从纯化溶液中去除的假病毒颗粒的定量方法及试剂盒的制作方法

文档序号:10525720阅读:761来源:国知局
从纯化溶液中去除的假病毒颗粒的定量方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及确定从作为通过纯化技术处理结果溶液中去除的假病毒颗粒(MVP)的数量的方法。该方法涉及步骤:向溶液中加入MVP、通过纯化技术处理所述溶液、以及确定从所述溶液中去除的MVP的数量。本发明也涉及试剂盒,所述试剂盒可以与所述方法联合使用。该试剂盒包括至少一种MVP储液以及至少一种定量溶液。
【专利说明】
从纯化溶液中去除的假病毒颗粒的定量方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及确定从作为通过纯化技术处理结果的溶液中去除的假病毒颗粒(MVP) 的数量的方法。该方法涉及步骤:向溶液中加入MVP、通过纯化技术处理所述溶液、以及确定 从所述溶液中去除的MVP的数量。本发明也涉及试剂盒,所述试剂盒可以与所述方法联合使 用。优选地,该试剂盒包括至少一种MVP储液以及至少一种定量溶液。
【背景技术】
[0002] 生物医药产品,例如单克隆抗体、重组蛋白、疫苗、血液衍生产品以及动物制品具 有传播感染性病毒的风险(Burnouf,2005; Aranha,2011)。这是由于用于制备生物医药产品 的原材料含有内源病毒,或者在制备过程中外源的"外来"病毒污染含溶液的生物医药产品 的风险(Ker r,2010)。因此,国际监管机构要求生物医药制品的制备应在其制备过程中包含 充分的病毒清除步骤,并且通过提供有力的病毒清除数据确保这些病毒清除步骤有效 (EMEA,2008;EMEA,2008;ICH,1997;ICH,998;FDA,1997)。
[0003] 为了使病毒有效去除进行了病毒"尖峰研究",其中,将活病毒加入生物医药材料 中,并且进行缩小纯化过程(Darling,2002)。然后通过传染性试验(TCID 5Q)或定量聚合酶链 反应技术(Q-PCR)定量溶液中残余的病毒,从而分析该方法去除病毒的能力。由于繁殖和定 量活病毒颗粒所要求的专业性和附加安全措施,因此这些研究通常由第三方签约实验室进 行。因此,这些研究是极度昂贵,并且是现实难以实施的。事实上,这些处理步骤在用于评估 病毒去除效果之前就典型地开发了数月或数年。由于在监管授权验证研究过程中研究这些 处理步骤投入了时间和金钱,但是可能最终失败未能重复去除病毒,因此这些实践增加了 监控风险。因此,需要一种在纯化方法发展过程中就能确定病毒去除效率的新的改进方法。

【发明内容】

[0004] 本发明涉及一种从溶液中去除的假病毒颗粒(MVP)的定量方法,其中所述溶液为 通过纯化技术处理结果。所述方法包括步骤:向溶液中加入MVP,通过纯化技术处理该溶液, 以及确定从溶液中去除的MVP的数量。在优选实施方式中,加入MVP的溶液包括目的生物。在 更优选的实施方式中,所述目的生物为抗体、非抗体蛋白、疫苗、核酸产品、血液或血浆衍生 物。在另一更优选的实施方式中,所述目的生物为通过利用人细胞、动物细胞、植物细胞、昆 虫细胞、杂交瘤细胞、酵母细胞或细菌细胞的细胞培养过程或发酵过程所产生的目的生物。 在另一优选实施例中,通过纯化技术处理溶液纯化该溶液中存在的目的生物。
[0005] 在另一优选实施方式中,所述处理包含MVP的溶液的纯化技术为层析、过滤、超滤、 离心或病毒灭火技术。在另一优选实施方式中,在通过纯化技术处理溶液前加入该溶液的 MVP的量大于处理后溶液中残留的MVP的量。
[0006] 在优选实施方式中,MVP包括病毒壳蛋白、病毒包膜蛋白,或"病毒壳蛋白和病毒包 膜蛋白"。在另一优选实施方式中,所述壳蛋白或包膜蛋白由细菌细胞、酵母细胞、植物细 胞、昆虫细胞、和/或动物细胞和/或人细胞产生。在另一优选实施例中,所述病毒壳蛋白或 包膜蛋白来自微小病毒科(Parvoviridae)或逆转录病毒(Retroviridae source.)。在另一 优选实施方式中,所述病毒壳蛋白或包膜蛋白包括异源表位。在另一优选实施方式中,所述 MVP包括离体核酸。
[0007] 根据本发明的优选实施方式,确定从溶液中去除的MVP的数量包括利用确定溶液 中MVP数量的定量技术,具体包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、纳米 图像(nanoimaging)、焚光、酶促法、显微法、分光光度法、透射电镜(TEM),或western杂交技 术。根据本发明的另一优选实施方式,所述定量技术使用能够与所述MVP表面存在的壳蛋白 表位、包膜蛋白表位或异源表位结合的抗体。根据本发明的另一优选实施方式,所述定量技 术使用能够结合与MVP连接的连接分子的抗体。根据本发明的另一优选实施方式,所述定量 技术使用与MVP连接的分子以及能够与该分子结合的抗体,或能够与连接于所述分子的核 酸片段结合的引物。根据本发明的另一优选实施例,所述定量技术使用能够与MVP内包含的 离体核酸序列结合的引物。
[0008] 根据本发明的方法,包括步骤:将MVP加入溶液中,通过纯化技术处理所述溶液,以 及确定从溶液中移除的MVP的量。根据本发明的优选实施例,向溶液中加入第二种的MVP,通 过纯化技术处理所述溶液,以及确定从溶液中去除的第二种的MVP的量。根据本发明的优选 实施例,将所述第一和第二种MVP同时或顺序加入溶液中。根据本发明的优选实施方式,将 两种或多种附加种MVP加入溶液中。
[0009] 本发明也涉及试剂盒,所述试剂盒包括:至少一个包含MVP储液的容器,以及至少 一个包含定量溶液的容器。根据本发明的优选实施方式,所述定量溶液包括能与MVP或者与 MVP连接的分子结合的抗体。根据本发明的优选实施例,所述试剂盒进一步包括第二抗体, 所述第二抗体能够结合所述能与MVP或者与MVP连接的分子结合的抗体。根据本发明的优选 实施方式,所述能结合MVP的抗体与酶连接。根据本发明再一优选实施方式,所述第二抗体 与酶连接,其中所述第二抗体能够结合所述能与MVP或者与MVP连接的分子结合的抗体。根 据本发明的优选实施方式,所述试剂盒进一步包括ELLSA板,所述ELISA板包括能结合MVP的 固定的抗体或分子。根据本发明再一优选实施方式,所述定量溶液包含引物,所述引物结合 离体核酸序列或能够结合能与MVP连接的分子连接的核酸片段。根据本发明的优选实施方 式,所述试剂盒还包括用于实施ELISA或其他PCR技术的附加反应试剂。
【附图说明】
[0010] 通过附图和实施例说明本发明的【具体实施方式】,但附图和实施例并不限定本发明 的保护范围,其中同样的附图标记代表相同的原件。
[0011] 图1:MMVMVP片段的纯度。
[0012 ] 图2: MMV MVP储液的透射电镜图。
