用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法
【专利摘要】公开了用于检测来自人受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的系统和方法，其中所述受试者的细胞(例如上皮)附着于基片的尖端。将基片的尖端在裂解溶液中搅动，所述裂解溶液裂解附着于基片的细胞。当该搅动完成时从裂解溶液移出基片。温育所得裂解溶液，然后从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液。从这之中，使用至少两个寡核苷酸引物对和gDNA溶液鉴定出人TGFpI基因中存在的至少两个核苷酸的身份。这至少两个核苷酸位于TGFpI基因的分别的独立位置，其对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。
【专利说明】用于与眼科状况有关的等位基因的多重检测的方法 发明领域
[0001] 本申请一般涉及用于分离和检测疾病有关的遗传等位基因的方法。具体地，本申 请涉及用于检测Avellino角膜营养不良有关的等位基因的改进的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 实时PCR可用于检测具有基本相同序列的核酸序列之间的差异。通过使用差异标 记的荧光核酸探针(例如一种结合野生型序列而一种结合突变体序列），能快速并可靠地检 测人基因组中的单核苷酸变化。这种解析能力已被应用于医学诊断，其中单核苷酸多态性 (SNP)，即在蛋白质的编码和/或非编码序列中发现的单碱基变化，与人疾病相关。
[0004] 然而，实时PCR分析高度依赖于高质量样品的收集和分离。不良样品收集和/或分 离需要使用更长的测定条件和更大量的实时PCR试剂，两者都导致增加的成本和降低的生 产力。此外，实时PCR单核苷酸多态性检测测定的失败可引起对收集额外的样品的需要，从 而导致甚至更大的时间和资源损失。
[0005]因此，高度期望产生改进的样品收集和分离的方法，其改进测定的总体成功率，减 少测定所需的试剂，且减少在后期收集额外样品的需要。此外，用于以较低样品材料量实施 实时PCR SNP检测测定的方法还将降低与高质量样品的收集和分离有关的挑战。
[0006] 角膜营养不良可以是常染色体显性的遗传疾病，其开始在患者的角膜中间具有模 糊的视力。此模糊视力逐渐蔓延至角膜周边，且视力随着患者年龄增加而恶化。有几种类型 的已表征过的角膜营养不良，包括阿维利诺(Avel 1 ino)角膜营养不良、颗粒状(Granular) 角膜营养不良、格子状I型（lattice type I)角膜营养不良、Thiel-Behnke、和Reis-bucklers角膜营养不良。已知角膜营养不良至少在一些情况中是由编码WG-H3蛋白（也称 为TGFW蛋白，TGFBI蛋白和角膜上皮蛋白）的转化生长因子beta诱导（TGFW)基因中的突变 引起的。
[0007] 患有阿维利诺角膜营养不良的杂合患者随着年龄具有增加的视力丧失，在生命的 晚年变得严重。比较而言，纯合患者到6岁龄呈现出严重到完全的视力丧失。阿维利诺角膜 营养不良首先在约1988年被认可为一种独特的角膜营养不良类型。在那时之前，其可能被 错误分类为颗粒状角膜营养不良。现今，已知阿维利诺角膜营养不良是世界范围内最常见 的间质角膜营养不良形式。在韩国，据信阿维利诺角膜营养不良具有870个人中约1的流行 率（参见Lee, J.H.等，Ophthalmic Epidemiol ·，17:160,2010;亦参见Hoi land，E · J ·等， Ophthalmology,99:1564,1992;Kennedy，S.M.等，Br.J.Ophthalmol·,80:489,1996; Dolmetsch，A.M.等，Can.J.Ophthalmol·，31:29,1996;Afshari，Ν·Α·等， Arch.Ophthalmol. , 119:16,2001 ；Stewart ,H. S.Hum.Mutat. , 14:126,1999) 〇
[0008] 之前发现杂合个体(例如，具有一个野生型WG-H3等位基因和一个突变体WG-H3 等位基因）在LASIK手术后高度易于视力丧失加剧。特别地，手术后两年时，在具有增加的攻 击性的这些患者中观察到增加的角膜不透明性，最终导致视力的完全丧失(Jun，R.M.等， Opthalmology，111:463，2004)。之前，进行眼手术，预期通过LASIK或Excimer激光手术将使 患有角膜营养不良的患者摆脱视力模糊。假定有30万例LASIK手术，则300个人会失去其视 力，基于患有阿维利诺角膜营养不良的杂合患者为1/1000的最小估测。经历LASIK手术的患 者主要在其进行生产活动的20多岁及30多岁中；因此，他们的视力丧失导致严重的社会和 经济问题。
[0009] 另外，美国2000年批准LASIK手术后，已发现经历LASIK手术的患有阿维利诺角膜 营养不良的非洲裔美国患者丧失视力，其推断许多相似的病例可发生在世界各地。
[0010] 因此，尽管为了预防由LASIK手术所致的阿维利诺角膜营养不良的进展需要对阿 维利诺角膜营养不良的准确诊断，但仅通过对角膜不透明度的显微观察(例如裂隙灯(slit lamp)检查)进行对阿维利诺角膜营养不良的诊断，因而医生经常遗漏患者的潜在症状，从 而进行LASIK手术，这导致视力丧失。因此，期望快速并准确地对角膜营养不良进行遗传诊 断。
[0011]已开发了用于检测WG-H3基因突变的DNA芯片，该突变造成阿维利诺角膜营养不 良（韩国专利早期公开号10-2007-0076532)。然而，使用DNA芯片诊断阿维利诺角膜营养不 良不利地需要几个步骤，包括扩增样品中DNA的步骤，使扩增的DNA与DNA芯片杂交的步骤， 洗涤杂交的DNA芯片的步骤，和检测阳性应答的步骤。
[0012]鉴于上述背景，本领域中需要用于检测与角膜营养不良有关的多重突变等位基因 的改进的方法。
[0013] 发明概述
[0014] 本公开提供用于检测与人疾病有关的一种或多种等位基因的改进方法。下文描述 的方法降低实施得到关于受试者的医学信息的测定法相关的时间和成本。例如，在一些实 施方案中，所述改进的方法允许以对患者的降低的成本，同日检测与阿维利诺角膜营养不 良有关的基因组标志物。
[0015] 在一些实施方案中，本公开提供用于检测来自受试者的样品中与角膜营养不良有 关的至少两种基因组等位基因的方法，所述方法包括：（A)提供受试者的上皮细胞，其附着 于基片的尖端；（B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的 细胞；（C)在完成(B)搅动时，从裂解溶液移出该基片；（D)在(C)移出后温育该裂解溶液；（E) 从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液;和(F)使用至少两种寡核苷酸引物对和该gDNA 溶液确定TGFW基因中存在的至少两个核苷酸的身份，其中所述至少两个核苷酸位于TGFW 基因的分别的独立的位置处，所述位置对应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷 酸多态性(SNP)。
[0016] 在一些实施方案中，所述TGFW基因中存在的至少两个核苷酸在人基因组中相隔 至少一个核苷酸。
[0017] 在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物， 其具有包含SEQ ID N0:1的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID N0:2的核苷酸 序列。
[0018] 在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对包含正向PCR引物， 其具有包含SEQ ID N0:43的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID N0:44的核苷 酸序列。
[0019] 在一些实施方案中，所述至少两种寡核苷酸引物对包含第一扩增引物对和第二扩 增引物对。所述第一扩增引物对包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列， 和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。所述第二扩增引物对包含正向PCR 引物，其具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:44 的核苷酸序列。
[0020] 在一些实施方案中，（F)确定进一步包括使用：（i)具有包含SEQ ID N0:25的核苷 酸序列的第一野生型检测探针，和具有包含SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49 的核苷酸序列的第一突变体检测探针；和（ii)具有包含SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:47的核 苷酸序列的第二野生型检测探针，和具有包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:50的核苷酸序列 的第二突变体检测探针。
[0021] 在一些实施方案中，本公开提供一种用于检测角膜营养不良的方法，该方法包括： (A)使用包含至少第一扩增引物对和至少第二扩增引物对的反应混合物从来自人受试者的 生物样品扩增至少两种TGFW基因序列，包括第一 TGFW基因序列和第二TGFW基因序列，所 述第一 TGFW基因序列包含编码氨基酸残基124的核苷酸，所述第二TGFW基因序列包含编 码氨基酸残基555的核苷酸；（B)将第一检测寡核苷酸探针对的第一检测探针杂交于第一 TGFW基因序列；（C)将第二检测寡核苷酸探针对的第二检测探针杂交于第二TGFW基因序 列；和(D)基于至少两种检测探针对的使用检测第一 TGFW基因序列和/或第二TGFW基因序 列中的一个或多个突变，所述至少两种检测探针对包括第一检测寡核苷酸探针对和第二检 测寡核苷酸探针对。
[0022] 在一些实施方案中，检测第一TGFW基因序列和/或第二TGFW基因序列中的一个 或多个突变包括检测第一 TGFW基因序列和/或第二TGFW基因序列中的两个或更多个突 变，且所述两个或更多个突变在人基因组中相隔至少一个核苷酸。
[0023] 在一些实施方案中，所述至少第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引 物，其中所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1且其中所述第二扩增引物包含核 苷酸序列SEQ ID N0:2。
[0024] 在一些实施方案中，所述至少第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引 物，其中所述第三扩增引物由核苷酸序列SEQ ID N0:43所示且其中所述第四扩增引物由核 苷酸序列SEQ ID N0:44所示。
[0025] 在一些实施方案中，所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所 述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:1，所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:2,所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核 苷酸序列SEQ ID N0:43,和所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:44。
[0026] 在一些实施方案中，所述一个或多个突变之一对应于在编码的TGFBI蛋白中，在氨 基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸(R124C)，精氨酸突变为组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突 变为亮氨酸(R124L)。
[0027] 在一些实施方案中，所述一个或多个突变之一对应于在编码的TGFBI蛋白中，在氨 基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰胺(R555Q)。
[0028] 在一些实施方案中，所述至少两种检测寡核苷酸探针对的每种各自包括第一检测 寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核 苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对:SEQ ID N0s:25-26，SEQ ID N0s:25和48，SEQ ID NOs:25和49,SEQ ID NOs:27-28，SEQ ID NOs:29-30，SEQ ID NOs:31-32，SEQ ID NOs: 33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs:39-40,SEQ ID NOs:41-42,SEQ ID N0s:45-46和SEQ ID N0s:46-47,SEQ ID N0s:45和50,和SEQ ID N0s:47和50。
[0029] 在一些实施方案中，所述第一检测寡核苷酸探针对包含第一检测寡核苷酸探针和 第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26。
[0030] 在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和 第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:46。
[0031] 在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和 第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:46。
[0032] 在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和 第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:48。
[0033] 在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和 第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:49。
[0034] 在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和 第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:50。
[0035] 在一些实施方案中，所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三检测寡核苷酸探针和 第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:50。
[0036] 在一些实施方案中，所述第一检测探针与第一标记物偶联且所述第二检测探针偶 联于第二标记物。
[0037] 在一些实施方案中，所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是FAM。
[0038] 在一些实施方案中，（B)杂交和(C)杂交在相同溶液中同时实施。
[0039] 在一些实施方案中，所述(B)杂交和(C)杂交在相同溶液或不同溶液中同时或在不 同时间实施。
[0040] 在一些实施方案中，本公开提供用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合 物，所述反应混合物包含：（A)至少第一扩增引物对和第二扩增引物对，其用于扩增和确定 (1)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFW基因序列的第一TGFW基因序列，其包含编 码氨基酸残基124的核苷酸，和（2)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFW基因序列的 第二TGFW基因序列，其包含编码氨基酸残基555的核苷酸；和(B)至少两种检测探针对，其 中所述至少两种检测探针对的每种中的检测探针与至少两种TGFW基因序列的至少一种杂 交。
[0041] 在一些实施方案中，所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所 述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:1，且所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:2〇
[0042] 在一些实施方案中，所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，所 述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:43,且所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:44。
[0043] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对的至少一种用于检测对应于编码的 TGFBI蛋白中的以下突变:在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸(R124C)，精氨酸突变为 组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。
