefaci ens)、凝结芽抱杆菌 (Bacillus coaguIans)、环状芽抱杆菌(Bacillus circuIans)、灿烂芽抱杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium)和苏云金芽抱杆菌（Bacillus thuringiensis);链霉菌种例如鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus);乳酸细菌种包括乳 球菌(Lactococcus spp·)例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，乳杆菌(Lactobacillus spp.)包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)和链球 菌（S t r e p t o c o c c u s s p p . ) 或者，可选择革兰氏阴性细菌种例如属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)，包括大肠杆菌或属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的种的菌株 作为宿主生物。
[0224] 适合的酵母宿主生物可有利地选自糖酵母种，包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)或属于裂殖酵母(Schizosaccharomyces)的种。其它有用的酵母宿主生物包括 毕赤酵母，例如其甲醇营养型种，包括毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)，和克鲁维酵 母菌，包括乳酸克鲁维酵母。
[0225] 丝状真菌中的适合宿主生物包括支顶孢菌属（Acremonium)、曲霉菌属 (Aspergillus)、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉菌 属（17〇01；[(^1^0^)、脉孢菌属（^111'08。0^)、青霉菌属（？611；!_(3；!_11；!_11111)、梭孢壳属 (Thielavia)、弯颈霉属（Tolypocladium)或木霉属（Trichoderma)的种，例如棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori )、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉 (Aspergillus nidu Ians)或黑曲霉（Aspergillus niger)，包括黑曲霉泡盛变种 (Aspergillus nigervar.awamori)、杆抱状镜抱菌（Fusarium bactridioides)、谷物镜抱 菌（Fusarium cereals)、克鲁克威尔镜抱菌（Fusarium crookwellense)、黄色镜抱菌 (Fusarium culmorum)、禾谷镜抱菌（Fusarium graminearum)、禾镜抱菌（Fusarium graminum)、异抱镜抱菌（Fusarium heterosporum)、合欢木镜抱菌（Fusarium negundi)、尖 抱镜抱菌（Fusarium oxysporum)、多枝镜抱菌（Fusarium reticula turn)、粉红镜抱菌 (Fusarium roseum)、接骨木镜抱菌（Fusarium sambucinum)、肤色镜抱菌（Fusarium sarcochroum)、拟枝抱镜抱菌（Fusarium sporotrichiodes)、硫色镜抱菌（Fusarium sulphureum)、圆镜抱菌（Fusarium torulosum)、拟丝抱镜抱菌（Fusarium trichothecioides)、镶片镜抱菌（Fusarium venena turn)、特异腐质霉（Humi co la insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola langinosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉 (Myceliophtora thermophi la)、粗糖脉抱菌（Neurospora crassa)、产黄青霉菌 (Penicillium chrysogenum)、沙门桕干酪青霉菌（Penicillium camenbertii)、产紫青霉 菌（Penicillium purpurogenum)、米黑根毛霉菌（Rhizomucor miehei)、太瑞斯梭抱壳霉 (Thielavia terestris)、哈茨木霉（Tricho-derma harzianum)、康氏木霉（Trichoderma koningii)、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesii) 或绿色木霉(Trochoderma viride)。