[0013] 图3:异源表位MMV MVP片段的的纯度。
[0014] 图4:异源表位MMV MVP储液的透射电镜图。
【具体实施方式】
[0015]通过实施例1和2所述的方法纯化鼠微小病毒(MMV)MVP。为了确定氯化铯密度梯度 组分的纯度,浓缩各密度组分(泳道1-13)的样品,并且在4~12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳。通过考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。泳道"S"为VP2蛋白标准样(alpha diagnostic,货 号为MVMVP25-R-10),作为对照(VP2蛋白分子量为64KDa),分子量标记蛋白在泳道"Μ"。如图 1,分析由天然VP2蛋白形成的MVP。组分11 -13富集形成MVP储液。基于染色结果,包含MVP的 富集储液的浓度大于95%。如图3所示,分析由重组VP2蛋白结构形成的MVP。富集组分11-13,形成MVP储液。基于染色结果,包含MVP的富集储液的浓度为90%。
[0016] 通过实施例1和2所述的方法制备MMV MVP储液。如图2所示,显示由60个拷贝的天 然(未修饰)VP2蛋白获得的MMVMVP储液的ΤΕΜ图。如图4所示,显示由60个拷贝的重组VP2蛋 白获得的MMV MVP储液的ΤΕΜ图,其中,各VP2重组蛋白包含异源表位(strep II标签氨基酸 序列)。图像是负染色后捕获的。将各储液2微升置于单独的formva/碳涂覆的电子显微网 格,然后置于空气中干燥。十分钟后,吸走所述网格上的残余物。然后固定网格,向各网格滴 加2微升2.0%、pH7.0的磷钨酸(PTA),放置一分钟进行染色。然后取出多余,使用FEI Tecnai Spirit Twin显微镜放大165,000倍对网格进行检查、定量以及拍照。结果显示MMV MVP储液的浓度分别为3.06x 1013MMV MVP/ml(图2)、3.56x 1013MMV MVP/ml(图4)。 详细描述
[0017] 在本发明中,术语"假病毒颗粒(MVP)"指非传染性、非复制的组装单元,其包括合 成制备(如重组表达或化学合成)的病毒壳蛋白、包膜蛋白或壳蛋白和包膜蛋白。MVP不指天 然发现的病毒颗粒,但不限于活病毒颗粒,已经自然地丧失了传染性能的天然发现的病毒 颗粒,或已经体外丧失传染能力的病毒颗粒,例如"紫外线照射"、"热杀死"或"热灭火"的病 毒颗粒。因此,MVP的合成特性使其与其他形式的现有技术中使用的病毒颗粒相比能够易制 备、易在市售套装中使用。术语"病毒壳蛋白"指任何包含围绕基因组的壳的病毒的蛋白。术 语"病毒包膜蛋白"指包被壳蛋白外壳、且为部分病毒外层的任何病毒蛋白。特定的病毒壳 蛋白和包膜蛋白对于特定病毒分类族的病毒是常见的。MVP可以由这些病毒家族的壳或包 膜蛋白制备,从而获得与来自这些家族的特定病毒类似的生化特性的单元。然而,MVP的组 装单元缺少与这些病毒类似的遗传特性(MVP不包含任何核酸)。以下表1列出了主要病毒壳 蛋白和包膜蛋白的实例(这些蛋白的通用名称是现有技术已知的),与其相关的病毒家族, 以及可以由这些蛋白中的一种或多种蛋白组装的MVP的实例。 表1


[0018] 根据本发明,MVP作为体外重组表达或化学合成病毒壳或包膜蛋白的结果而组装。 优选地,组装形成MVP的病毒壳和包膜蛋白为天然发生的病毒蛋白核酸序列的表达产物。可 选择地,组装形成MVP的病毒壳和包膜蛋白为已被体外改变或修饰的病毒蛋白核酸序列的 表达产物。在本发明中,"重组"蛋白指由作为改变或修饰的核酸序列的表达结果的被改变 或修饰的氨基酸序列组成的蛋白产物。改变或修饰天然发生的病毒蛋白核酸序列以表达重 组病毒壳或包膜蛋白的方式是本领域公职的(例如,参见Gillockl998)。优选地,根据基于 BLAST同源性分析的标准蛋白,重组MVP壳或包膜蛋白与其天然病毒蛋白来源的同源性为 99%或更高。可选择地,根据基于BLAST同源性分析的标准蛋白,重组MVP壳或包膜蛋白与其 天然壳和/或包膜蛋白来源的同源性至少为50%、60%、70%、80%、81 %、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 更尚。
[0019] 优选地,组装形成MVP的病毒壳或包膜蛋白通过在细菌、酵母、植物、昆虫、动物或 人细胞中表达其基因而被制备。替代组装MVP制备这些蛋白的方式是本领域公知的(例如, 参见Makarova,2011)。例如,首先将天然或修饰的病毒核酸蛋白序列克隆到表达载体中。优 选地,所述表达载体为基于酵母的表达载体、基于细菌的表达载体、基于杆状病毒的表达载 体、和/或基于哺乳动物的表达载体、和/或基于植物的表达载体。然后以表达载体转染细 胞。优选地,可以被转染的细胞包括、但不限于:细菌、酵母、植物、昆虫、动物、哺乳动物和/ 或人细胞。优选地,天然或重组病毒壳或包膜蛋白表达后,所述蛋白自发地组装为MVP。可选 择地,MVP的组装不会自发发生。在这些实例中,可以用化学试剂和/或蛋白质处理未组装的 蛋白包含液,以增加 MVP组装的发生。可选择地,纯化所述未组装的蛋白包含液,以增加溶液 中壳或包膜蛋白相对于溶液中其他分子的数量。
[0020] 优选地,表达制备用于组装形成MVP的病毒壳或包膜蛋白的所述核酸序列来自 Parvoviridae或Retroviridae基因组来源。源自Parvoviridae的核酸序列来源的实例包 括、但不限于鼠微小病毒(Mouse Minute Virus)、犬细小病毒(Canine Parvovirus)、猫细 小病毒(Feline Parvovirus)、猪细小病毒(Porcine Parvovirus)、B_19 病毒(B 19vims)、 腺相关病毒l(Adeno_associated virus 1)、鹿眼峡蝶浓核病毒(Junonia coenia densovirus)、家香病毒(Bombyx mori virus)以及埃及伊蚊浓核病毒(Aedes aegypti densovirus)的基因组。可以由这些基因组制备并组装形成MVP的病毒壳蛋白的实例包括、 但不限于:VP1、VP2、VP3或VP4蛋白。源自Retroviridae的核酸序列来源的实例包括、但不限 于以下病毒的基因组:鸟类成红细胞增多症病毒(Avian Erythroblastosis Virus)、鸟类 白血病病毒(Avian Leukosis Virus)、禽成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus)、鸟类肉瘤病毒(Avian Sarcoma Virus),禽髓细胞瘤病病毒(Avian Myelocytomatos is Virus)、ESH肉瘤病毒(Esh Sarcoma Virus)、弗吉纳米肿瘤病毒 (Fujinami Sarcoma Virus)、金黄色病毒(Golden Pheasant Virus)、诱导白血病病毒 (Induced Leukemia Virus)、造淋巴组织细胞增生病毒(Lymphoid Leukosis Virus)、骨髓 母细胞增多症相关病毒(]^61〇131&8〖0818-&880(^&〖6(1¥;!