[0044] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对的至少一种用于检测对应于编码的 TGFBI蛋白中的以下突变:在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变 为谷氨酰胺(R555Q)。
[0045] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对的分别的检测探针对各自包括第一 检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测 寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对：SEQ ID N0s:25-26，SEQ ID N0s:25和 48，SEQ ID NOs:25和49,SEQ ID NOs:27-28，SEQ ID NOs:29-30，SEQ ID NOs:31-32,SEQ ID NOs:33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs:39-40,SEQ ID NOs: 41-42,SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47,SEQ ID NOs:45和50,和SEQ ID NOs:47和 50 〇
[0046] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和 第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26。
[0047] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和 第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:46。
[0048] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和 第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:46。
[0049] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和 第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:48。
[0050] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和 第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:49。
[0051] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和 第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:50。
[0052] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针对之一包含第一检测寡核苷酸探针和 第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针分别包 含核苷酸序列对SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:50。
[0053] 在一些实施方案中，所述至少两种检测探针的第一检测探针与第一标记物偶联且 所述至少两种检测探针的第二检测探针偶联于第二标记物。
[0054] 在一些实施方案中，所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是FAM。
[0055] 在一些实施方案中，本公开提供用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合 物，所述反应混合物包含：（A)至少第一扩增引物对，其用于扩增和确定来自该受试者的生 物样品的TGFW基因序列；和(B)至少三种检测探针的组，其中所述至少三种检测探针的组 的一种检测探针在暴露于TGFW基因序列时与TGFW基因序列杂交。
[0056]在一些实施方案中，所述TGFW基因序列包含来自该受试者的生物样品的编码氨 基酸残基124的核苷酸。
[0057]在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少一种检测探 针：SEQ ID NOs :25-42和48-49。
[0058] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少两种或更多 种检测探针：SEQ ID NOs :25-42和48-49。
[0059] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少三种或更多 种检测探针：SEQ ID NOs :25-42和48-49。
[0060] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括第一检测探针SEQ ID NO: 25 和第二检测探针SEQ ID NO:26。
[0061] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的第三检测探针： SEQIDN0:48和SEQIDN0:49。
[0062]在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括不同于第三检测探针且选自 下组的第四检测探针：SEQ ID N0:48和SEQ ID N0:49。
[0063] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的两种或更多种检 测探针：SEQ ID NOs:26和48-49。
[0064] 在一些实施方案中，所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物，所 述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:1，且所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:2〇
[0065] 在一些实施方案中，反应混合物还包含：（C)至少第二扩增引物对，其用于扩增和 确定来自所述生物样品的第二TGFW基因序列；和(D)至少三种检测探针的第二组，其中所 述至少三种检测探针的第二组的一种检测探针在暴露于第二TGFW基因序列时与第二TGF0 I基因序列杂交。
[0066]在一些实施方案中，所述第二TGFW基因序列包含来自该受试者的生物样品的编 码氨基酸残基555的核苷酸。
[0067]在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少一种检 测探针：SEQ ID NOs :45-47和50。
[0068] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少两种或 更多种检测探针：SEQ ID NOs :45-47和50。
[0069] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的第二组包括选自下组的至少三种或 更多种检测探针：SEQ ID NOs :45-47和50。
[0070] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的第二组包括：第一检测探针，其为 SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:47,第二检测探针，其为SEQ ID N0:46,和第三检测探针，其为 SEQ ID N0:50〇
[0071] 在一些实施方案中，所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物，第 三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:43,和第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0: 44〇
[0072] 在一些实施方案中，所述TGFW基因序列包含来自该受试者的生物样品的编码氨 基酸残基555的核苷酸。
[0073]在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少一种检测探 针：SEQ ID N0s:45-47和50。
[0074] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少两种或更多 种检测探针：SEQ ID N0s:45-47和50。
[0075] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括选自下组的至少三种或更多 种检测探针：SEQ ID N0s:45-47和50。
[0076] 在一些实施方案中，所述至少三种检测探针的组包括:第一检测探针，其为SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47,第二检测探针，其为SEQ ID NO:46,和第三检测探针，其为SEQ ID N0:50〇
[0077] 在一些实施方案中，本公开提供用于检测角膜营养不良的方法，包括：（A-1)使用 包含至少第一扩增引物对和至少三种检测探针的组的反应混合物，从来自人受试者的生物 样品扩增第一TGFW基因序列；（B-1)将所述至少三种检测探针的组的第一检测探针与第一 TGFW基因序列杂交;并(C-1)基于以下检测第一 TGFW基因序列中的突变：（i)所述至少三 种检测探针的组的第一检测探针杂交于第一TGFW基因序列，和（ii)所述至少三种检测探 针的组的第二和第三检测探针与第一 TGFW基因序列杂交的失败。
[0078] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括：（A-2)使用相同反应混合物从所述生物 样品扩增第二TGFW基因序列，其中所述反应混合物包含至少第二扩增引物对和至少三种 检测探针的第二组；（B-2)将所述至少三种检测探针的第二组的第一检测探针与第二TGFW 基因序列杂交;并(C-2)基于以下检测第二TGFW基因序列中的突变：（i)所述至少三种检测 探针的第二组的第一检测探针杂交于第二TGFW基因序列，和（ii)所述至少三种检测探针 的第二组的第二和第三检测探针与第二TGFW基因序列杂交的失败。
[0079] 在一些实施方案中，扩增(A-1)，扩增(A-2)，杂交(B-1)，杂交(B-2)，检测(C-1)，和 检测(C-2)用生物样品的同一等分试样实施。
[0080] 在一些实施方案中，扩增第一TGFW基因序列(A-1)和扩增第二TGFW基因序列(A-2)同时实施。
[0081] 在一些实施方案中，杂交(B-1)和杂交(B-2)同时实施。
[0082] 在一些实施方案中，检测(C-1)和检测(C-2)同时实施。
[0083]在一些实施方案中，所述反应混合物具有上文描述的一些特征。为了简洁，本文中 不重复这类细节。
[0084]在一些实施方案中，本公开提供如上文任意处记载的反应混合物用于预测受试者 中在激光眼科手术后的并发症的风险的用途，所述预测经由检测人受试者中的杂合角膜营 养不良进行。
[0085] 在一些实施方案中，所述激光眼科手术包括Lasik和Excimer激光手术之一。
[0086]在一些实施方案中，本公开提供用于检测来自人受试者的样品中与角膜营养不良 有关的基因组突变的方法，该方法包括：（A)提供人受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖 端；（B)在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞；（C)在 完成(B)搅动时，从裂解溶液移出该基片；（D)在(C)移出后温育该裂解溶液；（E)从裂解溶液 分离基因组DNA以形成gDNA溶液;和(F)使用至少第一引物对、至少三种检测探针的组和该 gDNA溶液，通过将该gDNA溶液同时暴露于所述至少三种检测探针，确定TGFW基因中存在的 至少一个核苷酸的身份，其中：所述至少一个核苷酸位于TGFW基因的特定的位置处，所述 位置对应于与角膜营养不良有关的单核苷酸多态性(SNP)，且所述至少三种检测探针的组 的至少两种检测探针的每种配置为检测TGFW基因的特定位置处的不同突变。
[0087]在一些实施方案中，该方法进一步包括：（G)使用至少第二引物对、至少三种检测 探针的第二组和该gDNA溶液，通过将该gDNA溶液同时暴露于所述至少三种检测探针的组和 所述至少三种检测探针的第二组，确定TGFW基因中存在的至少第二核苷酸的身份，其中： 所述至少第二核苷酸位于TGFW基因的独立于所述至少一个核苷酸的位置的第二特定位置 处，所述第二特定位置对应于与角膜营养不良有关的第二单核苷酸多态性(SNP)，且所述至 少三种检测探针的第二组的至少两种检测探针配置为检测TGFW基因的第二特定位置处的 分别的突变。
[0088] 在一些实施方案中，所述确定(F)和确定(G)同时实施。
[0089]在一些实施方案中，所述确定(F)和确定(G)使用同一gDNA溶液实施。
[0090] 附图简述
[0091] 图1A-1B例示根据一些实施方案，用于检测与疾病有关的基因组等位基因的改进 的方法100。
[0092] 图2提供了根据一些实施方案，可用于与阿维利诺角膜营养不良有关的单核苷酸 多态性的实时PCR检测的正向和反向PCR引物对的序列列表(SEQ ID N0s:l-24)。
[0093] 图3提供了根据一些实施方案，可用于与阿维利诺角膜营养不良有关的单核苷酸 多态性的实时PCR检测的野生型和突变体检测探针对的序列列表(SEQ ID NOs :25-42)。
[0094] 图4提供了用于图5至图8中显示的等位基因检测实验中使用的探针序列和引物的 列表。
[0095] 图5提供了使用图4中描述的探针，对于1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551和1?555〇突变体 的检测的实验数据。图5A提供了使用指定的试剂混合物和指定的循环条件(右手小图）的等 位区分图运行(左手小图）。图5B提供了相比于正常对照的多种突变体的实时PCR图。图5C提 供了相比于纯合对照的多种突变体的实时PCR图。
[0096] 图6提供关于使用图4中描述的探针检测1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551和1?555〇突变 体的实验数据。图6A提供等位区分图运行（左手小图），其使用指定的试剂混合物和指定的 循环条件(右手小图）。图6B提供相比于正常对照的多种突变体的实时PCR图。图6C提供了相 比于纯合对照的多种突变体的实时PCR图。
[0097] 图7提供关于使用图4中描述的探针检测1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551和1?555〇突变 体的实验数据。图7提供等位区分图（左手小图）运行，其使用指定的试剂混合物和指定的循 环条件(右手小图）。
[0098] 图8提供关于使用图4中描述的探针检测1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551和1?555〇突变 体的实验数据。具体地，图8提供等位区分图运行，其使用指定的试剂混合物和指定的循环 条件(右手小图）。等位区分图运行(左手小图）中的名称"B"指示样品在实施实时PCR测定之 前用裂解缓冲液预处理。等位区分图（左手小图）中的名称"DW-A"指示样品在实施实时PCR 测定之前用蒸馏水预处理。围绕不同样片点的圈显示对于检测的每种等位基因的两种匹配 的样品，分别为"B"和"DW-A"（见左手小图）；在每个圈内有两个点，一个是样品"B"，一个是 样品 "DW-A"。
[0099] 发明详述
[0100] I.引言
[0101] 对疾病相关的SNP的检测是对多种医学状况的诊断和预后的一项越来越重要的工 具。例如，在TGFW基因的外显子4中单核苷酸变化的存在与阿维利诺角膜营养不良强烈相 关。发现该SNP杂合的个体在LASIK手术后有视力丧失的高风险。尽管LASIK是一种极大改进 许多人的生活质量的医疗规程，但对于携带G/A TGFf3I SNP的个体，其通常导致在4至18个 月时段内的逐渐视力受损，这可能导致视力丧失。视力受损可能在或长或短的时段内发生。 幸运的是，可以实施筛选来鉴定出携带该突变的个体，所述个体应避免有LASIK规程。
[0102] 本公开至少部分基于改进样品分离、制备和分析的方法的发现。在一些实施方案 中，提供允许患者样品再使用的方法，例如当测定失败或需要实施另外的随访测试时。在一 些实施方案中，这些改进的方法包括在室温将携带从患者的口腔黏膜脱落的细胞的基片 (例如以人造丝为尖端或以棉为尖端的涂药器)温和地涡旋于裂解溶液中达30-45秒(而不 是在升高温度的20分钟的延长温育）。然后，将该裂解溶液在45°C温育30分钟来改进裂解并 增加基因组样品的产率。有利地，可随后贮存(例如冻存或冷藏）以人造丝为尖端或以棉为 尖端的涂药器用于重分离基因组DNA以用于再测试。
[0103] 在一些实施方案中，本文中提供的改进是经由使用更少量的用于实时PCR检测测 定法的基因组DNA样品来提供的。在一些实施方案中，这通过增加实施的实时PCR循环数(例 如约40个循环)和/或通过使用在95°C的3秒变性循环时间实现。有利地，由于需要的样品量 被这些方法降低，因此对实时PCR试剂的要求也降低。由于用于诊断测定的许多试剂是专卖 的，试剂可能较昂贵。降低使用的试剂量也可以显著降低与试剂有关的成本。