[0226] 可以对宿主细胞加以选择，选出能调节插入序列表达的宿主细胞或能以特异性 的、期望的方式对并入的核酸序列的产物进行修饰或加工的宿主细胞。蛋白质产物的此类 修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可促进编码的蛋白质的最佳功能。
[0227] 多种宿主细胞都具有特征性的及特异性的机制，用于对蛋白及基因产物的翻译后 加工和修饰。可以选择分子生物学和/或微生物学领域中技术人员所熟悉的恰当细胞系或 宿主系统以确保对表达的外源蛋白质的修饰和加工是令人期望的及正确的。为了这个目 的，可以使用具有胞内加工机制的真核宿主细胞，所述机制用于对初级转录本的正确加工、 对基因产物的糖基化和磷酸化。此类宿主细胞在本领域公知。
[0228] 如果期望的话，经稳定转染的细胞系可产生根据本发明的变体。许多适于稳定转 染哺乳动物细胞的载体公开可用，构建此类细胞系的方法也公知，例如在Ausubel等人中 (同上）。
[0229] 本发明还公开了包含根据本发明的乳糖酶变体的组合物。因此本发明提供了组合 物，其包含如本文所述的变体多肽和选自盐（如氯化钠或氯化钾）、防腐剂、多元醇（如甘 油）、金属离子(如镁或锰离子)的至少一种组分。
[0230] 所述组合物可任选地包含其它成分，例如其它酶。此类组合物可包含本发明的变 体多肽或通过本发明的鉴定变体乳糖酶的方法能够获得的变体多肽。
[0231] 除变体乳糖酶和一种或多种另外的酶(若存在）以外，根据本发明的组合物可包含 常规上用于乳糖酶制备的添加剂，例如KC1或甘油。
[0232] 本发明还涉及在乳制品的制备中本发明的变体多肽或本发明的组合物的用途。
[0233] 本发明还涉及生产乳制品的方法，所述方法包括向乳中添加有效量的本发明的变 体多肽或组合物并且使所述变体多肽发挥其酶活性。
[0234] 本发明涉及能够通过此类方法获得的乳制品。
[0235] 在本文中使用时，乳制品涵盖由乳生产的任何组合物，例如酪蛋白和/或乳清蛋 白。实例为乳、乳源性产品、发酵乳制品（例如酸奶）、炼乳、UHT乳、淡乳、乳粉、冻乳、冰淇淋、 乳酪、黄油、酪乳、乳清和/或干酪。产品也可为水解产物或通过分馏乳或乳清获得的产品， 如酪蛋白酸盐、乳蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)或(浓缩的）乳 清渗透液及由其制得的产品。
[0236] 乳例如获自奶牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、驴、马、驯鹿、盤鹿或牦牛。
[0237] 本文对作为现有技术给出的专利文件或其它材料的引用不得视为承认截至任何 权利要求的优先权日，该文件或材料已知或其所含信息是公知常识的一部分。
[0238] 现将参考以下实施例阐明本发明，然而本发明不限于以下实施例。 实施例
[0239] 一般材料和方法
[0240] 分子和遗传学技术
[0241 ] 标准遗传学和分子生物学技术在本领域已知（例如Maniat is等人" Molecular cloning:a laboratory manual"（1982)Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；Miller'Experiments in molecular genetics"（1972)Cold Spring Harbor Laboratory ,Cold Spring Harbor，Ν·Υ· ; Sambrook和Russell''Molecular cloning: a laboratory manual"（第3版）''（2001 )Cold Spring Harbor Laboratory ,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel"Current protocols in molecular biology"（1987) Green Publishing and Wiley Interscience，New York)〇
[0242] 质粒和菌株