_1'118)、髓细胞组织增生病毒 (Myelocytomatosis Virus)、鲁斯相关病毒(Rous-associated Virus)、环颈雉病毒(Ring-necked Pheasant Virus)、劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、NK_24、SKV、沸沸内源性 病毒(Baboon Endogenous Virus)、BEV、CCC、CERV_CI、CPC4、玉米蛇逆转录病毒(Corn Snake Retrovirus)、鸡合胞体病毒(Chicken Syncytial Virus),鸭传染性贫血病毒(Duck InfectiousAnemia Virus)、鹿肾病毒(Deer Kidney Virus)、DPC4、马皮肤纤维肉瘤病毒 (Equine Dermal Fibrosarcoma Virus)、猫白血病毒;(Feline Leukemia Virus)、FeLV-AIDS、猫肉瘤病毒(Feline Sarcoma ¥化1^);广]\&^{『-5卩卩¥{5-1、长臂猿白血病病毒 (GibbonApe Leukemia Vims)、仓鼠白血病病毒(Hamster Leukemia Virus)、淋巴组织增生 病病毒(Lymphoproliferative Disease Virus)、紹致细胞灶病毒(Mink Cell Focus-inducing Virus)、MAIDS、MDEV、紹白血病病毒(Mink Leukemia Virus)、鼠白血病病毒 (Murine Leukemia Virus)、MMCA、鼠肉瘤病毒(Murine Sarcoma Virus)、髓系白血病病毒 (Myeloid Leukemia Virus)、0MCA、PK_lS、R-35、RadLV、大鼠白血病病毒(Rat Leukemia Virus)、Ra-MCF、Ra-MLV、Ra-SFFV、大鼠肉瘤病毒(Rat Sarcoma Virus)、RDL14、网状内皮组 织增殖相关病毒(Reticuloendotheliosis-associated Virus)、形成脾脏病灶病毒 (Spleen Focus-forming Virus)、毛猿肉瘤相关病毒(Simian Sarcoma Virus)、猴淋巴瘤 病毒(Simian Lymphoma Virus)、猴髓细胞白血病病毒(Simian Myelogenous Leukemia Virus)、脾坏死病毒(Spleen Necrosis Virus)、猿猴肉瘤相关病毒(Simian Sarcoma-associated Virus)、毛猿肉瘤相关病毒(Simian Sarcoma Virus)、TRV4、Vand C_I、蜂蛇逆 病毒(Viper Retrovirus)、毛猴病毒(Woolly Monkey Virus)、毛猴白血病病毒(Woolly Monkey Leukemia Virus)、牛白血病病毒;(Bovine Leukemia Virus)、BoLV、人 T细胞白血 病病毒(Human T-cell Leukemia Virus)、猿Τ细胞白血病病毒(Simian T-cell Leukemia Virus)、STLVpan-p、牛合胞病毒(Bovine Syncytial Virus),猫合胞体病毒(Feline Syncytium-forming Virus)、人合胞病毒(Human Foamy Virus)、猿合胞病毒(Simian Foamy Virus)、牛免疫缺损病毒(Bovine Immunodeficiency Virus)、山羊关节炎-脑炎病 毒(Caprine Encephalitis-arthritis Virus)、马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus)、猫免疫缺陷病毒(Feline Immunodeficiency Virus)、山羊脑白质炎病毒 (Goat Leukoencephalitis Virus)、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)、 维斯那-梅迪病毒(Jembrana,Maedi/visna Virus)、进行性肺炎病毒(Progressive Pneumonia Virus)、猿猴免疫缺损病毒(Simian Immunodeficiency Virus)、鼠乳腺癌病毒 (Mouse Mammary Tumor Virus)、M432,M832、MNV、梅森-菲泽猴病毒(Mason-Pfizer Monkey Virus),、PMFV、P〇-l_Lu、松鼠猴逆转录病毒(Squirrel Monkey Retrovirus)、猴逆转录病 毒(Simian Retrovirus,、绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte Retrovirus)、大眼梭f卢皮肤肉瘤 病毒(Walleye Dermal Sarcoma Virus)、大眼梭自卢鱼表皮过度增生病毒(Walleye Dermal Hyperplasia Virus)以及Gypsy基因组。可以由这些源自Retroviridae的基因组制备并组 装形成MVP的病毒壳蛋白的实例包括、但不限于:gag蛋白(MA、CA、NC)env蛋白(SU、TM、LP)、 以及sag蛋白。更优选地,Retroviridae源的蛋白源包括哺乳动物细胞内源性逆转录病毒及 逆转录病毒样颗粒的基因组序列。哺乳动物细胞内源性逆转录病毒及逆转录病毒样颗粒的 实例包括、但不限于:小鼠白血病病毒(Ab、AKT8、Cas-Br-E、Du5H MAIDS、FMCF-98、Fr、 Graff i、Gr o s s、LP-BM5、K i、Mo、MPLV、NT40、PVC-211、Ra、RadLV、SL3-3、TRI -3、XMuLV)以及内 淋巴间隙A型颗粒。可能包含内源性逆转录病毒及逆转录病毒样颗粒的哺乳细胞的实例包 括 CH0、NS0、NS-1、Sp20Agl4、MH、BHK、以及 RH 细胞。