[0104] 涵盖可以使用用于进行这些各个步骤的每一个的特定条件（例如样品处理、温育 温度、反应体积、反应循环数、反应循环时间、反应循环温度)的所有组合来实施本文中描述 的方法以检测疾病相关的SNP，如见于TGFW基因的外显子4的阿维利诺角膜营养不良相关 的 SNP。
[0105] II.选择定义
[0106]术语"发明"或"本发明"如本文使用的不意图限制为本发明的任一个具体的实施 方案，而是一般应用于本发明的任意和所有实施方案，如权利要求和说明书中描述的。
[0107] 如本文使用的，除非上下文另外清楚地指示，单数形式"一个/一种"和"该"包括复 数指代物。如此，例如对"该方法"的提述包括一种或多种方法，和/或本文描述的类型的步 骤，其在阅读本公开时对于本领域技术人员将变得明显的。
[0108] 如本文使用的，术语"多态性"及其变体指不同基因组或个体之间或之中两种或更 多种备选基因组序列或等位基因的存在。术语"遗传突变"或"遗传变异"及其变体包括多态 性。
[0109]如本文使用的，术语"单核苷酸多态性"（"SNP"）及其变体指在等位基因间变化的 一个核苷酸的位点。单核苷酸多态性（s N P)是单个碱基变化或点突变，但也包括所谓的 "indel"突变(核苷酸的插入或缺失），导致个体之间的遗传变化。占据所有人遗传变异的约 90%的SNP沿着30亿碱基的人基因组每100至300个碱基发生一次。然而，SNP在其他生物体 如病毒中频繁地多地发生。SNP可发生在基因组的编码或非编码区。编码区中的SNP可以改 变或可以不改变蛋白质产物的氨基酸序列。非编码区中的SNP可以改变启动子或加工位点， 且可以影响基因转录和/或加工。对个体在感兴趣的基因组区域中是否具有特定SNP的了解 可以提供开发用于多种疾病的诊断、预防和治疗应用的充足信息。在一些实施方案中，本公 开涉及检测位于TGFW基因的外显子4中的与阿维利诺角膜营养不良有关的鸟嘌呤至腺嘌 呤 SNP。
[011 0]术语"引物"及其变体指在PCR反应中充当DNA合成启动点的寡核苷酸。引物通常长 为约15至约35个核苷酸并与同祀序列互补的区域杂交。
[0111] 术语"探针"及其变体(例如检测探针)指在PCR反应中与靶核酸杂交的寡核苷酸。 靶序列指要分析的且包含感兴趣的多态性位点的核酸区域。
[0112] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本方面所属领域的普通 技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文中描述的 那些类似或等同的任意方法和材料，但本文中具体地描述了方法和材料的多个实施方案。
[0113] III.样品制备
[0114] 在一些实施方案中，本公开提供用于分离在实时PCR单核苷酸多态性检测测定法 中使用的基因组样品的改进的方法。在一些实施方案中，所述改进的方法100使用图1中概 述的步骤的组合。
[0115] 在一些实施方案中，方法包括提供来自受试者的细胞样品。在一些实施方案中，通 过使患者的细胞表面与基片接触来收集细胞，所述基片能可逆地将细胞固定化在基片上。
[0116] 所公开的方法适用于从多种样品获得的多种细胞类型。在一些实施方案中，用于 所公开方法的细胞类型包括但不限于，上皮细胞、内皮细胞、结缔组织细胞、骨骼肌细胞、内 分泌细胞、心脏细胞、泌尿器细胞、黑色素细胞、角质形成细胞、血细胞、白细胞、血沉棕黄层 (buffy coat)、毛细胞(包括例如根毛细胞)和/或唾液细胞。在一些实施方案中，所述细胞 是上皮细胞。在一些实施方案中，所述细胞是囊下-血管周（上皮类型1);白色(pale)(上皮 类型2);中间（上皮类型3);黑色(上皮类型4);未分化(上皮类型5);和大髓质（上皮类型6)。 在一些实施方案中，所述细胞是口腔上皮细胞（例如使用口腔拭子（swap)收集的上皮细 胞）。在一些实施方案中，所公开的方法中使用的细胞样品包括上文确定的细胞类型的任意 组合。
[0117] 在一些实施方案中，所述方法包括提供（102)来自受试者的细胞样品。在一些实施 方案中，提供的细胞是口腔上皮细胞。
[0118] 细胞样品通过允许受试者细胞可逆结合于基片的多种方法的任一种来收集。在一 些实施方案中，使基片与含有受试者细胞的样品呈物理相互作用地采用，以将细胞可逆结 合于基片。在一些实施方案中，使基片与受试者身体呈物理相互作用地直接采用，以将细胞 可逆结合于基片。在一些实施方案中，样品是口腔细胞样品且通过将受试者的口腔黏膜(例 如其面颊内）与基片接触来收集口腔细胞的样品，所述基片能可逆地固定化从黏膜取出的 细胞。在这类实施方案中，以等同于刷牙的力度(例如轻量的力或压力)对受试者的颊内擦 拭拭子。涵盖将允许受试者的细胞可逆结合于基片的任意方法用于所公开的方法。
[0119] 在一些实施方案中，有利地，以非侵入性方式收集样品，如此在任何地方且由几乎 任何人完成此类样品收集。例如，在一些实施方案中，在内科医师办公室、在受试者家里或 在进行或要进行LASIK手术的设施处收集样品。在一些实施方案中，患者、患者的医生、护士 或内科医师的助手或其他临床人员收集样品。
[0120] 在一些实施方案中，基片由细胞可逆结合的多种材料的任一种制备。例示性基片 包括由人造丝、棉、二氧化硅、弹性体、虫漆、琥珀、天然或合成橡胶、纤维素、BAKELITE、 NYL0N、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、或其他材料或其组合制备的那些。在一些实施 方案中，基片是具有人造丝尖端或棉尖端的拭子。
[0121] 然后，将基片的尖端(例如人造丝拭子或棉拭子的尖端)在裂解溶液中搅动约10秒 至60秒（1分钟），或约20秒至60秒，约20秒至约45秒，或约20秒至约30秒，约15秒至约60秒， 约15秒至约45秒，或约15秒至约30秒，约10秒至约60秒，约10秒至约45秒，或约10秒至约30 秒，约10秒至约15秒或约10秒至约20秒。在一些实施方案中，搅动进行约60秒或约1分钟。在 一些实施方案中，搅动进行不到1分钟（例如不到60秒）。在一些实施方案中，搅动进行不超 过15秒，20秒，30秒，45秒，60秒，90秒，120秒或更多。在一些实施方案中，搅动进行不超过45 秒。在一些实施方案中，搅动进行不超过30秒。在一些实施方案中，搅动进行不超过20秒。在 一些实施方案中，搅动进行不超过15秒。
[0122] 在一些实施方案中，搅动包括基片在裂解溶液中的任何移动。在一些实施方案中， 将基片的尖端(例如人造丝拭子或棉拭子的尖端)在裂解溶液中温和移动，从而使得多个口 腔细胞保持附着于基片以在后面的时间和/或随后时间进行分析。在裂解溶液中的这类移 动包括涡旋运动、侧向运动、上下运动和/或浸渍运动，或基片在裂解溶液中的任何其他运 动，其导致多个口腔细胞保持附着于尖端同时允许一些口腔细胞分散到裂解溶液中。
[0123] 在一些实施方案中，在室温进行搅动步骤，例如在约15°C和约30°C，约18°C和约28 。(：，约18 °C和约25 °C或约20 °C和约25 °C之间的温度。
[0124] 在搅动后，移出基片（例如具有人造丝尖端或棉尖端的拭子），并在一些实施方案 中贮存用于后期使用，如果需要重新测试或进一步（例如不同或额外的）测试的话。在一些 实施方案中，将基片(例如具有人造丝尖端或棉尖端的口腔拭子)置于容器中并冷冻贮存。 在一些实施方案中，将基片(例如具有人造丝尖端或棉尖端的口腔拭子)冷藏。在一些实施 方案中，将基片在多种温度的任一个贮存多种时段的任一个，同时仍保持对再一次或多次 提取可用。
[0125] 在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存0周，1周，2周，3周，4周，5周，6周，7周， 8周，9周，10周，11周或12周或更长。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存和/或能贮 存0周至12周，1周至12周，2周至12周，3周至12周，4周至12周，5周至12周，6周至12周，7周至 12周，8周至12周，9周，10周至12周，或11周至12周。在一些实施方案中，将含有样品的基片 贮存1，2,3,4,5,6,8，10，12，14，16，18,20,22,24,30，或36个月或更长。在一些实施方案中， 将含有样品的基片贮存1个月至36个月，2个月至36个月，3个月至36个月，4个月至36个月，5 个月至36个月，6个月至36个月，7个月至36个月，8个月至36个月，9个月至36个月，10个月至 36个月，12个月至36个月，14个月至36个月，16个月至36个月，18个月至36个月。在一些实施 方案中，将含有样品的基片贮存1个月至30个月，2个月至30个月，3个月至30个月，4个月至 30个月，5个月至30个月，6个月至30个月，7个月至30个月，8个月至30个月，9个月至30个月， 10个月至30个月，12个月至30个月，14个月至30个月，16个月至30个月或18个月至30个月。 在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至24个月，2个月至24个月，3个月至24个 月，4个月至24个月，5个月至24个月，6个月至24个月，7个月至24个月，8个月至24个月，9个 月至24个月，10个月至24个月，12个月至24个月，14个月至24个月，16个月至24个月，18个月 至24个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至22个月，2个月至22个月，3个 月至22个月，4个月至22个月，5个月至22个月，6个月至22个月，7个月至22个月，8个月至22 个月，9个月至22个月，10个月至22个月，12个月至22个月，14个月至22个月，16个月至22个 月，18个月至22个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至20个月，2个月至 20个月，3个月至20个月，4个月至20个月，5个月至20个月，6个月至20个月，7个月至20个月， 8至20个月，9至20个月，10个月至20个月，12个月至20个月，14个月至20个月，16个月至20个 月，18个月至20个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存1个月至18个月，2个月至 18个月，3个月至18个月，4个月至18个月，5个月至18个月，6个月至18个月，7个月至18个月， 8个月至18个月，9个月至18个月，10个月至18个月，12个月至18个月，14个月至18个月，16个 月至18个月或17个月至18个月。在一些实施方案中，将含有样品的基片保藏1个月至12个 月，2个月至12个月，3个月至12个月，4个月至12个月，5个月至12个月，6个月至12个月，7个 月至12个月，8个月至12个月，9个月至12个月，10个月至12个月或11个月至12个月。
[0126] 在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约2°C，约3°C，约4°C，约5°C，约6°C， 约7°C，或约8°C。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约2°C至约8°C，约3°C至约8 °C，约4°C至约8°C，约5°C至约8°C，约6°C至约8°C或约7°C至约8°C。在一些实施方案中，将含 有样品的基片贮存在约-25°C，约-24°C，约-23°C，约-22°C，约-21°C，约-20°C，约-19°C，约-18°C，约_17°C，约_16°C或约_15°C。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约_25°C 至约-15°C，约_22°C至约_17°C,约_20°C至约_15°C或约_25°C至约_20°C。在一些实施方案 中，将含有样品的基片贮存在约_90°C，约_89°C，约_88°C，约_87°C，约_86°C，约_85°C，约_ 84°C，约_83°C，约-82°C，约_81°C，约_80°C，约_79°C，约_78°C，约_77°C，约_76°C，约_75°C， 约-74°C，约_73°C，约_72°C，约_71°C，约_70°C，约_69°C，约_68°C，约_67°C，约-66°C或约-65°C。在一些实施方案中，将含有样品的基片贮存在约_90°C至约_65°C，约_85°C至约-65 °C，约_80°C至约_65°C，约_75°C至约_65°C或约_70°C至约_65°C。在一些实施方案中，将含 有样品的基片贮存在-90 °C至-65 °C。
[0127] 在一些实施方案中，将含有样品的基片冻融一次或多次(例如，在冷冻后，将含有 样品的基片解冻，依照所述方法使用并再冷冻)和/或用于本方法。在一些实施方案中，将含 有样品的基片冻融1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20次或更多次。 在一些实施方案中，将含有样品的基片在本方法中使用1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，12，13， 14,15,16,17,18,19,20次或更多次。在一些实施方案中，将含有样品的基片冻融1至20次，2 至20次，3至20次，4至30次，5至20次，6至20次，7至20次，8至20次，9至20次，10至20次，11至 20次，12至20次，13至20次，14至20次，15至20次，16至20次，17至20次，18至20次，19至20次， 5至15次，5至10次，1至10次或1至5次。在一些实施方案中，将含有样品的基片在本方法中使 用1至20次，2至20次，3至20次，4至30次，5至20次，6至20次，7至20次，8至20次，9至20次，10 至20次，11至20次，12至20次，13至20次，14至20次，15至20次，16至20次，17至20次，18至20 次，19至20次，5至15次，5至10次，1至10次，1至5次，1至4次，1至3次或1至2次。
[0128] 在一些实施方案中，将含有样品的基片在室温或约15°C至约30°C贮存1周。在一些 实施方案中，将样品在约2°C至约8°C或约4°C贮存约1，2或3周。在一些实施方案中，将含有 样品的基片在约_25°C至约_15°C或约_20°C贮存约1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11或12个月。在 一些实施方案中，将含有样品的基片在约_90°C至约_65°C或约_80°C贮存约1，2,3,4,5,6， 7,8,9，10，11或12个月。
[0129] 有利地且令人惊讶地，发现从基片提取的减少的细胞数被从个别细胞的核酸的增 加的提取所抵消。在一些实施方案中，增加的提取通过相比于标准实践将细胞温育更长的 时间，相比于标准实践在升高的温度温育细胞，或两者的组合来实现。
[0130] 在一些实施方案中，细胞的增加的核酸提取通过相比于标准实践将提取温育进行 增加的或更长的时段来实现。在一些实施方案中，所述提取温育进行约45分钟，例如45±5， 45± 10，45 ± 15，或45 ± 20分钟。在一些实施方案中，所述提取温育进行约25分钟至约65分 钟，约30分钟至约60分钟，约35分钟至约55分钟，约45分钟至约65分钟，约45分钟至约55分 钟，或约40分钟至约50分钟。在一些实施方案中，所述提取温育时间为约25分钟，约30分钟， 约35分钟，约40分钟，约45分钟，约50分钟，约55分钟，约60分钟或约65分钟。
[0131] 在一些实施方案中，细胞的增加的核酸提取通过相比于标准实践将提取温育在增 加的或更高的温度进行来实现。在一些实施方案中，所述提取温育在约45°C，例如45±2°C， 45±5°C，或45±10°C进行。在一些实施方案中，所述提取温育温度为约35°C至约55°C，约40 。(:至约50°C或约43°C至约47°C。在一些实施方案中，提取温度为约43°C，约44°C，约45°C，约 46 °C，约47 °C，约48 °C，约49 °C，约50 °C，约51°C，约52 °C，约53 °C，约54 °C 或约55 °C。在一些实 施方案中，使用超过一种提取温度。例如，在一些实施方案中，对于提取的一部分使用标准 温度而对于提取的另一部分使用升高的温度。
[0132] 在一些实施方案中，从基片释放实质上少数的细胞用于依照本系统和方法的后续 裂解。在一些实施方案中，在搅动期间从基片释放至少1个细胞，至少2个细胞，至少5个细 胞，至少10个细胞，至少15个细胞，至少20个细胞，至少50个细胞，至少75个细胞，至少100个 细胞，至少125个细胞，至少150个细胞，至少175个细胞，至少200个细胞，至少250个细胞，至 少300个细胞，至少350个细胞，至少400个细胞，至少450个细胞，至少500个细胞或更多。
[0133] 在一些实施方案中，使用所描述的方法从单个受试者采用(获得)纯度为约0.55至 2.00，约0.6至约2.00，约0.7至约2.00约0.8至约2.00，约0.9至约2.00，约1.0至约2.00约 1.1至约2.00，约1.2至约2.00，约1.3至约2.00，约1.4至约2.00，约1.5至约2.00约1.6至约 2.00约1.7至约2.00约1.8至约2.00或约1.9至约2.00的约Ing/yL至约50ng/yL，约Ing/yL至 约40ng/yL，约 Ing/yL 至约30ng/yL，约 Ing/yL 至约20ng/yL，约 Ing/yL 至约 lOng/yL，约 lng/μ L至约 5ng/yL，约 Ing/yL至约4ng/yL，约 Ing/yL 至约 3ng/yL 或约 Ing/yL 至约 2ng/yL的核酸。 在一些实施方案中，使用所描述的方法从单个受试者采用（获得)纯度为约0.55至2.00的 lng/yL 至 50ng/yL 核酸。