[0243] 从Invitrogen?(LifeTechnologies Corporation，Carlsbad，CA，USA)获得pBAD/ HisAJ-半乳糖苷酶缺陷型菌株大肠杆菌BW25113( Δ (araD-araB)567、Δ lacZ4787(:: ι·;τηΒ-3)、λ-、rph_l、Δ (rhaD-rhaB)568、hsdR514)(Datsenko KA、Wanner BL(2000)Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645)用于表达乳酸克鲁维酵母菌β-半乳糖苷酶变体。
[0244] 培养基
[0245] 2χΡΥ培养基（16g/l BD BBL?Phytone?蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl)用 于大肠杆菌生长。补充抗生素 （l〇〇μg/ml氨苄青霉素）以维持质粒。为了诱导基因表达使用 0.02 %最终浓度的L-阿拉伯糖。
[0246] 实施例1 :DNA构建体和转化
[0247] 将合成DNA构建体设计成以产生Ncol相容性突出端的Bbsl限制位点开始并且以在 终止密码子之后产生Hindlll相容性突出端的Bbsl限制位点结束。在合成DNA构建体的设计 中去除了内部Bbsl限制位点。作为一个示例，编码野生型乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶序 列的DNA片段作为SEQ ID Ν0:1列出。所有变体以类似方式设计并且在表达载体pBAD/HisA 的Ncol/Hindlll位点中作为Bbsl片段克隆。
[0248] 表2中描绘了在14种变体中引入的氨基酸变化。与野生型乳酸克鲁维酵母β-半乳 糖苷酶氨基酸序列（SEQ ID Ν0:2)比较，指出了变化的位置。一些变体有引入到β-半乳糖苷 酶蛋白的氨基酸序列中的多个变化，如变体#8和#7。编码无变化的β-半乳糖苷酶蛋白的野 生型基因也用于基因克隆和转化并且之后用于和用变体基因产生的酶比较。
[0249] 表2:引入乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶的蛋白质序列中的氨基酸变化。根据单字 母表示法示出氨基酸。
[0251 ] 大肠杆菌BW25113的转化使用Zymo Research Z-Competent?大肠杆菌转化试剂盒 和缓冲液套组(T3001)进行。将经转化的大肠杆菌菌株涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素、 0.02 %L-阿拉伯糖和40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲噪基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)的2xPY琼 脂板上，并且在30°C下培育过夜。
[0252] X-gal为乳糖类似物，并且被β-半乳糖苷酶水解。X-gal在被β-半乳糖苷酶切割时 产生半乳糖和5-溴-4-氯-3-羟基吲哚。然后后者自发地二聚并且氧化成5，5 二溴-4，4 ' -二氯-靛蓝，5，5 二溴-4，4 二氯-靛蓝是一种不溶性深蓝色产物。将所述板储存在4°C下 至少24小时以允许在X-Gal水解后蓝色形成。因为野生型大肠杆菌菌株BW25113由于lac操 纵子缺失而缺乏β-半乳糖苷酶活性，所以蓝色的形成证实了所选β-半乳糖苷酶变体的活性 表达。每种构建体中，使用小规模24孔培养(实施例2)检测到三种形成蓝色的转化株的β-半 乳糖苷酶生成，并且选择最佳的生产转化株以进行进一步的酶表征。
[0253] 实施例2: β-半乳糖苷酶样品的培养和制备
[0254] 将表达变体β-半乳糖苷酶基因的大肠杆菌BW25113转化株从琼脂板复制到具有 200μ1 2*ΡΥ和 100μg/ml氨苄青霉素的96宽孔板中（NUNC 267334，NUNC A/S，Roskilde, Denmark)，接着在30°C、550rpm和80%湿度下在INFORS HT Microtron振荡器（Infors AG, Bottmingen,Switzerland)中过夜培育。用来自于这些预培养物的15μ1接种包含3ml 2*PY 与100取/1111氨苄青霉素的24孔板(4乂￥6?01101^24(^105,417861/'(：〇?1丨即，附 148311]5八）。 用呼吸密封材料(6786051，greiner bi〇-〇ne，Frickenhausen，Germany)覆盖24孔板并且在 30°(：、550印111和80%湿度下在1呖01?册]^(^〇让〇11振荡器中培育，直至达到0.4-0.6的 60011111光密度。然后，添加1^-阿拉伯糖至0.02%的最终浓度并且在20°(：、750印111和80%湿度 下在INF0RS HT Microtron振荡器中进一步培育24孔板20-24小时。