[0021 ]优选地,病毒壳或包膜蛋白组装形成表面显示表位的MVP。在本发明中,"表位"是 MVP的外表面显示的特定氨基酸序列。表位可以用于定量溶液中存在的MVP的量(及其从溶 液中去除),而无需传染性试验、QPCR,或其它传染性或非传染性病毒颗粒去除的定量领域 的繁荣且昂贵的常规方法。在一些实例中,重组病毒壳或包膜蛋白组装形成MVP。在这些实 例中,MVP在其表面是可能具有异源表位。在本发明中,"异源表位"指重组壳或包膜蛋白的 表达所形成表位。此外,MVP在其由重组蛋白组装时可以包含异源表位。异源表位的实例包 括、但不限于:strep-tag(例如氨基酸序列WSHPQFEK(SEQ ID No:l))、flag tag(例如氨基 酸序列DYKDDDDK(SEQIDNo:2))以及His-tag(例如氨基酸序列HHHHHH(SEQIDNo:3))。优 选地,MVP的每个蛋白单元可以包含一个拷贝的表位或异源表位。可选择地,MVP的每个蛋白 单元可以包含多个拷贝的表位或异源表位。异源表位可以将确定溶液中MVP数量所用定量 方法的灵敏性提高至超过本领域常规使用的传染性试验、QPCR,或其它常规试验的水平。 [0022]优选地,MVP不包含任何核酸。可选择地,MVP可以包含离体核酸片段。在本发明中, "离体核酸片段"指在颗粒组装时特意引入MVP溶液的特定核酸序列,从而所得MVP包含一个 拷贝的该序列。因此,与所有其他本领域已知的颗粒不同,MVP不依赖于用于确定溶液中MVP 数量的病毒基因组的遗传材料。在本发明中,术语"遗传材料"指复制或复制缺陷病毒颗粒 中存在的所有天然包括的核酸。例如,在现有技术中,传染性病毒颗粒的定量涉及感染性测 量(天然包含的基因组核酸表达的结果),或QPCR(使用其天然包含的基因组核酸的引物) (Shi,2004)。此外,现有技术中,非复制内源逆转录病毒样颗粒的定量涉及利用天然包含的 基因组核酸的引物的QPCR,或者测量病毒逆转录酶活性的定量产物增强逆转录酶(Q-PERT) (Zhang,2008)。优选地,离体核酸片段可以指核酸的合成衍生序列。可选择地,离体核酸序 列可以指天然衍生的序列。优选地,在天然衍生序列的实例中,序列的长度约为衍生序列源 自的生物体的基因组的约1 %或更少,5 %或更少,10 %或更少,25 %或更少,30 %或更少, 40 %或更少,50 %或更少,60 %或更少,70 %或更少,75 %或更少,90 %或更少,95 %或更少, 99 %或更少。如本领域的常规方法所测量,离体核酸的量不够MVP的复制和传染。本领域常 规使用的测量传染性的方法之一是TCID 5Q。与其他本领域的常规病毒颗粒不同,MVP不具有 正被感染或曾经感染的风险。在一些实施例中,离体核酸片段可以源自病毒源。在其他实例 中,离体核酸源自非病毒源。离体核酸来源的实例包括但不限于:病毒、细菌、酵母、昆虫、动 物和/或植物。优选地,在离体核酸源自病毒来源的实例中,所述病毒来源可以与MVP的壳或 包膜蛋白源自同一来源。可选择地,在离体核酸源自病毒来源的实例中,所述病毒来源与 MVP的壳或包膜蛋白来源不同。更优选地,在任何情况下,所述离体核酸的5'端和3'端可以 包含该序列源自的基因组不存在的特定序列。
[0023] 优选地,组装后,使用本领域已知的方法纯化MVP(Hernando,2000)。并且,纯化后, 在其组装溶液中MVP的纯度可以达到溶液中所有蛋白的不到65 %为非MVP相关的,溶液中所 有蛋白的不到55%为非MVP相关的,溶液中所有蛋白的不到35%为非MVP相关的,溶液中所 有蛋白的不到25%为非MVP相关的,溶液中所有蛋白的不到15%为非MVP相关的,溶液中所 有蛋白的不到5%为非MVP相关的。在本发明中,术语"非MVP相关蛋白"指没有组装形成MVP 的所有非壳和/或非包膜蛋白。纯化MVP的方法的实例之一为蔗糖密度梯度。另一实例为离 心。再一实例为层析。储液中MVP的纯度可以通过本领域的常规方法确定,所述方法包括但 不限于:聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、高压液相色谱、质谱、流式细胞、ELISA、动态光散射、 凝胶过滤或超滤。在一些实例中,组装后,引入MVP,并与连接分子反应,从而MVP连接该连接 分子至其表面。在本发明中,术语"连接分子"指能够与另一分子共价地或离子相连的合成 聚合物或天然聚合物(例如蛋白)。
[0024] 如前所述,MVP由病毒壳或包膜蛋白组装。在本发明中,根据其病毒蛋白来源指代 MVP。例如,由鼠微小病毒的VP2蛋白(或VP2蛋白的重组版)组装的MVP被称作"MMV MVP"。另 一实例是,将由异嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)的env和/或gag蛋白(或env和/或gag蛋白的 重组版)组装的MVP被称作"XMuLV MVP"。在本发明中,优选地,MVP包括微小病毒科 (Parvoviridae)或逆转录病毒科(Retroviridae)核酸来源所制备的天然或重组蛋白。可选 择地,MVP包括其他病毒家族的核酸来源所制备的病毒蛋白,这些病毒家族包括但不限于杯 状病毒科(Caliciviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、宪菁黄花叶病毒科 (丁5^1110¥;[1^(1&6),披膜病毒科(1'08&¥;[1^(1&6)、疱疼病毒科(!16印6 8¥;[1^(1&)、冠状病毒科 (Coronavirida)、·正黏液病毒科(Orthomyxo viridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、肝病 毒科(此。&(111&¥;[1'丨(1&6,)、副粘病毒科(?&1&1115^0¥;[1'丨(1&6)、?10¥;[¥;^(1&6,小1?财病毒科 (Picronaviridae)和/或多瘤病毒科(Polyomaviridae)。优选地,MVP由源自一个病毒来源 的蛋白组装。MVP由源自一个病毒来源的蛋白组装的实例为"MMV MVP",由天然或重组丽V VP2壳蛋白组装。可选择地,MVP可以由源自多个病毒来源的蛋白组装。MVP由多于一个病毒 蛋白来源组装的实例为XMuLV MVP,其由天然或重组XMuL V gag蛋白和天然或重组HIV env 蛋白组装而成。
[0025] 在本发明中,术语"MVP种类"指包括相同的蛋白、且具有这些蛋白的同样拷贝数的 所有蛋白。例如,一类MVP是所有包括60个拷贝的MMV VP2蛋白的MVP。根据MVP的进一步优选 限定,蛋白的重组形式被认为与其起源的天然蛋白相同。例如,包括60个拷贝的重组MMV VP2蛋白的MVP与包括60个拷贝的天然MMV VP2蛋白的MVP是同一种类。