[0134] IV.裂解溶液
[0135] 已描述且本领域技术人员已知多种裂解溶液。可将这些公知的裂解溶液的任意一 种用于所述方法以从样品分离核酸。例示性裂解溶液包括那些商品化的，如由 INVITROGEN?:，QIAGEN?，l IFE TECHNOLOGIES? 和其他制造商销售的那些， 以及可由实验室背景的技术人员生成的那些。裂解缓冲液也已经得到完善描述，且可将多 种裂解缓冲液用于所公开的方法中，包括例如在Molecular Cloning(three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)和Current Protocols(Genetics and Genomics;Molecular Biology; 2003-2013)中描述的那些，两者均通过提述并入本文用于 所有目的。
[0136] 细胞裂解是用于从细胞内回收核酸的常见实践方法。在许多情况中，使细胞与裂 解溶液，通常为包含去污剂的碱性溶液或裂解酶的溶液接触。这类裂解溶液通常含有盐、去 污剂和缓冲剂，以及本领域技术人员会理解去使用的其他试剂。在全部和/或部分裂解后， 从裂解溶液回收核酸。
[0137] 在一些实施方案中，细胞重悬于水性缓冲液中，所述水性缓冲液具有范围从约pH 4至约10,约5至约9,约6至约8或约7至约9的pH。
[0138] 在一些实施方案中，缓冲盐浓度为约l〇mM至约200mM,约10mM至约100mM或约20mM 至约80mM。
[0139] 在一些实施方案中，缓冲液还包含螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙 酸（EGTA)。
[0140] 在一些实施方案中，裂解溶液进一步包含其他化合物以协助核酸从细胞释放，如 多元醇，包括例如但不限于蔗糖，以及糖醇如麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇和/或 异麦芽（isomalt)。在一些实施方案中，多元醇在约2%至约15%w/w,或约5%至约15%w/w 或约5 %至约10 % w/w的范围内。
[0141] 在一些实施方案中，裂解溶液进一步包含表面活性剂，如例如但不限于1^切11父-100，SDS，CTAB，X-114，CHAPS，D0C，和/或NP-40。在一些实施方案中，这类表面活性剂在约 1%至约5%w/w,约1%至约4%w/w,或约1%至约3%w/w的范围内。
[0142] 在实施方案中，裂解溶液进一步包含离液剂，如例如但不限于尿素、十二烷基硫酸 钠和/或硫脲。在一些实施方案中，以范围为约0.5M至8M，约1M至约6M，约2M至约6M或约1M至 3M的浓度使用离液剂。
[0143] 在一些实施方案中，裂解溶液进一步包含一种或多种别的裂解试剂且这类裂解试 剂是本领域公知的。在一些实施方案中，这类裂解试剂包括细胞壁裂解酶，如例如但不限于 溶菌酶。在一些实施方案中，裂解试剂包括碱性去污剂溶液，如含有〇. 5 %十二烷基硫酸钠 的0.1M氢氧化钠水溶液（aqueous sodium hydroxide)。
[0144] 在一些实施方案中，裂解溶液进一步包含水性糖溶液，如蔗糖溶液和螯合剂如 EDTA，例如STET缓冲液。在某些实施方案中，裂解试剂通过将细胞悬液和等体积的裂解溶液 混合来制备，所述裂解溶液具有期望浓度的两倍(例如〇. 2M氢氧化钠，1.0%十二烷基硫酸 钠)。
[0145] 在一些实施方案中，在实现期望的裂解程度后，使包含裂解溶液和裂解细胞的混 合物与中和试剂或猝灭试剂接触以调整条件，使得裂解试剂不会对期望产物有不利影响。 在一些实施方案中，将pH调整至约5至约9，约6至约8，约5至约7，约6至约7或约6.5至7.5的 pH以最小化和/或防止细胞内含物(包括例如但不限于核酸）的降解。在一些实施方案中，当 裂解试剂包含碱性溶液时，中和试剂包含酸性缓冲剂，例如碱金属乙酸盐/乙酸缓冲剂。在 一些实施方案中，选择裂解条件，如温度和裂解试剂的组成，使得基本完成裂解，同时最小 化期望产物(包括例如但不限于核酸)的降解。
[0146] 在一些实施方案中，将第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20种裂解溶 液用于所述方法。在一些实施方案中，使用的裂解缓冲液的体积是约l〇yL，约20yL，约30yL， 约40yL，约50yL，约60yL，约70yL，约80yL，约90yL，约100yL，约120yL，约130yL，约140yL，约 150yL，160yL，约170yL，约180yL，约190yL，约200yL，约220yL，约230yL，约240yL，约250yL， 约260yL，约270yL，约280yL，约290yL，约300yL，约320yL，约330yL，约340yL，约350yL，约360 yL，约370yL，约380yL，约390yL，约400yL，约450yL，约500yL，约550yL，约600yL，约650yL，约 700yL，约 750yL，约 800yL，约 850yL，900yL，950yL，1000yL，1500yL 或 2000yL。在一些实施方 案中，裂解缓冲液在约10yL和约1000yL，约10yL和约800yL，约10yL和约600yL，约10yL和约 400yL，约20yL 和约 400yL，约 50yL 和约 300yL，约 50yL 和约200yL，约 50yL 和约400yL，约 100yL 和约400yL，约1 OyL和约300yL或约1 OOyL和约200yL之间。
[0147] 上述内容的任意组合均可由技术人员采用以及与其他已知且常规的方法组合，且 这类组合涵盖在本发明中。
[0148] V.从裂解缓冲液纯化核酸
[0149] 在一些实施方案中，在实施后续分析之前从裂解缓冲液分离核酸，包括例如但不 限于基因组DNA。在一些实施方案中，在实施另外的分析，如例如但不限于实时PCR分析之前 从裂解缓冲液分离核酸。所公开方法的多个实施方案使用可用于分离少量核酸的多种方法 中的任意方法。这些包括但不限于，沉淀、凝胶过滤、密度梯度和固相结合。这类方法也记载 于例如Molecular Cloning(三卷集，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)和 Current Protocols(Genetics and Genomics;Molecular Biology;2003-2013)，通过提述 并入本文用于所有目的。
[0150] 核酸沉淀是本领域技术人员已知的用于分离的公知方法。多种固相结合方法也是 本领域已知的，包括但不限于使用珠子(例如二氧化硅、磁性）、柱、膜的形式或本领域已知 的多种其他物理形式之任一的固相的固相结合方法。在一些实施方案中，用于所公开方法 的固相可逆地结合核酸。这类固相的例子包括所谓的"混合床(mixed-bed)"固相，其为至少 两种不同固相的混合物，每种具有在不同溶液条件下结合核酸的容量，和在不同条件下释 放核酸的能力和/或容量;如在美国专利申请No. 2002/0001812中描述的那些，其通过提述 完整并入本文用于所有目的。根据所公开方法的对核酸的固相亲和力可经由通常用于将溶 质结合于基质的多种手段中的任一种。这类手段的例子包括但不限于，离子相互作用(例如 阴离子交换层析)和疏水相互作用（例如反向层析）、pH差异和变化、盐差异和变化(例如浓 度变化，使用离液盐/剂）。例示性的基于P Η的固相包括但不限于在IN VI T R 0 G E N ChargeSwitch Normalized Buccal Kit磁珠中使用的那些，其在低ρΗ(〈6·5)结合核酸并在 高ρΗ(>8.5)释放核酸，和单氨基-Ν-氨基乙基(ΜΑΝΑΕ)，其在低于7.5的pH结合核酸并在大于 8的pH释放核酸。例示性的基于离子交换的基质包括但不限于，来自PHARMACIA (Piscataway，N · J ·)的DEA-SEPHAR0SE?，Q-SEPHAR0SE?，和DEAE-SEPHADEX?，来自 Dow Chemical公司（Midland，Mich ·)的 DOWEX㊣ I，来自 R〇hm&Haas(Philadelphia，Pa ·)的 AMBERLITE?，来自 Duolite International，In · (Cleveland，Ohio)的 DUQLITE⑩， DIAL0N TI和DIAL0N Til。
[0151] 涵盖任何单个方法单独或与其他方法组合使用，且这类可用组合是公知的并被本 领域技术人员所领会的。
[0152] VI.核酸分析
[0153]所公开的方法用于分离核酸，如基因组DNA(gDNA)，以用于多种核酸分析，包括基 因组分析。在一些实施方案中，这类分析包括多种遗传突变的检测，其包括但不限于一个或 多个缺失、插入、转换和颠换。在一些实施方案中，突变是单核苷酸多态性(SNP)。
[0154]用于分析这类分离的核酸，例如但不限于基因组DNA(gDNA)的多种方法是本领域 已知的，且包括PCR方法，如实时PCR分析、微阵列分析、杂交分析和核酸序列分析，以及分析 核酸组成且本领域技术人员已知的多种其他方法。参见例如，Molecular Cloning(三卷集， Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)和Current Protocols(Genetics and Genomics；Molecular Biology；2003-2013)〇
[0155] a.实时 PCR
[0156] 为了设计实时PCR测定法，将几个部分协调起来，包括被两个引物侧接且随后扩增 的DNA片段(经常称为扩增子）、两个引物和要使用的检测探针(一种或多种）。
[0157] 实时PCR依赖于与短多核苷酸(称为"检测探针"）缀合的荧光染料的视觉发射，所 述短多核苷酸以序列特异性方式与基因组等位基因联合。相差单个核苷酸的实时PCR探针 可在实时PCR测定法中区分，其通过以不同波长发荧光的探针的缀合和检测。实时PCR适用 于检测应用(诊断应用）、定量应用和基因型分型应用。
[0158] 用于实施实时PCR的几种相关方法在本领域中披露，包括依赖于以下的测定法： 丁八(^4八\嗯探针（美国专利化8.5,210,015和5,487,972，和1^6等，_(：16化八(^(18 Res .21:3761-6,1993)、分子信标探针（美国专利Nos .5,925,517和6,103,476,和Tyagi和 Kramer，Nat ·Biotechno 1 · 14: 303-8，1996)、自探测扩增子（scorpions)(美国专利No · 6， 326，145，和Whitcombe等，Nat · Biotechno 1.17:804-7,1999)、Amp 1 i sensor (Chen等， Appl · Environ .Microbiol .64:4210-6,1998)、Ampl if luor (美国专利No .6,117,635,和 Nazarenko等，Nucleic Acids Res.25:2516-21,1997、置换杂交探针（Li等，Nucleic Acids Res · 30 :E5，2002)，DzyNA-PCR(Todd等，Clin. Chem.46 :625-30,2000)、荧光限制酶检测 (Cairns等，Biochem.Biophys · Res · Commun · 318:684-90，2004)和邻近杂交探针（美国专利 No·6，174，670和Wittwer等，Biotechniques 22:130-1，134-8，1997)〇
[0159] 在一些情况中，实时PCR可实现对多种基因突变(包括例如但不限于SNP)的检测。 在一些实施方案中，使用实时PCR进行对特定基因候选物中SNP的检测，其基于通过使用拴 系的猝灭模块对荧光分子的分子内猝灭的用途。因此，根据例示性实施方案，实时PCR方法 还包括使用分子信标技术。分子信标技术利用具有内部猝灭的焚光团的发夹形分子，其焚 光通过结合感兴趣的DNA革E物恢复（参见例如，Kramer，R.等Nat · Biotechno 1 · 14:303-308， 1996)。在一些实施方案中，利用分子信标探针对积累的PCR产物的增加的结合来特异性检 测基因组DNA中存在的SNP。
[0160] 许多适宜的基因型分型规程之一是TAQMAN?等位区分测定法。在该测定法的 一些情况中，利用在探针的5'端用荧光报道物染料标记且在探针的3'端用猝灭剂染料标记 的寡核苷酸探针。猝灭剂对完整探针的接近性保持报道物的较小荧光。在PCR反应期间，DNA 聚合酶的5'核酸酶活性切割探针，并分离染料与猝灭剂。这导致报道物的荧光增加。通过监 测报道物染料的荧光增加来直接检测PCR产物的积累。仅当探针与靶物杂交并在PCR期间扩 增时，DNA聚合酶的5'核酸酶活性在报道物和猝灭剂之间切割探针。探针设计为跨过目标 SNP位置，并仅当存在特定SNP等位基因时与核酸分子杂交。
[0161]举例而言，为了扩增位于TGFW基因外显子4中的与阿维利诺角膜营养不良有关的 SNP，构建正向和反向PCR引物对（图2中的SEQ ID N0s:l至24)，如美国专利公开文本 No.2012/0077200中描述的。在一些实施方案中，将其中披露的正向和反向引物对之任一种 用于本文公开的改进方法中。在一个优选的实施方案中，将SEQ ID N0:1(正向）和SEQ ID NO: 2 (反向）的正向和反向引物对用于本文提供的改进方法中。
[0162] 为了检测TGFW基因外显子4的鸟嘌呤到腺嘌呤突变，如美国专利公开文本2012/ 0077200中描述的，构建了荧光标记的实时PCR探针对，用于检测野生型（"G"）和阿维利诺角 膜营养不良有关的突变体（"A"）等位基因，其具有根据如图3中显示的SEQ ID NOs: 25至42 的核苷酸序列。在一些实施方案中，将任意的野生型和突变体探针用于本文公开的改进方 法中。在一个优选的实施方案中，将SEQ ID N0:25(野生型）和SEQ ID N0:26(突变体）的野 生型和突变体探针对用于本文提供的改进方法中。为了将野生型等位基因与疾病相关的等 位基因区分，将野生型探针用VIC标记，突变体探针用FAM标记。小沟结合剂(MGB)附接于探 针以促进对互补基因片段的结合。
[0163] b.实时PCR循环
[0164] 实时PCR方法包括多个步骤或循环作为扩增方法的一部分。这些循环包括将双链 核酸变性、将正向引物、反向引物和检测探针与靶基因组DNA序列退火，和从退火的正向引 物和反向引物合成（即复制)第二链DNA。这种三步骤过程在本文称为循环。
[0165] 在一些实施方案中，采用约10，15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60个循环。在一 些实施方案中，采用约10至约60个循环，约20至约50或约30至约40个循环。在一些实施方案 中，采用40个循环。
[0166] 在一些实施方案中，将双链核酸变性的步骤在约80°C至100°C，约85°C至约99°C， 约90 °C至约95°C的温度进行约1秒至约5秒，约2秒至约5秒，或约3秒至约4秒。在一些实施方 案中，将双链核酸变性的步骤在95 °C的温度进行约3秒。
[0167] 在一些实施方案中，将正向引物、反向引物和检测探针与靶基因组DNA序列退火的 步骤在约40°C至约80°C，约50°C至约70°C，约55°C至约65°C进行约15秒至约45秒，约20秒至 约40秒，约25秒至约35秒。在一些实施方案中，将正向引物、反向引物和检测探针与靶基因 组DNA序列退火的步骤在约60 °C进行约30秒。
[0168] 在一些实施方案中，从退火的正向引物和反向引物合成（即复制）第二链DNA在约 40°C至约80°C，约50°C至约70°C，约55°C至约65°C进行约15秒至约45秒，约20秒至约40秒， 约25秒至约35秒。在一些实施方案中，将正向引物、反向引物和检测探针与靶基因组DNA序 列退火的步骤在约60 °C进行约30秒。
[0169] 在一些实施方案中，发现根据本文描述的方法制备的约lyL，约2yL，约3yL，约4yL 或约5yL的基因组DNA样品与仅约0.05yL，约0.10yL约0.15yL，约0.20yL，约0.25yL或约0.25 yL的30X，35X，40X，45X，50X或100X实时PCR测定混合物及蒸馏水组合以形成PCR主混合物。 在一些实施方案中，所述PCR主混合物具有约5yL，约6yL，约7yL，约8yL，约9yL，约OyL，约11μ L，约12yL，约13yL，约14yL，约15yL，约16yL，约17yL，约18yL，约19yL或约20yL或更高的终体 积。在一些实施方案中，发现如上文描述制备的2yL基因组DNA样品与仅约0.15yL的40X实时 PCR测定混合物和2.85yL蒸馏水组合以形成PCR主混合物。
[0170] 尽管本文描述了例示性反应，但技术人员理解如何基于探针设计改变温度和时 间。而且，所述方法涵盖上述时间和温度的任何组合。
[0171] c.PCR引物和引物设计
[0172] 在一些实施方案中，在实验室设置下测试和设计引物。在一些实施方案中，通过基 于计算机的计算机方法(in silico method)来设计引物。引物序列基于要扩增的扩增子或 靶核酸序列的序列。较短的扩增子通常比更长的扩增子更有效复制且实现更有效的扩增。
[0173] 在设计引物时，技术人员会理解需要考虑熔解温度(Tm;-半的引物-靶物双链体 解离且变成单链的温度，其是双链体稳定性的指示；增加的T m指示增加的稳定性），其基于 所设计的引物的GC和AT含量，以及二级结构考虑(增加的GC含量可导致增加的二级结构）。 可使用本领域已知的多种方法计算Tm且技术人员会容易地理解用于计算T M的这类多种方 法；此类方法包括例如但不限于那些可获的在线工具，如可在万维网上promega.com/ techserv/tools/biomath/calcll .htm处得到的Tm计算器。引物特异性由其完整序列与3' 端序列(其为被Taq聚合酶延伸的部分)的组合限定。在一些实施方案中，3'端应具有未在革巴 序列中任何他处发现的至少5至7个独特的核苷酸，以帮助减少错误引发和创造不正确的扩 增产物。正向和反向引物通常以相似的效率结合靶物。在一些情况下，采用工具如NCBI BLAST(位于万维网上ncbi . nlm. nih. gov处)来实施比对和辅助引物设计。