在2750rpm和4°C下离心 24孔板10分钟并且通过倾析所述板而去除上清液。将获得的细胞团块储存在-20°C下至少 24小时。通过利用涡旋使冷冻细胞团块重新悬浮在lml提取缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5、0.2mM MgS04、2mg/ml溶菌酶、0.1mg/ml DNAse I、lx完全蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA，Roche))中，在室温下培育30分钟，接着在2750rpm和4°C下离心10分钟。通过添加1体 积的甘油配制包含过表达的β-半乳糖苷酶(无细胞抽提物，CFE)的上清液并用于不同活性 测定中。
[0255] 实施例3:乳糖酶蛋白量的测定
[0256] 使用HP-SEC(Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000Rapid Separation)测 定大肠杆菌产生的乳糖酶蛋白的量。为此将2μ1实施例1的无细胞提取物(CFE)装到BEH200， 8〇(：1.7以1114.6乂15〇1]11]1柱(￥3七6^)上。流动相由10〇11^[磷酸钾缓冲液(。!17.32)组成并且保 持在0. lmL/min的流量下。柱温保持在25°C，而流量设为0. lmL/min。在蛋白质洗脱后，测量 在280nm下的吸光度。因为乳糖酶蛋白比CFE中大多数其它蛋白更大，所以它是在这些条件 下从柱上洗脱的第一个蛋白峰。计算这个峰下的面积并且通过与牛血清白蛋白（BSA)标准 品比较而量化。如实施例4-7中所述，该量化结果用于计算蛋白质的（比)活性。
[0257] 表3A:在实施例4-7中描述的各种测定中对变体(比)活性的分析结果。标记了显著 (p〈0.05)高于或低于(抑制％)野生型乳糖酶(6个样品)平均值的值。
[0259] 表3B:在实施例4-7中描述的各种测定中对变体(比)活性的分析结果。表3A的值表 示为与相同测定中野生型酶的值比较的相对值。
[0260]
[0261] 实施例4:针对作为底物的0NPG的活性测定
[0262] 使用邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(0NPG)作为底物的活性测定基本上按照食品化 学药典（Food Chemical Codex)(FCC 第8版，第1319-1320 页：Lactase(neutral)0_ galactosidase activity)中描述的过程。
[0263] 使用缓冲液A(含有0.05mM EDTA、0.1mM MgS04和0.2%(W/V)Triton Π 00的 100mM 磷酸钾(pH6.5))稀释实施例2中产生的样品200倍，直至约0.1个中性乳糖酶单位(NLU)/mL。 使用相同但无 Triton X100的缓冲液制备底物(20mL中50mg的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 (Sigma-Aldrich))。预热底物后，将以下材料混在一起：125yL底物和25yL样品。允许反应在 37 °C下进行10分钟，之后通过添加25yL碳酸钠（30g/L)和20yL超纯水终止反应。所得405nm 下的吸光度可以使用并且与由邻硝基苯酚(0ΝΡ)制得的校准曲线比较。在Konelab临床分析 仪(Thermo Scientific Arena 30)上进行测量。如食品化学药典中所述进行活性的计算并 且校正测定温度的差异。校正系数为1.25并且根据经验确定。通过将这些值除以测定中的 蛋白质剂量(如实施例3中所述)测定不同乳糖酶变体的比活性并且在表3中描绘了结果。 [0264] 实施例5:针对作为底物的乳糖的活性测定
[0265] 于缓冲液B(含有0.05mM EDTA和ImM MgS04的100mM磷酸钠 (pH6.5))中将样品稀释 至约0.4NLU/mL。底物由4.8 %溶于缓冲液B中的乳糖一水合物组成。酶混合物由在总计10mL 缓冲液B中的780个单位的辣根过氧物酶(Sigma Aldrich)、0.25个单位的葡萄糖氧化酶 (DSM)和12.51^(+/-111^)2,2/-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐以8了3,3丨 8111& Aldrich)组成。测定是相对于中性乳糖酶的连续稀释液(0.1-0.8NLU/mL)测量。为了使反应 发生，将以下材料转移到标准微量滴定板的一个孔:25yL缓冲液B、25yL样品或标准品、25yL 酶混合物。预培育10分钟后，添加175yL底物并且在MTP读数器(Tecan Infinity M1000)上 在420nm和30°C下测量反应30分钟。每30秒测量吸光度并且计算每5个数据点（2.5分钟）的 斜率。使用整个测定中的最大斜率计算活性。这个最大斜率表示为在此处描述的条件下每 分钟乳糖酶产生的葡萄糖μπιο?数(LACU)。通过将这些值除以测定中的蛋白质浓度(mg/ml) (如实施例3中所述)计算不同乳糖酶变体的比活性。表3中描绘了这些乳糖酶变体的比活性 (LACU/mg)。针对乳糖的高比活性可导致酶在可能应用中的剂量更低。