[0026] 优选地,向溶液中添加 MVP的操作指向溶液中仅添加一种MVP。可选择地,所述向溶 液中添加 MVP的操作指向溶液中添加再一种MVP。优选地,在这些实例中,同时向溶液中加入 第一和第二种MVP。可选择地,在这些实例中,顺序添加第一、第二种MVP。向溶液中顺序添加 两种MVP的实例是向溶液中首先加入MMV MVP,然后向同一溶液中再加入XMuLV MVP。向溶液 中同时加入两种MVP的实例为将包含MMV MVP和XMuLV MVP的溶液加入另一溶液中。在另一 实施例中,向溶液中加入MVP的操作指向溶液中加入两种或多种MVP。
[0027] 优选地,向溶液中加入MVP指向另一不含特定种类MVP的溶液中加入一定体积的含 义特定种类MVP的溶液。在本发明中,所述不含特定种类MVP的溶液直至向其中加入该种类 的MVP的过程称作"处理溶液"。例如,将丽V MVP溶液加入还未含有MMV MVP的CHO细胞悬浮 液的处理溶液。在另一实例中,将XMuLV MVP溶液加入含有MMV MVP但还未包含XMuLV MVP的 CHO细胞悬浮液的处理溶液。在本发明中,加入到处理溶液中的含MVP的溶液可以被称作 "MVP储液"。优选地,与本领域常规使用的非传染颗粒的储液不同,MVP储液具有已知浓度的 MVP。例如,本发明的【具体实施方式】中的试剂盒内包含的MVP储液包括MVP浓度信息。而且MVP 储液具有高于本领域其它非传染性颗粒的浓度的MVP。例如,储液中MVP的浓度至少为lx 105MVP/mL lx 106MVP/mi,lx 107MVP/ml,lx 108MVP/ml,lx 109MVP/ml,lx 1010MVP/ml, lx 10nMVP/ml,lx 1012MVP/ml, lx 1013MVP/ml lx 1014MVP/ml, lx 1015MVP/mL lx 1016MVP/mL 或更高。此外,MVP储液含有比本领域常规使用的其它非感染颗粒更高纯度的MVP。例如,MVP 储液中非MVP相关蛋白不到溶液中所有蛋白的65%,不到溶液中所有蛋白的55%,不到溶液 中所有蛋白的45%,不到溶液中所有蛋白的35%,不到溶液中所有蛋白的25%,不到溶液中 所有蛋白的15 %,不到溶液中所有蛋白的5 %。储液中MVP的纯度可以通过本领域的常规方 法确定,所述方法包括但不限于:聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、高压液相色谱、质谱、流式细 胞、ELI SA、动态光散射、凝胶过滤或超滤。在实施例部分描述制备MVP储液的实例。优选地, MVP储液含有一种MVP。含有一种MVP的MVP储液的实例之一为含有MMV MVP的MVP储液。可选 择地,MVP储液可以含有多种MVP。含有多种MVP的MVP储液的实例为含有MMVMVP和XMuLV MVP 的MVP储液。
[0028] 加入到操作液中的MVP溶液的量随多种因素而变化,这些因素包括但不限于:操作 液的体积,添加后在所述操作液中MVP储液的目的比例(v/v),以及MVP储液中MVP的浓度。优 选地,MVP储液的添加体积可以为微升或毫升的数量级。例如,添加体积可以为约100微升或 更少,约200微升或更少,约500微升或更少,约1毫升或更少,约2毫升或更少,约5毫升或更 少,约10毫升或更少,约100毫升或更少,约1000毫升或更少。可选择地,添加体积为升。例 如,添加体积可以为约1升或更少,约2升或更少,约5升或更少,约10升或更少。优选地,添加 后,在所述操作液中MVP储液的比例为约1 % (v/v)或更少,约2 % (v/v)或更少,约3 % (v/v) 或更少,约4% (v/v)或更少,约5% (v/v)或更少,约10% (v/v)或更少,约25% (v/v)或更少, 或约50% (v/v)或更少。
[0029] 优选地,所述操作液含有目的生物。在本发明中,术语"目的生物"指通过可以展示 治疗潜能的生物学过程制备的任何分子。在本发明中所述生物学过程的实例为细胞蛋白表 达。在有些情况下,目的生物可以包括蔗糖、蛋白、核酸或这些物质的组合体。或者,目的生 物可以为如细胞和/或组织的活体。优选地,目的生物为抗体、非抗体蛋白、疫苗、核酸、血液 或血浆衍生物。作为目的生物的抗体的实例为曲妥单抗,其以Herceptin?的商品名称销售。 另一实例为Rituxiniab,其以Rituxan?的商品名称销售。另一实例为贝泛单抗,其以 asrin?的商品名称销售。作为目的生物的非抗体蛋白的实例包括但不限于:粒细胞集落刺 激因子(GCSF)、干细胞因子、瘦素(leptin,)、荷尔蒙,细胞素、成血因子、生长因子、肥胖因 子、营养因子、抗炎症因子、受体、,可溶性受体、酶、和/或这些蛋白任一一种的突变体、衍生 物或类似物。其他目的生物的优选实例包括但不限于:胰岛素、胃泌素,催乳素、促肾上腺皮 质激素(AC'Ili)、促甲状腺激素(TSH)、黄体化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性 腺激素(HCG)、胃动素、干扰素(如α、β、或γ )、白细胞介素(例如,IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL- 5、11^-6、11^-7、11^-8、11^-9、11^-10、11^-3.1和/或11^-12)、肿瘤坏死因子(了册)、肿瘤坏死因子 结合蛋白(TNF-bp)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经生长因子(GDNF),神经营养 因子3(NT3)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经营养生长因子(NGF)、骨生长因子such as, for example,骨保护素(OPG)、胰岛素样生长因子(IGFs)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、外细胞衍生生长因子(MGDF)、角质化细胞生长因 子(GF)、促血小板生成素、血小板源生长因子(PGDF)、菌落生长因子(CSFs)、骨形态生成蛋 白(BMP)、超氧化物歧化酶(SOD)、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、尿激酶、链激酶、或激 肽释放酶,和/或这些蛋白任一一种的变体、衍生物或类似物。疫苗作为目的生物的优选实 施例为乙肝疫苗(Recombivax HB)。另一疫苗优选实施例为Gaxdasil。另一疫苗优选实施例 为Optaflu。另一疫苗优选实施例为Cervarix。目的生物为核酸的优选实施例为 fomivirsen,其市场销售名称为Vitravene?。另一目的生物为核酸的优选实施例为 mipomersen,其市场销售名称为Kynamro?。另一优选实施例为Pegaptanib,其市场销售名称 为Macugen?。血液或血浆衍生物作为目的生物的实例为白蛋白。另一血液或血浆衍生物作 为目的生物的实例为抗血友病因子。另一优选实施例为抗血友病因子/血管假性血友病因 子复合体。本发明中其它目的生物的实例包括但不限于:抗凝血复合抑制剂抗凝血酶(重 组),氯酯酶抑制剂、凝血因子、corifact、纤维蛋白、,纤维蛋白原、免疫球蛋白、profilnine SD复合因子、kcentra凝血酶原复合体浓缩物,人)、蛋白C浓缩物(人)、凝血酶、骨髓制品、以 及胚胎液产品。