[0174] 本领域技术人员公知针对靶核酸序列的引物设计的基础，且许多参考手册和教科 书关于这类方法具有详细的教导，包括例如，Molecular Cloning(three volume set,Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)和Current Protocols(Genetics and Genomics;Molecular Biology;2003_2013)和Real-time PCR in Microbiology:From Diagnostics to Characterization(Ian M.MacKay,Calster Academic Press;2007);可 在万维网上primerdigital · com/tools/PrimerAnalyser · html处得至lj的PrimerAnalyser java工具，和Kalendar R,等(Genomics,98(2) :137-144(2011)),其所有完整并入本文用于 所有目的。
[0175] 引物设计的另一个方面是引物复杂性或语言序列复杂性（参见，Kalendar R，等 (Gen〇miCS，98(2): 137-144(2011))。具有更大语言序列复杂性(例如核苷酸排列和组成）的 引物通常更有效。在一些实施方案中，使用语言序列复杂性计算方法来寻找比较的序列之 间的保守区，以用于检测低复杂性区域，包括简单序列重复、不完美的直接或倒置重复、多 嘌呤和多嘧啶三链cDNA结构和四链结构（如G-四链体）。在一些实施方案中，沿全序列长度 使用字母表-能力（&]^11&&61：-〇&口&(3；^7)]^-8^1]1方法实施语言复杂性（]^〇测量（参见 A·Gabrielian，A.Bolshoy，Computer&Chemistry 23:263-274(1999)和Y.L.Orlov, V.N.Potapov, Complexity :an internet resource for analysis of DNA sequence complexity，Nucleic Acids Res · 32 :W628_W633(2004))，并计算为序列中观察范围（xi)从 1至L大小字的总和除以该序列长度的预期(E)值的总和。一些富含G(和富含C)的核酸序列 折叠成四链DNA结构，其含有G-四重体的堆积(参见万维网上quadruplex. org处）。一些情况 中，这些四链体通过两个或四个DNA分子的分子内联合，含有两个G碱基的序列的二聚化，或 通过含有4个鸟嘌呤块的单链的分子内折叠形成(参见P. S. Ho，PNAS，91:9549-9553(1994); I·Α·II'icheva，V.L.Florent'ev,Russian Journal of Molecular Biology26:512-531 (1992)；D.Sen,ff.Gilbert,Methods Enzymol.211:191-199(1992)；P.A.Rachwal,K.R.Fox, Methods 43:291-301(2007)；S.Burge,G.N.Parkinson,P.Hazel,A.K.Todd,K.Neidle, Nucleic Acids Res.34:5402-5415(2006)；A.Guedin,J.Gros,P.Alberti,J.Mergny, Nucleic Acids Res.38:7858-7868(2010)；0.Stegle,L.Payet,J.L.Mergny,D.J.MacKay, J.H.Leon,Bioinformatics 25: i374-i382(2009);在一些情况中，由于其低语言复杂性(对 于(TTAGGG) 4为LC = 32 % )，将这些从引物设计除去。
[0176] 这些方法包括多种生物信息学工具用于在具有GC偏倚(skew)，（G_C)/(G+C)，AT偏 倚，（A-T)/(A+T)，CG-AT偏倚，（S-W)/(S+W)、或嘌呤-嘧啶(R-Y)/(R+Y)偏倚的序列中关于GC 含量和熔解温度的模式分析，并提供用于测定语言序列复杂性概况的工具。例如，在η(其中 η是正整数)的滑窗中的GC偏倚，碱基用一个碱基一步计算，根据公式(G-C)/(G+C)，其中对 于窗口中的所有序列G是鸟嘌呤的总数且C是胞嘧啶的总数(Y. Beni ta，等，Nuc 1 ei c Acids Res. 31: e99 (2003))。正GC-偏倚值指示G碱基过多，而负GC-偏倚值代表C碱基过多。类似地， 在序列中计算其他偏倚。在一些实施方案中，采用这类方法以及其他方法来确定引物复杂 性。
[0177] 根据非限制性实施方案例子，使用外切核酸酶引物实施实时PCR(TAQMAN?探 针）。在这类实施方案中，引物利用热稳定性聚合酶如Taq的5'外切核酸酶活性来切割扩增 反应中存在的双重标记的探针（参见例如，Wittwer，C.等Biotechniques 22 : 130-138， 1997)。尽管与PCR产物互补，该测定中使用的引物探针不同于PCR引物且用能发荧光的分子 和能猝灭荧光的分子双重标记。当探针完整时，DNA探针内的荧光信号的分子内猝灭导致极 小信号。当荧光分子被扩增期间Taq的外切核酸酶活性释放时，猝灭极大降低，导致增加的 荧光信号。荧光探针的非限制性例子包括6-羧基-荧光素模块等。例示性猝灭剂包括Black Hole Quencher 1 模块等。
[0178] 多种PCR引物可以适用于所公开的方法。例示性引物包括但不限于本文中描述的 那些。用于所公开方法的引物亦见于美国专利公开文本No. 20120077200,其通过提述并入 本文用于所有目的。在一些实施方案中，用于本公开方法的PCR引物包括但不限于表1中列 出的以下内容，且适用于检测TGFW基因。表2和3提供每种引物的生物物理参数，如使用万 维网上primerdigital · com/tools/PrimerAnalyser.html处计算的。
[0179] 表1:用于TGFW基因的例示性引物
[0182]
[0183] 表2:用于正向引物的生物物理参数
[0184]
[0185]
[0186] 表3:反向引物的生物物理参数
[0188]
[0189] 在一些实施方案中，用于所公开方法的实时PCR引物具有至少70%，至少72%，至 少75 %，至少77 %，至少80 %，至少82 %，至少85 %，至少88 %，至少90 %，至少92 %，至少 95%，至少97%或至少99%的语言序列复杂性。
[0190] d.检测探针设计和检测探针
[0191] 多种检测探针可以适用于所公开的方法并用于基因型分型和/或定量。本领域技 术人员通常采用的检测探针包括但不限于，水解探针(也称为TAQMAN?探针、5'核酸酶 探针或双标记探针），杂交探针，和Scorpion引物(其在一个分子中组合引物和检测探针）。 在一些实施方案中，本领域技术人员基于期望的探针靶物决定检测探针设计，使得探针与 采用的PCR引物相容(例如，引物和探针不应在实时PCR测定中干扰彼此的功能）。在一些实 施方案中，探针设计为具有比引物更高的Tm，以促进有效的信号产生。使用本领域已知的多 种方法的任一种来计算!》且技术人员会容易地理解用于计算Tm的多种这类方法;这类方法 包括例如在线可获的那些工具，如可在万维网上promega · com/techserv/tools/biomath/ calcll.htm处获得的计算器。在一些实施方案中，检测探针的增加的Tm提供了在引物被聚 合酶延伸前检测探针已结合。
[0192] 在一些实施方案中，检测探针含有多种修饰。在一些实施方案中，检测探针包括经 修饰的核酸残基，如但不限于2'-0_甲基核糖核苷酸修饰、硫代磷酸酯主链修饰、二硫代磷 酸酯主链修饰、氨基磷酸酯（p h 〇 s p h 〇 r a m i d a t e )主链修饰、甲基膦酸酯 (methy lphosphonate)主链修饰、3 '末端磷酸根修饰和/或3 '经基取代。
[0193] 在一些实施方案中，所述检测探针由于修饰对于靶序列具有增加的亲和力。这类 检测探针包括具有增加的长度的检测探针，以及含有化学修饰的检测探针。这类修饰包括 但不限于2 ' -氟(2 ' -脱氧-2 ' -氟-核苷)修饰、LNA(锁核酸）、PNA(肽核酸）、ZNA(zip核酸）、吗 啉代、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、聚阳离子缀合物和2'-芘(pyrene)修饰。在一些实施方案中， 检测探针含有一种或多种修饰，包括2 '氟修饰(又称为，2 脱氧-2 氟-核苷）、LNA(锁核 酸）、PNA(肽核酸）、ZNA(zip核酸）、吗啉代、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、和/或聚阳离子缀合物。
[0194] 在一些实施方案中，所述检测探针含有可检测的模块，如本文中描述的那些，以及 本领域技术人员已知的任何可检测模块。这类可检测模块包括例如但不限于荧光标记物和 化学发光标记物。这类可检测模块的例子还包括FRET对的成员。在一些实施方案中，所述检 测探针含有可检测实体。
[0195] 荧光标记物的例子包括但不限于AMCA，DEAC(7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸）；7_羟 基-4-甲基香豆素-3; 7-羟基香豆素-3 ;MCA(7-甲氧基香豆素-4-乙酸）；7-甲氧基香豆素-3; AMF(4'_(氨基甲基）荧光素）；5-DTAF(5-(4,6-二氯三嗪基）氨基荧光素）；6-DTAF(6-(4,6-二氯三嗪基）氨基荧光素）；6-FAM(6-羧基荧光素；又称为FAM;包括TAQMAN?FAM?); TAQMAN VIC?; 5 (6) -FAM尸胺；5-FAM尸胺；5 (6) -FAM乙二胺；5-FAM乙二胺；5-FITC (FITC 异 构体I;荧光素-5-异硫氰酸酯）；5-FITC尸胺;荧光素-5-马来酰亚胺;5-IAF(5-碘乙酰氨基 荧光素）；6-J0E (6-羧基-4 '，5 ' -二氯-2 '，7 ' -二甲氧基荧光素）；5-CR1 10( 5-羧基罗丹明 110) ;6-CRl 10(6-羧基罗丹明 110) ;5-CR6G(5-羧基罗丹明6G) ;6-CR6G(6-羧基罗丹明6G); 5(6)-駿基罗丹明6G尸胺（5(6)-Caroxyrhodamin 6G cadaverine); 5(6)-駿基罗丹明6G乙 二胺；5-R0X( 5-羧基-X-罗丹明）；6-R0X(6-羧基-X-罗丹明）；5-TAMRA( 5-羧基四甲基罗丹 明）；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明）；5-TAMRA尸胺;6-TAMRA尸胺;5-TAMRA乙二胺;6-TAMRA 乙二胺；5-TMR C6马来酰亚胺;6-TMR C6马来酰亚胺;TR C2马来酰亚胺;TR尸胺;5-TRITC;G 异构体（四甲基罗丹明-5-异硫氰酸）；6-TRITC;R异构体（四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯）；丹 酰尸胺（5-二甲基氨基萘-1-(Ν-(5-氨基戊基））磺酰胺）；EDANS C2马来酰亚胺；荧光胺； NBD;和吡略甲川（pyrromethene)及其衍生物。
[0196] 化学发光标记物的例子包括但不限于用于Southern印迹和Western印迹方案的那 些标记物（参见例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, (3rd ed. )(2001);通过提述完整并入本文）。例子包括但不限于_(2'_螺旋金刚烷)-4-甲氧基ΙΟ"-磷酰基氧) 苯基-1 ， 2-二氧杂环丁烧 (dioxetane) (AMPPD); B 丫啶酯和金刚烷基-稳定化 的1，2-二氧杂环丁烷，及其衍生物。
[0197] 探针的标记是本领域已知的。使用经标记的探针以在扩增期间在经扩增区域内杂 交。修饰探针以避免其充当用于扩增的引物。检测探针用两种荧光染料标记，一种能将另一 种染料的荧光猝灭。一种染料附接于探针的5'末端而另一种附接于内部位点，从而使得当 探针处于非杂交状态时发生猝灭。
[0198] 实时PCR探针通常由涉及荧光共振能量转移(FRET)的一对染料(报导染料和接受 者染料)组成，其中接受者染料猝灭报导染料的发射。一般地，用荧光标记的探针增加扩增 子定量的特异性。
[0199] 在所公开方法的在一些实施方案中使用的实时PCR还包括使用一种或多种杂交探 针（即检测探针），如由本领域技术人员根据本公开确定的。作为非限制性的例子，这类杂交 探针包括但不限于所描述方法中提供的那些探针的一种或多种。例示性探针，如HEX通道 和/或FAM通道探针，是本领域技术人员了解的。
[0200] 根据示例实施方案，便利地选择检测探针和引物，例如使用利用引物设计软件的 计算机分析和对存储在国家生物技术信息中心(NCBI)的基因和基因组的可获核苷酸数据 库进行交叉参照。在一些实施方案中，可以使用一些另外的指导来选择引物和/或探针。例 如，在一些实施方案中，选择引物和探针使得其彼此靠近，但不重叠。在一些实施方案中，弓丨 物可具有相同（或接近的Tm)(例如在约58°C和约60°C之间）。在一些实施方案中，探针的Tm比 对引物的T M选择的TM高约10°C。在一些实施方案中，选择探针和引物的长度为约17至39个碱 基对等。在一些情况中本领域技术人员使用这些和其他指导来选择适宜的引物和/或探针。
[0201]用于本发明方法的探针包括但不限于表4中所列的以下例示性探针。
[0202] 表4:TGFW基因的例示性探针
[0203]
[0205]
[0206] VIL·诊断测试
[0207] 在一些实施方案中，采用诊断测试通过检测多种突变中的任一种来确定一种或多 种遗传条件。在一些实施方案中，当基于例如身体表现、迹象和/或症状以及家族史信息怀 疑特定疾患时，使用诊断测试来确认诊断。在一些实施方案中，诊断测试的结果有助于医学 领域的那些技术人员确定对于给定患者的适宜治疗方案并允许更个体化和更有效的治疗 方案。在一些实施方案中，治疗方案包括多种药物治疗、手术治疗、生活方式改变或其组合 的任一种，如由本领域技术人员确定的。
[0208] 通过所公开方法获得的核酸可用于多种诊断测试，包括用于检测突变如缺失、插 入、颠换和转换的测试。在一些实施方案中，这类诊断可用于鉴定携带针对某疾病的基因的 一个拷贝的未受影响的个体，所述疾病需要表达针对该疾病的两个拷贝，鉴定携带针对某 疾病的基因的一个拷贝的未受影响的个体，其中信息可适用于形成治疗方案，植入前 (口代；[11^|131^31：；[011)遗传诊断，出生前诊断测试，新生筛选，系谱0嫩测试（用于遗传系谱目 的），用于预测成人发作病症如亨廷顿氏病(Huntington's disease)的症状前测试，用于估 测形成成人发作的癌症和阿耳滋海默氏病的风险的症状前测试，症状性个体的确认性诊 断，和/或法医/身份测试。在一些实施方案中，本方法适用于检测角膜营养不良。在一些实 施方案中，经由例如检测阿维利诺角膜营养不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致 TGFW基因中R124突变的那些(包括例如但不限于TGFW基因的核苷酸418处由G至A转换导 致的R124H突变，也称为C(G/A)C SNP)。在一些实施方案中，经由检测例如颗粒状角膜营养 不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致TGFW基因中R555突变的那些(包括例如但不 限于TGFW基因的核苷酸1663处由C至T转换导致的R555W突变，也称为(C/T)GG SNP)。在一 些实施方案中，经由例如检测格子状营养不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致TGF0 I基因中R124和/或626突变的那些(包括例如但不限于TGFW基因的核苷酸417处由C至T转 换导致的R124C突变，也称为(C/T)GC SNP，或TGFW基因的核苷酸1924处由A至C转换导致的 H626P突变）。在一些实施方案中，经由检测例如Reis-bucklers角膜营养不良相关的SNP来 检测角膜营养不良，如导致TGFW基因中R124突变的那些(包括例如但不限于TGFW基因的 核苷酸418处由G至T转换导致的R124L突变，也称为C(G/T)C SNP)。在一些实施方案中，经由 检测例如Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP来检测角膜营养不良，如导致TGFW基因中 R555突变的那些(包括例如但不限于TGFW基因的核苷酸1664处由G至A转换导致的R555Q突 变，也称为C(G/A)G SNP)。
[0209] 在一些实施方案中，新生儿筛选包括刚出生后采用的任何遗传筛选以鉴定遗传病 症。在一些实施方案中，新生儿筛选适用于鉴定遗传病症，从而在生命早期确定治疗方案。 这类测试包括但不限于测试婴儿的苯丙酮尿和先天甲状腺机能减退。
[0210] 在一些实施方案中，采用携带者测试(carrier testing)来鉴定携带单拷贝的基 因突变的人。在一些情况中，当存在两拷贝时，突变可导致遗传病症。在一些情况中，一个拷 贝足以导致遗传病症。在一些情况中，两拷贝的存在是禁用特定治疗方案的，如阿维利诺突 变的存在和在进行手术规程之前的预筛选以确保对给定的患者进行适宜的治疗方案。在一 些实施方案中，这类信息也可用于个体考虑生育和协助个体制定知情的决策，以及协助医 学领域的技术人员对个体患者以及患者家属提供重要的建议。