[0266] 实施例6:在半乳糖存在下的活性测定
[0267] 于缓冲液B中将样品稀释至约0.4NLU/mL。底物由4.8 %溶于缓冲液B中的乳糖一水 合物组成。酶混合物由在总计10 m L缓冲液B中的7 8 0个单位的辣根过氧物酶（S i g m a Aldrich)、0.25个单位的葡萄糖氧化酶(DSM)和12.511^(+/-111^)2,2^连氮基-双(3-乙基苯 并噻唑啉-6 -磺酸）二铵盐(A B T S，S i g m a A1 d r i c h)组成。抑制缓冲液C由在缓冲液B中的 1500mM半乳糖(纯度>99.9% )组成。测定是相对于中性乳糖酶的连续稀释液(0.1-0.8NLU/ mL)测量。为了使反应发生，将以下材料转移到标准微量滴定板的一个孔:25yL缓冲液C(除 标准品以外）、25yL样品或标准品、25yL酶混合物。预培育10分钟后，添加175yL底物并且在 MTP读数器上在420nm和30 °C下测量反应30分钟。每30秒测量吸光度并且计算每5个数据点 的斜率。使用整个测定中的最大斜率计算活性。这个最大斜率表示为在此处描述的条件下 每分钟乳糖酶产生的葡萄糖μπιο?数(LACGU)。通过将这些值除以测定中的蛋白质浓度(mg/ ml)(如实施例3中所述)计算不同乳糖酶变体的比活性(LACGU/mg)并且结果示于表3中。
[0268] 使用下式计算半乳糖抑制百分比
[0269] 抑制 ％ = 100*(x_y)/x
[0270] 其中X代表如实施例5中所述的以LACU/mg乳糖酶计的比活性，并且y代表如实施例 6中所述的以LACGU/mg乳糖酶计的比活性。表3中示出了抑制％的计算结果。当需要低残留 乳糖浓度时，在乳糖酶浓度低且半乳糖浓度高的应用中的条件下低抑制％可导致更高活 性。
[0271] 实施例7:在低温乳中的活性测定
[0272] 在深孔微量滴定板中将lmL商业半脱脂UHT乳(Campina)与0.2mL在实施例2中产生 的酶（约20NLU/mL)混合。在静态条件下在6°C下培育样品4、24或48小时。在这样培育之后， 通过在90°C下热处理6分钟而终止反应，之后将样品直接置于-20°C的冰箱中直至进行分 析。用于匪R的样品制备如下进行：添加48yL 4.0M HC1，然后密封所述板并通过倾斜而混 合。然后，在600rpm下振荡所述板20分钟并且随后在4750rpm下离心10分钟。从清澈上清液 转移0.3mL到新板中并与0.2mL于D 20中含有20g/L马来酸（内标)和40g/L EDTA的溶液合并。 密封为所述板，通过倾斜而混合并短暂离心。冻干后，将残渣溶于〇.〇5mL D20中并重复冻 干。将干燥的残渣溶于〇.7mL D20中，再冻干过夜并且再溶于0.7mL D20中。小心混合后，在 4750rpm下离心样品10分钟并将0.6mL转移到NMR管中。在配备有冷冻探针的在700MHz的质 子频率下在290K的探针温度下工作的Bruker Avance III分光计上测量样品。使用8次扫描 和30秒延迟单次测量样品。由匪R谱，量化了下列化合物：乳糖（δ = 4.67(d))、葡萄糖δ = 4.64(d)、半乳糖δ = 4.58(d)和半乳-寡聚糖(G0S，从δ = 4.52至大约δ = 4.38的面积的积 分）。在表3中，指出了每mg添加的酶在培育4小时后检测到的葡萄糖的量。也描绘了48小时 后，当大部分乳糖水解且剩下少许残留乳糖(<〇.5g/l)时，检测到的GOS的量。
[0273] 酶在低温(4-12Γ)乳中高乳糖水解活性可引起在与乳品工业相关的此类应用中 酶的剂量减少，并且因此成本减少。G0S产量增加可引起生产的乳的益生元效果。
[0274] 实施例8:乳糖酶变体的组合
[0275] 如实施例1中所述产生乳糖酶基因中突变的不同组合，例外是:多个氨基酸变化组 合在基因构建体的表达产物中。表4中描绘了含有这些组合氨基酸变化的不同变体。与野生 型乳酸克鲁维酵母半乳糖苷酶氨基酸序列（SEQ ID N0:2)比较，指出了变化的位置。 [0276] 表4:引入乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶蛋白质序列中的氨基酸变化。根据单字母 表示法示出氨基酸。