[0030]优选地,所述操作液中的目的生物通过细胞组织培养方法或发酵方法制备。在本 发明中,术语"细胞组织培养"指细胞在可控条件下生长以表达特定基因(典型地体外诱导) 的过程。在本发明中,术语"发酵表达方法"指微生物在特性条件下生长以表达特定基因(典 型地体外诱导)的过程。优选地,用于细胞组织培养和发酵表达的细胞系为人、动物、植物、 昆虫、杂交瘤、酵母或细菌来源的。人细胞系的实例包括但不限于:HeLa、NCI60、DU 145、 10?-7、?03^冊-77、和/或册1(-293细胞。动物细胞系的实例包括但不限于 :010、8冊、奶0、 1?)0(、¥6^、6!13、?(:12、和/或抓3了3细胞。植物细胞系的实例包括但不限于 :1^3(^〇8¥-2ceiIs。昆虫细胞系的实例包括但不限于:sf9、High Five、和/或C6/36细胞.酵母细胞系来 自的酵母种类的实例包括但不限于:啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或毕赤细 胞系。细菌细胞系来源的细菌种类的实例包括但不限于:大肠杆菌和/或乳酸菌。可选择地, 用于细胞组织培养或发酵表达的细胞系是其他来源的。其他细胞系的实例包括但不限于 ZF4、AB9和/或非洲爪蟾A6肾上皮细胞。
[0031 ]在本发明中,术语"杂交瘤"指在实验室内由抗体生成淋巴细胞和非抗体生成癌细 胞融合制备的细胞,优选骨髓瘤或淋巴瘤。此外,本发明的杂交瘤细胞能够繁殖和产生连续 供给的特定单克隆抗体。杂交瘤细胞系的实例包括但不限于RFT5、SP2/o细胞和/或HB54细 胞。
[0032]在一些实例中,表达目的生物的细胞组织培养或发酵过程共表达其他生物物质或 分子。在本发明中,在细胞组织培养或发酵过程中共表达非目的生物物质的所有生物物质 或分子被称作"杂质"。杂质的实例包括但不限于:宿主细胞蛋白(除目的生物物质外表达的 其他蛋白),核酸(除了目的生物外的核酸),目的生物物质的电荷变体,聚合复合体,葡聚 糖,和/或病毒。此外,杂质指所有加入到含目的生物的溶液中的所有生物物质、分子或化学 物质。因此,杂质的实例为向操作液中加入MVP后的MVP。在一些实例中,在原始细胞培养或 发酵表达溶液中,操作液与所有的初始杂质共存。在其他实例中,这些溶液在加入MVP之前, 可能通过本领域公知的"纯化技术"由其初始状态被纯化。在本发明中,术语"纯化"指降低 同一溶液中杂质相对于非杂质的数量的操作。优选地,非杂质指溶液中存在的目的生物物 质。在加入MVP前已纯化操作液的纯化技术的实例包括但不限于:离心、层析、过滤、沉淀、浓 缩、渗滤、巴氏杀菌或病毒灭活。在某些实例中,在加入MVP前,对溶液进行其他技术操作或 严格操作,这些操作包括但不限于:冷冻、融化、pH调节,和/或稀释。
[0033]本发明的第一【具体实施方式】涉及"通过纯化技术处理溶液"。在所述方法的该步骤 中,术语"溶液"指已经加入一定量的MVP储液的操作液。优选地,该溶液包括目的生物物质。 如前所述,也可能存在包括MVP的非目的生物物质,杂质。在本发明的第一实施例中,该溶液 "通过纯化技术被处理"。在本发明中,术语"纯化技术"指纯化溶液的技术,即,降低同一溶 液中存在的相对于非杂质的杂质数量。优选地,非杂质指目的生物物质。因此,本发明的再 一优选实施方式为纯化操作液中的目的生物物质,其中,所述纯化为通过纯化技术处理所 述操作液的操作。
[0034]优选地,用于处理操作液的纯化技术为层析、过滤、超滤、离心、或病毒灭活技术。 在本发明中,层析、过滤、超滤、或离心可以被称作"分离技术"。分离技术是将溶液的组分分 散至两种或多种不同溶液中的质量转移方法。分离技术基于溶看淡液的各种组分之间的不 同物理和化学性质进行的,包括但不限于:大小、形状、和/或化学亲和力。分离技术的实例 包括但不限于:亲和层析、离子交换层析、疏水层析、逆向层析、混合式层析、深度过滤、基于 粒径的过滤(包括纳米过滤、无菌过滤或超滤),以及离心。病毒灭活技术指旨在减少其病毒 功能至保留其正确结构或复制的任何方法。病毒灭活技术的实例包括暴露于溶剂或试剂, 或者化学处理、低PH、加热或紫外线照射。
[0035]本发明的第一实施方式涉及通过纯化技术"处理"溶液。在本发明中,术语"处理" 指物理地实施纯化技术的操作。处理分离技术的不同物理操作包括但不限于:加栗、施压、 离心、重力、或震荡。在一些实例中,根据分离技术的形式,一种分离技术可以实施多种操 作。例如,离子交换层析技术的形式可以为填充柱、过滤、或96孔板。因此,该离子交换层析 技术的处理操作可以包括加栗、施压、离心、重力、或震荡。实施病毒灭活技术的不同物理处 理包括但不限于:加入有机溶剂、试剂或酸溶液,微波,暴露于紫外光,热水浴中浸没,巴氏 灭菌,或蒸汽处理。
[0036]在一些实例中,通过分离技术处理溶液降低溶液中的杂质的数量,因而称之为溶 液"纯化"。向操作液中加入MVP后,MVP当作杂质。优选地,通过处理操作,与操作之前相比, 降低了操作液中存在的MVP的量。可选择地,通过处理未减少操作液中MVP的量。纯化技术降 低溶液中杂质的数量的能力依赖于本领域技术人员公知的系列技术参数或"可变输入"。可 变输入的实例包括但不限于:被处理溶液的PH、电导率、以及温度。另一可变输入的实例包 括但不限于:施加的压力、暴露的时间、或溶液的流速。另一实例是溶液中组分的浓度。其他 实例为用于处理溶液的缓冲液的PH、电导率、或化学组成。另一实例为在处理过程中或处理 后,收集操作液所用的标准。因此,通过纯化技术处理溶液所用的系列参数影响纯化技术减 少杂质(如MVP)相对于非杂质(例如目的生物物质)的量的能力和效率。