[0211] 在一些实施方案中，使用预测性和/或症状前测试类型来检测与多种病症有关的 基因突变。在一些情况中，这些测试协助有患遗传病症的家族成员但在测试时可以不显示 病症特征的人。在一些实施方案中，预测性测试鉴定提高人的形成具有遗传基础的病症的 几率的突变，所述病症包括例如但不限于某些癌症类型。在一些实施方案中，症状前测试可 用于在出现任何身体迹象或症状之前确定人是否会形成遗传病症。预测性和症状前测试的 结果提供了关于人形成特定病症的风险的信息，且帮助制定对于患者以及患者家属的适宜 医学治疗方案的决策。在一些实施方案中，还采用预测性测试来检测某些治疗方案禁用的 突变，如存在阿维利诺突变则不当实施LASIK手术和/或其他屈光手术（refractive procedure)，如但不限于光治疗性角膜切除术(PTK)和/或光折射性角膜切除术(PRK)。例 如，展现阿维利诺突变的患者不应进行LASIK手术或其他屈光手术。
[0212] 在一些实施方案中，诊断测试还包括药物基因组学(口1^1'1]^(3〇861101]1；^8)，其包括 确定遗传变异对药物应答的影响的遗传测试。来自这类药物基因组学分析的信息适用于确 定和形成适宜的治疗方案。医学领域的技术人员在设计适宜治疗方案时采用关于遗传变异 的存在和/或缺乏的信息。
[0213]在一些实施方案中，使用本公开的方法确定遗传概况(profile)的疾病包括但不 限于，眼科病症、癌症、糖尿病、高血压、精神分裂症、和最常见的先天畸形，如唇裂、颚裂、神 经管缺陷、软骨发育不全、Alpha-Ι抗胰蛋白酶缺陷、抗磷脂综合征、孤独症、常染色体显性 多囊性肾病、〇^1'0〇1：-]\^146-1'〇〇1：11、结肠癌、(]1^(111(31131：、克罗恩病、囊性纤维化病 (Cystic fibrosis)、德卡姆病（Dercum Disease)、唐氏综合征、杜安综合征（Duane Syndrome)、迪谢内肌营养不良（Duchenne Muscular Dystrophy)、因子 V Leiden 血检形成 倾向、家族性血胆脂醇过多、家族性地中海热、脆性X综合征(Fragile X Syndrome)、戈谢病 (Gaucher Disease)、血色素沉积症、血友病、前脑无裂畸形(Holoprosencephaly)、亨延顿 氏舞蹈病（Huntington' s disease)、克兰费尔特综合征(Klinefelter syndrome)、马方综 合征（Marfan syndrome)、强直性肌营养不良、神经纤维瘤病、努南综合征（Noonan Syndrome)、成骨不全(Osteogenesis imperfecta)、帕金森病、苯丙酮尿、Poland异常、卟啉 症(Porphyria)、早衰症(Progeria)、视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa)、重症联合 免疫缺陷（SCID)、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩（Spinal Muscular Atrophy)、戴萨克斯症 (Tay-Sachs)、地中海贫血（Thalassemia)、三甲基胺尿（Trimethylaminuria)、特纳综合征 (Turner Syndrome)、Velocardiofacial综合征、WAGR综合征、威尔逊病（Wilson Disease)、 以及具有遗传组分的任何其他疾病。眼科病症和/或包括眼科组分的病症包括但不限于，睑 板腺囊肿（chalazion)、麦粒肿（stye)、倒睫（trichiasis)、睑内翻（entropion)、睑外翻 (ectropion)、兔眼症（lagophthalmos)、bleharitis、泪囊炎（dacryocystitis)、眶蜂窝织 炎（orbital cellulitis)、ptergium、翼状胬肉（pterygium)角膜营养不良、结膜炎 (conjuctivitis)、新生儿眼炎(ophtalmia neonatorum)、细菌性角膜溃疡、真菌性角膜溃 疡、青光眼、富克斯营养不良（Fuchs Dystrophy)、圆锥角膜(keratoconus)、老年黄斑变性 (Advanced Macular Degeneration)、视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa)、白内障、 retinal disorecers、黄斑变性、糖尿病眼问题(例如糖尿病视网膜病变）、睑裂狭小-下垂-内耻[；赘皮-倒向综合征(BPES)、眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism)、马方综合征、 Stickle综合征、和CHARGE (缺损（coloboma)、心异常、后鼻孔闭锁（atresia of the choanae)、生长和发育迟滞、生殖/泌尿道异常、耳异常或耳聋)综合征。角膜营养不良包括 但不限于，阿维利诺角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、格子状I型（lattice type I)角 膜营养不良、富克斯营养不良（Fuchs Dystrophy)、Thiel_Behnke和Reis-bucklers角膜营 养不良。癌症包括但不限于，癌、肉瘤、母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤、和未知起源 的癌症。在一些实施方案中，癌症包括但不限于，头和颈癌、皮肤癌、结肠癌、口腔癌、成胶质 细胞瘤、乳腺癌、喉癌、食道癌、内皮癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、泌尿生殖器癌、直肠癌、 前列腺癌、肾癌、黑素瘤、肾癌、胰腺癌、胃肠癌、血液癌、肝癌、子宫癌和脑癌以及病毒诱导 的癌症，如乳头状瘤病毒诱导的癌症。
[0214] 在一些实施方案中，本方法适用于开发个体化的医学治疗方案，其通过提供用于 测定个体的遗传概况的基因组DNA。在一些实施方案中，本领域技术人员采用这类遗传概况 信息以决定和/或形成治疗方案。在一些实施方案中，本领域技术人员使用在通过所描述的 方法分离的核酸中鉴定的多种遗传变异和突变的存在和/或缺乏作为个体化医学方案或计 划的一部分。例如，在一些实施方案中，将使用所公开方法获得的信息与数据库或其他建立 的信息比较以确定对指定疾病的诊断和/或确定治疗方案。在一些情况中，将关于特定患者 中遗传突变的存在或缺乏的信息与数据库或其他标准信息来源比较以做出关于提出的治 疗方案的决定。在一些情况中，遗传突变的存在指示采纳特定治疗方案。在一些情况中，遗 传突变的缺乏指示不采纳特定治疗方案。
[0215] 在一些实施方案中，使用关于特定遗传突变的存在和/或缺乏的信息来确定用治 疗实体治疗的治疗功效，以及修改治疗方案以用治疗实体治疗。在一些实施方案中，采用关 于遗传突变的存在和/或缺乏的信息来确定是否采纳某个治疗方案。在一些实施方案中，采 用关于遗传突变的存在和/或缺乏的信息来确定是否持续治疗方案。在一些实施方案中，采 用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否中断治疗方案。在其他实施方案中，利用遗传突变 的存在和/或缺乏来确定是否修改治疗方案。在一些实施方案中，利用遗传突变的存在和/ 或缺乏来确定是否增加或降低作为治疗方案的一部分施用的治疗剂量。在其他实施方案 中，利用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否改变作为治疗方案的一部分施用的治疗的 给药频率。在一些实施方案中，利用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是否改变每日、每周 的剂量数，每治疗日的次数。在一些实施方案中，利用遗传突变的存在和/或缺乏来确定是 否改变治疗的剂量量。在一些实施方案中，在启动治疗方案之前和/或在开始治疗方案之后 确定遗传突变的存在和/或缺乏。在一些实施方案中，确定遗传突变的存在和/或缺乏，并与 关于遗传突变的存在或缺乏的预确定的标准信息比较。
[0216] 在一些实施方案中，使用所公开的方法生成了超过一种遗传突变的存在和/或缺 乏的复合(composite )，且这类复合包括关于超过一种遗传突变的存在和/或缺乏的信息的 任意集合。在一些实施方案中，检查2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多 种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、 30种或更多种、或40种或更多种遗传突变的存在或缺乏，并用于生成复合。在一些实施方案 中，例示信息包括核酸或蛋白质信息，或关于核酸和/或蛋白质遗传突变两者的信息的组 合。一般地，复合包含关于遗传突变的存在和/或缺乏的信息。在一些实施方案中，这些复合 用于与预确定的标准信息比较以采纳、维持或中断某治疗方案。
[0217] 在一些实施方案中，经由例如检测选自但不限于以下的2,3,4或5种SNP来检测角 膜营养不良：阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、颗粒状角膜营养不良相关的SNP、格子状营 养不良相关的SNP、Rei S-BuCkler角膜营养不良相关的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养不 良相关的SNP。在一些实施方案中，经由例如检测阿维利诺角膜营养不良相关的SNP与颗粒 状角膜营养不良相关的SNP、格子状营养不良相关的SNP、Rei S-BuCkler角膜营养不良相关 的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不良角膜营养 不良。在一些实施方案中，经由例如检测颗粒状角膜营养不良相关的SNP与阿维利诺角膜营 养不良相关的SNP、格子状营养不良相关的SNP、Rei S-BuCkler角膜营养不良相关的SNP、和/ 或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中， 经由例如检测格子状营养不良相关的SNP与阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、颗粒状角膜 营养不良相关的SNP、Rei S-BuCkler角膜营养不良相关的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养 不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP与阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、颗粒状角膜营养不 良相关的SNP、格子状营养不良相关的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP的 组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测Thiel-Behnke角膜营养不良 相关的SNP与阿维利诺角膜营养不良相关的SNP、颗粒状角膜营养不良相关的SNP、格子状营 养不良相关的SNP、和/或Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP的组合来检测角膜营养不 良。
[0218]在一些实施方案中，经由例如检测选自阿维利诺角膜营养不良相关的SNP的2,3， 4，5和/或6种SNP来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，所述SNP包括导致人TGFW基因 编码的多肽的位置124,555和/或626处突变的3即。这些突变包括导致了6邱1基因中1?124突 变的那些(包括例如但不限于由TGFW基因的核苷酸418处的G至A转换导致的R124H突变，也 称为C(G/A)C SNP)，颗粒状角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFW基因中R555突变的那些 (包括例如但不限于由TGFW基因的核苷酸1663处的C至T转换导致的R555W突变，也称为(C/ T)GG SNP)，格子状营养不良相关的SNP，如导致TGFW基因中R124突变的那些(包括例如但 不限于由TGFW基因的核苷酸417处的C至T转换导致的R124C突变，也称为(C/T)GC SNP)， Reis-Buckler角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFW基因中R124突变的那些(包括例如但 不限于由TGFW基因的核苷酸418处的G至T转换导致的R124L突变，也称为C(G/T)C SNP)和/ 或Thiel-Behnke角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFW基因中R555突变的那些(包括例如 但不限于由TGFI3I基因的核苷酸1664处的G至A转换导致的R555Q突变，也称为C(G/A)G SNP)。在一些实施方案中，经由例如以下的检测来检测角膜营养不良：阿维利诺角膜营养不 良相关的SNP，如导致TGFW基因中R124突变的那些(包括例如但不限于由TGFW基因的核苷 酸418处的G至A转换导致的R124H突变，也称为C(G/A)C SNP)与颗粒状角膜营养不良相关的 SNP，如导致TGFW基因中R555突变的那些(包括例如但不限于由TGFW基因的核苷酸1663处 的C至T转换导致的R555W突变，也称为(C/T)GG SNP)的组合。在一些实施方案中，经由例如 以下的检测来检测角膜营养不良：阿维利诺角膜营养不良相关的SNP，如导致TGFW基因中 H626P突变的那些（包括例如但不限于由TGFI3I基因的核苷酸1924处的A到C转换导致的 H626P 突变）。
[0219] 在一些实施方案中，经由例如 1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551，1?5550和/或!1626?中2， 3,4,5和/或6种的检测来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如1?124(：，1?124!1， R124L，R555W和/或R555Q中2,3,4和/或5种的检测来检测角膜营养不良。在一些实施方案 中，经由例如检测R124C与R124H，R124L，R555W和/或R555Q中一种或多种的组合来检测角膜 营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测R124H与R124C，R124L，R555W和/或R555Q中一 种或多种的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经由例如检测R555W与R124C， R124H，R124L和/或R555Q中一种或多种的组合来检测角膜营养不良。在一些实施方案中，经 由例如检测R555Q与R124C，R124H，R124L和/或R555W中一种或多种的组合来检测角膜营养 不良。在一些实施方案中，检测R124H与R555W的组合。在一些实施方案中，经由例如检测 H262P与1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551和/或1?555〇中一种或多种的组合来检测角膜营养不良。 在一些实施方案中，1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551和/或1?555〇都检测。在一些实施方案中， R124C，R124H，R124L，R555W，R555Q和/或 H626P都检测。
[0220] VIII.诊断试剂盒
[0221] 在一些实施方案中，将上文描述的任何或所有试剂包装到诊断试剂盒中。这类试 剂盒包括本文中描述的，以任意组合的任何和/或所有的引物、探针、缓冲剂、和/或其他试 剂。在一些实施方案中，该试剂盒包含用于检测1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551，1?555〇和/或 H626P中的2,3,4,5和/或6种的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测1?124(：， R124H，R124L，R555W和R555Q中的2,3,4,和/或5种的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含 用于检测R124C，R124H和R124L的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555W和 R555Q的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C的试剂。在一些实施方案中， 试剂盒包含用于检测R124H的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124L。在一些 实施方案中，试剂盒包含用于检测R555W的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测 R555Q的试剂。