[0278] 同样，经修饰的乳糖酶基因在大肠杆菌中表达并且如实施例2中所述分离乳糖酶 蛋白。如实施例3中所述测定表达的乳糖酶蛋白的量。如实施例5中所述测定这些酶样品对 乳糖水解的活性并且与以完全相同的方式表达和分离的野生型酶的活性比较。还如实施例 7中所述测定4小时后在低温乳中酶样品对乳糖水解的活性。
[0279] 通过将测量值除以测定中的乳糖酶蛋白浓度(mg/ml)而计算不同乳糖酶变体的比 活性。将两项测定中这些乳糖酶变体的比活性表示为与在相同测定中获得的野生型酶的活 性相比较的相对活性。为此在两项测定中将野生型乳糖酶的比活性设为100,并且计算的变 体的比活性相对于此。表5中描绘了这项分析的结果。
[0280] 表5:在各项测定中变体(比）活性的分析结果。将值描绘为相对于用野生型乳糖酶 发现的值。标记了显著(P〈〇.05)高于野生型乳糖酶平均值的值。
[0281]
[0282]由这项分析可以得出：几种组合变体在两项测定中均显示出有利的乳糖水解。
【主权项】
1. 一种具有乳糖酶活性的变体多肽，其中所述变体具有下述氨基酸序列，在与包含SEQ ID NO: 2中列出的序列的乳糖酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于第 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨基酸 中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代， 所述位置参照SEQ ID N0:2定义并且其中所述变体与具有乳糖酶活性的参考多肽相比 具有一种或多种改变的特性并且其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少80%序列同一性。2. 根据权利要求1所述的变体多肽，其中所述参考多肽为SEQ ID NO:2的乳糖酶。3. 根据权利要求1或2所述的变体多肽，其中所述变体多肽为非自然存在的多肽。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的变体多肽，其中所述变体与具有乳糖酶活性的参 考多肽相比针对ONPG展示出增加的比活性。5. 根据权利要求4所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID N0:2中列出 的序列比对时，所述氨基酸序列包含对应于第415、483、619、621、622或633位氨基酸中的任 一个的氨基酸残基的至少一个取代。6. 根据权利要求4或5所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID N0:2中列 出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自T415C、T415A、A483S、V619I、I621V、M622U^ T633G的至少一个取代。7. 根据权利要求1-3中任一项所述的变体多肽，其中所述变体与具有乳糖酶活性的参 考多肽相比针对乳糖展示出增加的比活性。8. 根据权利要求7所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID N0:2中列出 的序列比对时，所述氨基酸序列包含对应于第415、440或483位氨基酸中的任一个的氨基酸 残基的至少一个取代。9. 根据权利要求7或8所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO: 2中列 出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自T415C、T415A、Y440F或A483S的至少一个取代。10. 根据权利要求1-3中任一项所述的变体多肽，其中所述变体与具有乳糖酶活性的参 考多肽相比针对乳中的乳糖展示出增加的比活性。11. 根据权利要求10所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO: 2中列 出的序列比对时，所述氨基酸序列包含对应于第233、257、258、263、274、284、297、440、619、 633、862或1004位氨基酸中的任一个的氨基酸残基的至少一个取代。12. 根据权利要求10或11所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID N0:2 中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自D233V、D257G、A258T、N263S、K274E、N284S、 E297G、Y440F、V619I、T633G、L862V或A1004P的至少一个取代。