[0037]在一些实例中,在处理过程中或处理后收集操作液所用有效的参数使杂质更少。 一旦处理操作开始,收集操作液的方法论是本领域普通技术人员公知的。在本发明中,从处 理操作开始就已经收集的操作液为称作"操作收集物"。在纯化过程中,用于收集操作收集 物的方法包括但不限于:光吸收检测以及设定体积。优选地,本领域普通技术人员在操作过 程中或操作之后可以利用有效的收集参数,从而操作收集物包含较处理前包含更少的杂 质。更优选地,利用收集标准,从而操作收集物较处理前的操作液相比含有更少的MVP。 [0038]在本发明中,在处理过程中收集不同的操作收集物。在处理过程中如何收集不同 的操作收集物的实例为在层析分离技术的负载相的过程中收集柱洗脱液。另一实例为在层 析分离技术的清洗相的过程中收集柱洗脱液。另一实例为在层析分离技术的洗脱相的过程 中收集柱洗脱液。另一实例为收集过滤的滤液。另一实例为在低pH滴定过程中收集溶液。另 一实例为在UV光照射或化学处理过程中收集溶液。可选择地,在处理后可以收集各种不同 的处理收集物。处理后如何收集不同的操作液的实例为通过在层析分离技术的剥离相的过 程在收集柱洗脱液。另一实例为在低pH滴定、随后提高pH并过滤后收集溶液。另一实例为在 UV光照射或化学处理后收集溶液。
[0039]本发明的第一实施例涉及"从溶液中去除MVP的量的定量"。在该特定实施方式中, "定量"操作指本领域普通技术人员数学计算从操作液中被去除的MVP的量的方法。优选地, 该数值可以表示为"对数下降值"(LRV)。可选择地,该数值可以表示为MVP总克数中的、和/ 或MVP总分子数中的摩尔浓度(mo 1/L)。优选地,本领域普技术人员通过将处理后的溶液中 残留MVP的量与处理前溶液中MVP的量相关联的等式可以数学计算从溶液中去除的MVP的 量。优选地,通过将加入到操作液中的MVP储液的体积乘以MVP储液的MVP浓度,就可以获知 处理前溶液中MVP的量。更优选地,可以实证检验确定处理前溶液中存在的MVP的数量。此 外,优选地,可以实证检验确定操作收集物中残留的MVP的量。可以利用不同技术实证检验 确定溶液中存在的MVP的量。在本发明中,这些技术被称作"定量技术"。在实施例部分说明 如何确定从溶液中去除的MVP的量的优选实施例。
[0040]优选地,实证检验确定溶液中MVP的量所用的"定量技术"包括ELISA、PCR、纳米图 像(nanoimaging)、焚光、酶促法、显微法、分光光度法、透射电镜(TEM),或western杂交技 术。在本发明的实施例中,从中确定MVP的数量的"溶液"指加入MVP后的操作液、操作收集 物、或从上述两种取得的液体。在该实施例中,所述溶液可以被称作"MVP包含液"。优选地, 当实施定量技术时,将包含能够结合MVP的试剂或与MVP连接的分子的溶液加入MVP包含液 中。所述试剂的实例为抗体。可选择地,当实施定量技术时,向MVP包含液中加入含PCR引物 的溶液,所述PCR引物能够结合离体核酸,或者能够结合与分子连接的核酸序列,其中所述 分子可以事先与MVP连接。在本发明中,含试剂或PCR引物的溶液被称作"定量溶液"。
[0041 ]优选地,在确定溶液中MVP的数量的操作中,制备溶于操作液的MVP的系列稀释液, 并通过定量技术分析。优选地,此分析的数据将溶液中的MVP的量与作为定量技术的结果接 收的信号关联。作为定量技术的一部分被接收的信号的实例包括但不限于:直观密度(0D)、 吸收单位、每mL pRNA拷贝、每mL pDNA、每mL RNA拷贝数、每mLDNA拷贝数、或逆转录酶活性 单位。更优选地,使用最佳的试剂盒,结合将由未知数量的MVP所产生的定量信号与已知量 的MVP所产生的信号关联的数据。在实施例部分详细说明相关实施例,其中制备并利用稀释 液确定溶液中MVP的数量,替代定量从溶液中去除的MVP。
[0042]在某些实例中,MVP包括天然或重组病毒壳或包膜蛋白,并且在其表面具有表位或 异源表位。优选地,在这些实例中,在使用定量技术确定溶液中存在的MVP的量的过程中可 以使用结合这些表位或异源表位的抗体。结合MVP上的表位的抗体如何被用于确定MVP的量 的实例为在ELISA定量技术过程中,向MMV MVP包含溶液中加入直接抗天然或重组VP2壳蛋 白的抗-VP2抗体。结合MVP上的异源表位的抗体如何被用于确定MVP的量的实例为在ELISA 定量技术过程中,向MVP包含溶液中加入直接抗其His标签(MVP表面上存在的异源表位)的 抗-His抗体。优选地,本领域中已知的能够结合MVP所包含的表位或异源表位的抗体可以为 定量溶液中使用的试剂。更优选地,通过使用MVP作为生物体的免疫原制备的新型抗体可以 为定量溶液中所使用的试剂。因此,通过本领域常规的基于非遗传材料的技术可以实现惊 人灵敏的定量测量和MVP去除计算。
[0043] 在其他实例中,MVP与连接分子相连。优选地,在这些实例中,在定量技术确定溶液 中存在的MVP的量的过程中,结合连接分子的抗体可以被加入MVP包含液中。在其他实例中, 在加入定量溶液前,可以将含分子的溶液加入MVP包含液中。在本发明中,术语"分子"指具 有MVP亲和性的天然或人造小分子或蛋白。
[0044] 在一些实例中,向MVP包含液中加入分子,以形成MVP-分子复合物。优选地,在这些 实例中,分子不具有在其表面上连接和显示的核酸序列。在其他实例中,分子可以具有在其 表面上连接和显示的核酸序列。优选地,例如,当向MVP包含溶液中加入含分子的溶液时,然 后加入定量溶液以通过定量技术确定溶液中存在的MVP的量。如何通过加入含分子的溶液 确定溶液中存在的MVP的量的实例是:首先向含Strep标签-MVP的溶液(MVP包括Strep标签 异源表位)中加入含链霉肌动蛋白的溶液,然后通过ELISA定量技术使用抗-链霉肌动蛋白 抗体确定MVP的数量。另一实例是,首先向MVP包含溶液中加入核酸共联的链霉肌动蛋白溶 液(链霉肌动蛋白含有核酸的连接片段),然后通过PCR定量技术使用核酸片段的引物确定 MVP的量。
[0045] 在一些实例中,MVP在其结构内部包含离体核酸片段。优选地,在这些实例中,含与 MVP结构内包含的离体核酸结合的引物的定量溶液可以被用于通过PCR定量技术确定MVP的 量。在这些实例中,可以使用本领域公知的增强通过定量技术产生的信号的方法。增强通过 定量技术产生的信号的方法的实例涉及金属增强荧光。
[0046]优选地,去除的MVP的量的定量指MVP的种类。优选地,在这些实例中,将一种MVP加 入通过纯化技术处理的操作液中。可选择地,当将两种或多种MVP加入通过纯化技术处理的 操作液中时,去除的MVP的量的定量可以指多种MVP。优选地,在这些实例中,在确定溶液中 多种MVP数量中使用相同定量技术的实例是在分别的ELI SA定量技术中使用抗VP2抗体和抗 env-抗体,其中,所述抗VP2抗体结合MMV MVP,所述抗env-抗体结合XMuLV MVP。可选择地, 不同定量技术可以用于确定溶液中的多种MVP的量。使用不同定量技术的实例为使用基于 ELISA的技术确定溶液中MMV MVP的量,以及使用PCR技术确定相同溶液中XMuLVMVP的量。 [0047] 优选地,不间断地顺序实施以下步骤:向溶液中加入MVP、通过纯化技术处理溶液、 以及确定从溶液中去除的MVP的量。可选择地,根据合理的试验设计可以包括附加步骤。可 以根据合理的试验设计包括的附加步骤的实例包括但不限于:在将操作液加入储液之前进 一步纯化MVP储液(经过滤、层析或其他技术),在将MVP储液加入操作液之前进行透析或渗 滤,在加入MVP之前或之后,向操作液加入非-MVP溶液。非MVP溶液的实例为不含病毒的活病 毒制剂的细胞悬浮培养物。其他附加步骤的实例可以包括在添加 MVP之后、但在通过纯化技 术处理之前取操作液试样,在实施定量技术之前离心或稀释操作收集物或操作收集物的试 样,和/或在实施定量技术之前冷冻或溶解用于定量技术的试样。