[0222] 在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测町24(：，1?124!1，1?12礼，1?5551，1?555〇和/或 H626P中2，3，4，5和/或6种的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C， R124H，R124L，R555W和R555Q中2,3,4,和/或5种的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒 包含用于检测R124C，R124H和R124L的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检 测R555W和R555Q的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124C的引物和探 针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R124H的引物和探针。在一些实施方案中，试剂 盒包含用于检测R124L的引物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555W的引 物和探针。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测R555Q的引物和探针。在一些实施方案 中，试剂盒包含用于检测H626P的引物和探针。
[0223] 在一些实施方案中，试剂盒中的试剂作为冻干粉末纳入。在一些实施方案中，试剂 盒中的试剂作为冻干粉末纳入，并有重建的用法说明。在一些实施方案中，试剂盒中的试剂 作为液体纳入。在一些实施方案中，试剂包含在塑料和/或玻璃管形瓶或其他适宜容器中。 在一些实施方案中，引物和探针均含有在试剂盒中的各个容器中。在一些实施方案中，将引 物一起包装在一个容器中，而将探针一起包装在另一个容器中。在一些实施方案中，将引物 和探针一起包装在单个容器中。
[0224] 在一些实施方案中，试剂盒还包括对照gDNA和/或DNA样品。在一些实施方案中，包 含的对照DNA样品是TGFBI R124正常的。在一些实施方案中，包含的对照DNA样品对应于所 检测的突变，包括R124C，R124H，R124L，R555W，R555Q和/或H626P。在一些实施方案中，纳入 对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551，1?555〇和/或 H626P的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和 对应于1?124(：，1?124!1，1?12礼，1?5551和/或1?555〇的突变0嫩样品。在一些实施方案中，纳入对 应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R124C，R124H和/或R124L的突变DNA样品。在 一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于R555W和/或R555Q 的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于 R124C的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常DNA的对照DNA样品， 和对应于R124H的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA 样品，和对应于R124L的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对 照DNA样品，和对应于R555W的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正 常的对照DNA样品，和对应于R555Q的突变DNA样品。在一些实施方案中，纳入对应于TGFBI R124正常的对照DNA样品，和对应于H626P的突变DNA样品。在一些实施方案中，对照DNA样品 的浓度是 5ng/yL，1 Ong/yL，20ng/yL，30ng/yL，40ng/yL，50ng/yL，60ng/yL，70ng/yL，80ng/y L,90ng/yL,100ng/yL,110ng/yL,120ng/yL,130ng/yL,140ng/yL,150ng/yL,160ng/yL, 170ng/yL，180ng/yL，190ng/yL或200ng/yL。在一些实施方案中，对照DNA样品的浓度是 50ngAiL，100ngAxL，150ngAiL或200ng/yL。在一些实施方案中，对照DNA样品的浓度是 lOOng/yL。在一些实施方案中，对照DNA样品具有相同的浓度。在一些实施方案中，对照DNA 样品具有不同的浓度。
[0225] 在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含缓冲剂，例如GTXpress TAQMAN?试 剂混合物或任何等同缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂包括本文描述的任何缓冲剂。
[0226] 在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含用于克隆的试剂，如载体(包括例如M13 载体)。
[0227] 在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于DNA纯化的试剂。
[0228] 在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于使用试剂盒来检测受试者中角膜营养 不良的用法说明书。在一些实施方案中，这些用法说明书包含本文描述的方案的多个方面。 实施例
[0229] 实施例 1 :DNA提取（DNA Extract All Reagents，ThermoFisher)
[0230] 如下文描述的且依照本文提供的公开内容从口腔上皮或发根或全血提取DNA。
[0231] 对于从口腔上皮或发根的DNA提取，首先将样品在IX PBS 300yL中预处理。接着， 向管添加30yL裂解溶液并涡旋振荡混合物。然后将混合物在95°C温育3min。然后，添加30yL 的0嫩稳定溶液(来自1^€6 16〇1111〇1(^丨68/1'1161'1]1〇3(^6111:丨打〇，1]34)并祸旋振荡混合物。接 着将混合物以13,000RPM离心lmin。
[0232] 对于从全血的DNA提取，以3yL全血开始，首先将样品在IX PBS 300yL中预处理。接 着，向管添加30yL裂解溶液并涡旋振荡混合物。然后将混合物在95°C温育3min。然后，添加 30yL 的DNA 稳定溶液（来自Life Technologies/Thermo Scientific，USA)并祸旋振荡混合 物。接着将混合物以13，000RPM离心lmin。
[0233] 在完成上述规程后，使用商品化Tecan? Infinite_200PR0 NanoQuant的读出DNA 浓度。为了定量，将l〇〇yL的洗脱液移液到透明的96孔板中。接着，向孔HI2添加100yL制备的 空白溶液。然后使用与NanoQuant提供的制造商指导来读出浓度。
[0234] 使用下文表5和6种描述的探针和引物来制备反应混合物。
[0235] 表5:探针序列
[0236]
[0237] 表6:引物序列
[0238]
[0239]
[0240] 用于例示性反应混合物中的组分和比率显示于下文表7中。
[0241] 表7:反应混合物
[0243] 例示性PCR循环条件显示于下文表8中。
[0244] 表8:PCR 循环
[0246] 使用上文方案来生成图4-8中提供的实时PCR数据。
[0247] 参考
[0248] 所有标题和节段命名仅用于清楚和参考目的且不意图以任何方式限制。例如，本 领域技术人员会领会根据本文中描述的发明的精神和范围在适宜时从不同的标题组合多 个方面的有用性。
[0249] 本文中引用的所有参考文献通过提述完整并入本文并用于所有目的，其程度如同 每个公开文本或专利或专利申请具体地且分别地通过提述完整并入用于所有目的的。
[0250] 可以进行对本申请的许多修改和变化而不背离其精神和范围，如对于本领域技术 人员将是明显的。本文描述的具体实施方案和实例仅通过例子提供，且本申请仅由所附权 利要求的项以及权利要求所赋予的等同物的完整范围限制。
[0251] TGFgl 基因序列（NCBI 参考号 NG_012646.1):
[0262] TGFPI基因蛋白产物(gIG-H3蛋白序列；NCBI参考号NG_012646.1):
【主权项】
1. 用于检测来自受试者的样品中与角膜营养不良有关的至少两种基因组等位基因的 方法，所述方法包括： (A) 提供受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端； (B) 在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞； (C) 在完成(B)搅动时，从所述裂解溶液移出该基片； (D) 在(C)移出后温育该裂解溶液； (E) 从所述裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液;和 (F) 使用至少两种寡核苷酸引物对和该gDNA溶液确定TGFW基因中存在的至少两个核 苷酸的身份，其中所述至少两个核苷酸位于TGFW基因的分别的独立的位置处，所述位置对 应于与角膜营养不良有关的分别的独立的单核苷酸多态性(SNP)。2. 根据权利要求1的方法，其中所述TGFW基因中存在的至少两个核苷酸在人基因组中 相隔至少一个核苷酸。3. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对 包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列， 所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。4. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对的至少一对 包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID N0:43的核苷酸序列， 所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。5. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少两种寡核苷酸引物对包含第一扩 增引物对和第二扩增引物对，其中： 所述第一扩增引物对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列；和 所述第二扩增引物对包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID N0:43的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID N0:44的核苷酸序列。6. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述(F)确定进一步包括使用： (i) 具有包含SEQ ID N0:25的核苷酸序列的第一野生型检测探针，和具有包含SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49的核苷酸序列的第一突变体检测探针；和 (ii) 具有包含SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:47的核苷酸序列的第二野生型检测探针，和 具有包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:50的核苷酸序列的第二突变体检测探针。7. 用于检测角膜营养不良的方法，包括： (A) 使用包含至少第一扩增引物对和至少第二扩增引物对的反应混合物从来自人受试 者的生物样品扩增至少两种TGFW基因序列，包括第一 TGFW基因序列和第二TGFW基因序 列，所述第一TGFW基因序列包含编码氨基酸残基124的核苷酸，所述第二TGFW基因序列包 含编码氨基酸残基555的核苷酸； (B) 将第一检测寡核苷酸探针对的第一检测探针杂交至所述第一 TGFW基因序列； (C) 将第二检测寡核苷酸探针对的第二检测探针杂交至所述第二TGFW基因序列;和 (D) 基于至少两种检测探针对的使用检测第一 TGFgI基因序列和/或第二TGFgI基因序 列中的一个或多个突变，所述至少两种检测探针对包括第一检测寡核苷酸探针对和第二检 测寡核苷酸探针对。8. 根据权利要求7的方法，其中检测第一 TGFW基因序列和/或第二TGFW基因序列中的 一个或多个突变包括检测所述第一 TGFW基因序列和/或所述第二TGFW基因序列中的两个 或更多个突变，且所述两个或更多个突变在人基因组中相隔至少一个核苷酸。9. 根据权利要求7或8的方法，其中所述至少第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二 扩增引物，其中所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1且其中所述第二扩增引物 包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。10. 根据权利要求7-9中任一项的方法，其中所述至少第二扩增引物对包含第三扩增引 物和第四扩增引物，其中所述第三扩增引物由核苷酸序列SEQ ID N0:43所示且其中所述第 四扩增引物由核苷酸序列SEQ ID NO:44所示。11. 根据权利要求7或8的方法，其中： 所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第二扩增引物， 所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1， 所述第二扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2， 所述第二扩增引物对包含第三扩增引物和第四扩增引物， 所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43,和 所述第四扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。12. 根据权利要求7-11中任一项的方法，其中所述一个或多个突变之一对应于在编码 的TGFBI蛋白中，在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱氨酸（R124C)，精氨酸突变为组氨酸 (R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。13. 根据权利要求7-12中任一项的方法，其中所述一个或多个突变之一对应于在编码 的TGFBI蛋白中，在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰 胺（R555Q)。14. 根据权利要求7-13中任一项的方法，其中所述至少两种检测寡核苷酸探针对的每 种各自包括第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸 探针和所述第二检测寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对 ：SEQIDN0S:25-26,SEQ ID NOs:25和48,SEQ ID NOs:25和49,SEQ ID NOs:27-28,SEQ ID NOs:29-30,SEQ ID NOs:31-32,SEQ ID NOs:33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs: 39-40,SEQ ID NOs:41-42,SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47,SEQ ID NOs:45和50， 和SEQ ID NOs:47和50。15. 根据权利要求7-14中任一项的方法，其中所述第一检测寡核苷酸探针对包含第一 检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所述第二 检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。16. 根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三 检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四 检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。17. 根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三 检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四 检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。18. 根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三 检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四 检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。19. 根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三 检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和第四检测 寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。20. 