13. 根据权利要求10或11或12所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO: 2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自N263S、K274E或N284S的至少两个取 代。14. 根据权利要求10或11或12所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID NO: 2中列出的序列比对时，所述氨基酸序列至少包含取代D257G和E297G。15. 根据权利要求1-3中任一项所述的变体多肽，其中所述变体与具有乳糖酶活性的参 考多肽相比展示出降低的半乳糖抑制。16. 根据权利要求15所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID N0:2中列 出的序列比对时，所述氨基酸序列包含对应于第619、621或622位氨基酸中的任一个的氨基 酸残基的至少一个取代。17. 根据权利要求15或16所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID N0:2 中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自V619I、I621V或M622L的至少一个取代。18. 根据权利要求1-3中任一项所述的变体多肽，其中所述变体与具有乳糖酶活性的参 考多肽相比在乳中展示出增加的GOS产量。19. 根据权利要求18所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID N0:2中列 出的序列比对时，所述氨基酸序列包含对应于第619或622位氨基酸中的任一个的氨基酸残 基的至少一个取代。20. 根据权利要求18或19所述的变体多肽，其包含下述氨基酸序列，在与SEQ ID N0:2 中列出的序列比对时，所述氨基酸序列包含选自V619I或M622L的至少一个取代。21. 根据前述权利要求中任一项所述的变体多肽，其包含除权利要求1中限定的取代以 外的附加取代。22. 根据前述权利要求中任一项所述的变体多肽，其与SEQ ID NO: 2具有至少80%序列 同一,性。23. -种核酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项所述的变体多肽。24. -种核酸构建体，其包含与能够指导乳糖酶在合适表达宿主中的表达的一个或多 个控制序列可操作性连接的权利要求23所述核酸序列。25. -种重组表达载体，其包含权利要求24所述核酸构建体。26. -种重组宿主细胞，其包含权利要求25所述表达载体。27. -种生产乳糖酶的方法，其包括在有助于所述乳糖酶生成的条件下培养权利要求 26所述宿主细胞并且回收所述乳糖酶。28. -种生产乳糖酶多肽变体的方法，所述方法包括： (a) 选择具有乳糖酶活性的多肽； (b) 取代对应于 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862 或1004位氨基酸中的任一个的至少一个氨基酸残基，所述位置参照SEQ ID N0:2定义； (c) 任选地取代如(b)中所限定的一个或多个另外的氨基酸； (d) 制备由步骤(a)-(c)产生的变体； (e) 确定所述变体的特性； (f) 选择与(a)所述多肽相比具有改变的性质的变体，从而生产乳糖酶多肽变体。29. -种组合物，其包含根据权利要求1-22中任一项所述的变体多肽或通过根据权利 要求28所述的方法能够获得的变体多肽及选自盐、防腐剂、多元醇或金属离子的至少一种 组分。30. 根据权利要求1-22中任一项所述的变体多肽或根据权利要求29所述的组合物在低 乳糖或无乳糖乳制品的制备中的用途。31. -种生产乳制品的方法，所述方法包括向乳制品中添加有效量的根据权利要求1-22中任一项所述的变体多肽或根据权利要求29所述的组合物并且使所述多肽发挥其酶活 性。32. -种乳制品，其能够通过权利要求31所述的方法或通过根据权利要求30所述的用 途获得。
【文档编号】C12N9/38GK105899659SQ201580004344
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】芮妮.马赛尔.钟.德, 乌尔丽克.玛利亚.穆勒, 彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞斯·蒂克尔
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司