根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三 检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四 检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。21. 根据权利要求7-15中任一项的方法，其中所述第二检测寡核苷酸探针对包含第三 检测寡核苷酸探针和第四检测寡核苷酸探针，其中所述第三检测寡核苷酸探针和所述第四 检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。22. 根据权利要求7-21中任一项的方法，其中所述第一检测探针与第一标记物偶联且 所述第二检测探针与第二标记物偶联。23. 根据权利要求22的方法，其中所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是FAM。24. 权利要求7的方法，其中(B)杂交和(C)杂交在相同溶液中同时实施。25. 权利要求7的方法，其中所述(B)杂交和(C)杂交在相同溶液或不同溶液中同时或在 不同时间实施。26. 用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合物，所述反应混合物包含： (A) 至少第一扩增引物对和第二扩增引物对，其用于扩增和确定（1)来自该受试者的生 物样品的至少两种TGFW基因序列的第一TGFW基因序列，其包含编码氨基酸残基124的核 苷酸，和(2)来自该受试者的生物样品的至少两种TGFW基因序列的第二TGFW基因序列，其 包含编码氨基酸残基555的核苷酸;和 (B) 至少两种检测探针对，其中所述至少两种检测探针对的每种中的检测探针与所述 至少两种TGFW基因序列的至少一种杂交。27. 根据权利要求26的反应混合物，其中所述第一扩增引物对包含第一扩增引物和第 二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1，且所述第二扩增引物包含核 苷酸序列SEQ ID NO:2。28. 根据权利要求26或27的反应混合物，其中所述第二扩增引物对包含第三扩增引物 和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:43,且所述第四扩增引物 包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。29. 根据权利要求26-28中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的至少 一种用于检测对应于编码的TGFBI蛋白中的以下突变:在氨基酸124处，精氨酸突变为半胱 氨酸(R124C)，精氨酸突变为组氨酸(R124H)，和/或精氨酸突变为亮氨酸(R124L)。30. 根据权利要求26-29中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的至少 一种用于检测对应于编码的TGFBI蛋白中的以下突变:在氨基酸555处，精氨酸突变为色氨 酸(R555W)和/或精氨酸突变为谷氨酰胺(R555Q)。31. 根据权利要求26-30中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对的分别 的检测探针对各自包括第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检 测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针包含各自选自下组的核苷酸序列对：SEQ ID N0s:25-26，SEQIDN0s:25和48，SEQIDN0s:25和49，SEQIDN0s:27-28，SEQIDN0s:29-30,SEQ ID NOs:31-32,SEQ ID NOs:33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs:39-40,SEQ ID NOs:41-42,SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47,SEQ ID NOs:45和 50,和SEQ ID NOs:47和50。32. 根据权利要求26-31中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包 含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所 述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。33. 根据权利要求26-32中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包 含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和第 二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。34. 根据权利要求26-32中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包 含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所 述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。35. 根据权利要求26-34中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包 含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所 述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。36. 根据权利要求26-35中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包 含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所 述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。37. 根据权利要求24-36中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包 含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所 述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。38. 根据权利要求24-36中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针对之一包 含第一检测寡核苷酸探针和第二检测寡核苷酸探针，其中所述第一检测寡核苷酸探针和所 述第二检测寡核苷酸探针分别包含核苷酸序列对SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。39. 根据权利要求26-38中任一项的反应混合物，其中所述至少两种检测探针的第一检 测探针与第一标记物偶联且所述至少两种检测探针的第二检测探针与第二标记物偶联。40. 根据权利要求39的反应混合物，其中所述第一标记物是VIC且所述第二标记物是 FAM041. 用于检测人受试者中的角膜营养不良的反应混合物，所述反应混合物包含： (A) 至少第一扩增引物对，其用于扩增和确定来自该受试者的生物样品的TGFW基因序 列;和 (B) 至少三种检测探针的组，其中所述至少三种检测探针的组的一种检测探针在暴露 于所述TGFW基因序列时与所述TGFW基因序列杂交。42. 根据权利要求41的反应混合物，其中所述TGFW基因序列包含来自该受试者的生物 样品的编码氨基酸残基124的核苷酸。43. 根据权利要求41或42的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下 组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs :25-42和48-49。44. 根据权利要求41-43中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括 选自下组的至少两种或更多种检测探针:SEQ ID N0s:25-42和48-49。45. 根据权利要求41-44中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括 选自下组的至少三种或更多种检测探针:SEQ ID N0s:25-42和48-49。46. 根据权利要求41-45中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括 第一检测探针SEQ ID NO:25和第二检测探针SEQ ID NO:26。47. 根据权利要求46的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下组的 第三检测探针：SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。48. 根据权利要求47的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括不同于所述 第三检测探针且选自下组的第四检测探针:SEQ ID N0:48和SEQ ID N0:49。49. 根据权利要求41-45中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括 选自下组的两种或更多种检测探针:SEQ ID N0s:26和48-49。50. 根据权利要求41 -49中任一项的反应混合物，其中所述第一扩增引物对包含第一扩 增引物和第二扩增引物，所述第一扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1，且所述第二扩增 引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。51. 根据权利要求41-50中任一项的反应混合物，还包含： (C) 至少第二扩增引物对，其用于扩增和确定来自所述生物样品的第二TGFW基因序 列;和 (D) 至少三种检测探针的第二组，其中所述至少三种检测探针的第二组的一种检测探 针在暴露于所述第二TGFW基因序列时与所述第二TGFW基因序列杂交。52. 根据权利要求51的反应混合物，其中所述第二TGFW基因序列包含来自该受试者的 生物样品的编码氨基酸残基555的核苷酸。53. 根据权利要求51或52的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的第二组包括选 自下组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs :45-47和50。54. 根据权利要求51-53中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的第二组 包括选自下组的至少两种或更多种检测探针:SEQ ID N0s:45-47和50。55. 根据权利要求51-54中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的第二组 包括选自下组的至少三种或更多种检测探针:SEQ ID N0s:45-47和50。56. 根据权利要求51-55中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的第二组 包括：第一检测探针，其为SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47,第二检测探针，其为SEQ ID NO: 46,和第三检测探针，其为SEQ ID NO:50。57. 根据权利要求51 -56中任一项的反应混合物，其中所述第二扩增引物对包含第三扩 增引物和第四扩增引物，所述第三扩增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:43,和第四扩增引 物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。58. 根据权利要求41的反应混合物，其中所述TGFW基因序列包含来自该受试者的生物 样品的编码氨基酸残基555的核苷酸。59. 根据权利要求41或58的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组包括选自下 组的至少一种检测探针：SEQ ID NOs :45-47和50。60. 根据权利要求41和58-59中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组 包括选自下组的至少两种或更多种检测探针:SEQ ID N0s:45-47和50。61. 根据权利要求41和58-60中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组 包括选自下组的至少三种或更多种检测探针:SEQ ID NOs:45-47和50。62. 根据权利要求41和58-61中任一项的反应混合物，其中所述至少三种检测探针的组 包括：第一检测探针，其为SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47,第二检测探针，其为SEQ ID NO: 46,和第三检测探针，其为SEQ ID NO:50。63. 用于检测角膜营养不良的方法，包括： (A-I)使用包含至少第一扩增引物对和至少三种检测探针的组的反应混合物，从来自 人受试者的生物样品扩增第一 TGFW基因序列； (B-I)将所述至少三种检测探针的组的第一检测探针与所述第一 TGFW基因序列杂交； 并 (C-I)基于以下检测所述第一 TGFW基因序列中的突变：（i)所述至少三种检测探针的 组的第一检测探针杂交于所述第一TGFW基因序列，和（ii)所述至少三种检测探针的组的 第二和第三检测探针与第一 TGFW基因序列杂交的失败。64. 根据权利要求63的方法，其中所述反应混合物包含如权利要求41-50和58-62的任 一项中记载的反应混合物。65. 根据权利要求63或64的方法，进一步包括： (A-2)使用相同反应混合物从所述生物样品扩增第二TGFW基因序列，其中所述反应混 合物包含至少第二扩增引物对和至少三种检测探针的第二组； (B-2)将所述至少三种检测探针的第二组的第一检测探针与所述第二TGFW基因序列 杂交;并 (C-2)基于以下检测所述第二TGFW基因序列中的突变：（i)所述至少三种检测探针的 第二组的第一检测探针杂交于所述第二TGFW基因序列，和（ii)所述至少三种检测探针的 第二组的第二和第三检测探针与所述第二TGFW基因序列杂交的失败。66. 根据权利要求65的方法，其中所述反应混合物包含如权利要求51-57的任一项中记 载的反应混合物。67. 根据权利要求65或66的方法，其中所述扩增(A-I)，扩增(A-2)，杂交(B-I)，杂交(B-2)，检测(C-I)，和检测(C-2)用生物样品的同一等分试样实施。68. 根据权利要求65-67中任一项的方法，其中所述扩增第一 TGFW基因序列(A-I)和扩 增第二TGFW基因序列(A-2)同时实施。69. 根据权利要求65-68中任一项的方法，其中所述杂交(B-1)和杂交(B-2)同时实施。70. 根据权利要求65-69中任一项的方法，其中所述检测(C-1)和检测(C-2)同时实施。71. 如权利要求7-70的任一项中记载的反应混合物用于预测受试者中在激光眼科手术 后的并发症的风险的用途，所述预测经由检测人受试者中的杂合角膜营养不良进行。72. 根据权利要求71的用途，其中所述激光眼科手术包括Lasik和Excimer激光手术之 〇73. 用于检测来自人受试者的样品中与角膜营养不良有关的基因组突变的方法，该方 法包括： (A) 提供受试者的上皮细胞，其附着于基片的尖端； (B) 在裂解溶液中搅动该基片的该尖端，所述裂解溶液裂解附着于该基片的细胞； (C) 在完成(B)搅动时，从裂解溶液移出该基片； (D) 在(C)移出后温育该裂解溶液； (E) 从裂解溶液分离基因组DNA以形成gDNA溶液;和 (F) 使用至少第一引物对、至少三种检测探针的组和该gDNA溶液，通过将该gDNA溶液同 时暴露于所述至少三种检测探针，确定所述TGFW基因中存在的至少一个核苷酸的身份，其 中： 所述至少一个核苷酸位于所述TGFW基因的特定的位置处，所述位置对应于与角膜营 养不良有关的单核苷酸多态性(SNP)，且 所述至少三种检测探针的组的至少两种检测探针的每种配置为检测所述TGFW基因的 特定位置处的不同突变。74. 根据权利要求73的方法，进一步包括： (G) 使用至少第二引物对、至少三种检测探针的第二组和该gDNA溶液，通过将该gDNA溶 液同时暴露于所述至少三种检测探针的组和所述至少三种检测探针的第二组，确定所述 TGFW基因中存在的至少第二核苷酸的身份，其中： 所述至少第二核苷酸位于所述TGFW基因的独立于所述至少一个核苷酸的位置的第二 特定位置处，所述第二特定位置对应于与角膜营养不良有关的第二单核苷酸多态性(SNP)， 且 所述至少三种检测探针的第二组的至少两种检测探针配置为检测所述TGFW基因的第 二特定位置处的分别的突变。75. 根据权利要求75的方法，其中所述确定(F)和确定(G)同时实施。76. 根据权利要求74或75的方法，其中所述确定(F)和确定(G)使用同一gDNA溶液实施。
【文档编号】C12Q1/68GK105899681SQ201480072417
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月17日
【发明人】C.查奥-谢恩, S.乔, G.李
【申请人】阿维利诺美国实验室股份有限公司