[0048] 因此,本发明的【具体实施方式】之一为确定从溶液去除的MVP的量的方法。本发明的 另一【具体实施方式】为用于实施所述方法的试剂盒。优选地,所述试剂盒包括包含单一种类 MVP的储液的容器,以及包含定量溶液的容器。可选择地,所述试剂盒包含多种MVP的MVP储 液的容器。优选地,在该实施例中,所述试剂盒还包括用于实验验证确定储液瓶中存在的各 MVP种类的数量的多个定量溶液的容器。根据纳米的实施例,其中所述试剂盒包含多个MVP 储液瓶(含不同种MVP),所述试剂盒还包括用于确定各种MVP的数量的多个定量溶液瓶。
[0049] 在本发明中,包含MVP储液的容器指试剂盒内包含的瓶,所述试剂盒包含已知浓度 (MVP浓度)的MVP储液。此外,储液容器中的MVP的浓度和纯度超过本领域常规的其他非传染 性颗粒的浓度和纯度水平。例如,储液容器中的Μ V P浓度可以至少为1X 105 Μ V P / m L、1X 106MVP/mL、lx 107MVP/mL、lx 108MVP/ml,lx 109MVP/mL,lx 1010MVP/mL、lx 10nMVP/mL、I x 10i2MVP/mL、lx 1013MVP/mL、lx 10i4MVP/mL、lx I015MVP/mL、lx 10lb MVT/mL或更高,并且, 非MVP相关蛋白的比例不到溶液中所有蛋白的65%,不到溶液中所有蛋白的55%,不到溶液 中所有蛋白的45%,不到溶液中所有蛋白的35%,不到溶液中所有蛋白的25%,不到溶液中 所有蛋白的15 %,不到溶液中所有蛋白的5 %。优选地,储液瓶中的MVP可以为MVP组装成的 源细胞培养物或基于发酵的表达溶液。更优选地,纯化溶液储液的MVP,从而与MVP组成的原 始表达溶液相比降低了非MVP相关蛋白的浓度、核酸的浓度、或溶液中脂类的浓度。更优选, 储液瓶中的MVP从MVP组装的原始表达溶液中被高度纯化。在一些实例中,MVP储液可以包含 加入的缓冲液组分。优选地,单个MVP储液瓶仅含一种特定的MVP。可选择地,单一的储液瓶 含多种MVP。
[0050] 在本发明中,"含定量溶液的容器"指试剂盒内包含的瓶,所述试剂盒包括含能够 结合MVP试剂的定量溶液,离体核酸,与MVP连接的分子,或与所述分子连接的核酸序列。优 选地,定量瓶包括含抗体的定量溶液,所述抗体能结合MVP或者能与MVP连接的分子。包括含 抗体的定量溶液的定量瓶的实例为包括含抗-VP2抗体的定量溶液的定量溶液瓶,其中,可 以在ELISA定量技术中使用抗-VP2抗体,以确定溶液中MMV MVP的量。在这些实例中,抗体可 以结合MVP上存在的表位或异源表位,或结合分子上存在的表位。在本发明的另一优选实施 方式中,所述试剂盒还包括第二抗体的溶液,所述第二抗体能够结合主要抗体,所述主要抗 体结合MVP或与MVP连接的分子。优选地,在加入能够结合MVP或分子的抗体后,在实施定量 技术的过程中,加入第二抗体溶液。
[0051 ] 在一些实例中,能够结合MVP或结合与MVP连接的分子的抗体不与酶连接。可选择 地,在本发明的另一优选实施方式中,定量溶液中所包含的能结合MVP或结合与MVP连接的 分子的抗体与酶连接。可以与抗体连接的酶的实例为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶。 此外,在另一优选实施方式中,第二抗体与酶连接,其中,所述第二抗体结合能结合MVP或结 合与MVP相连的分子的抗体。
[0052] 在本发明的优选实施例中,所述试剂盒进一步包括含结合MVP的固定抗体或分子 的ELI SA板。优选地,该板包括96个孔。可选择地,该板包含少于96个孔。优选地,ELI SA板内 固定的抗体或分子结合同一试剂盒的MVP储液瓶内包含的MVP。
[0053] 可选择地,在另一优选实施方式中,定量瓶包括含引物的定量溶液,所述引物能够 结合离体核酸序列或与分子连接的核酸片段,所述分子可以与MVP连接。优选地,在这些实 例中,定量溶液瓶可以包含MVP内包含的离体核酸片段的特异性PCR引物。可选择地,在这些 实例中,在定量步骤中,定量溶液瓶可以包含于分子连接的核酸片段的特异性PCR引物,所 述分子可以先与MVP连接。
[0054]在本发明的优选实施中,所述试剂盒包括能够结合MVP分子的溶液。该分子的溶液 的实例为含链霉肌动蛋白的溶液。该分子的溶液的另一实例为含有显示短核酸序列的链霉 肌动蛋白的溶液。优选地,在加入定量溶液前,在实施定量技术过程中加入该溶液。
[0055]在本发明的优选实施例中,试剂盒中包括实施ELISA或PCR的附加试剂。实施ELISA 或PCR的附加试剂的实例包括本领域常规使用的缓冲液、酶、或分子。
[0056]尽管结合具体的实施例描述了实施方式,显然对这些实施例进行各种修饰和改变 没,而不超出本发明的本质和保护范围。因此,说明书和附图被认为是用于说明的,而非限 制含义。 实施例 实施例1:鼠微小病毒(MMV)假病毒克隆的克隆、表达及纯化,制备储液
[0057]鼠微小病毒(MMV)为含属于感染脊椎动物宿主的微小病毒科(Parvoviridae)的病 毒单链DNA。使用各种杆状病毒表达系统可以克隆并表达鼠微小病毒壳蛋白基因 VP2,以产 生MVP(Hernando,2000)。为了克隆并表达MMV MVP,由公开的MMVVP2模板合成壳蛋白基因 VP2(GenBank J02275.1,nucleotides2794-4557,SEQ ID Νο·4)。在合成过程中优化特定的 密码子,从而提高翻译的效率(SEQ ID No.5)。所得氨基酸序列(SEQ ID No.6)与公开的VP2 序列100%同源(GenBank AAA67114.1,SEQ ID如.7)。将该基因插入克隆载体?1^57,然后 被亚克隆至pFastBac表达字体。然后该载体被用于转化DHlOBac细胞。筛选阳性克隆后,杆 状病毒质粒DNA被用于转化Sf9细胞。从Sf9细胞培养悬浮液收集携带MMV VP2基因的重组杆 状病毒。然后扩大初始的重组杆状病毒储液,并且在感染后4天收集。在Grace培养基中培养 该储液,并补充10 %FBS,然后在多重感染为4.0时转化Sf9细胞。然后在感染后3天收集细 胞,然后在水解缓冲液中悬浮。然后冷冻、融化该悬浮液3次。通过离心回收可溶性的溶菌 液,然后通过以下公开的程序纯化所得MVP(Hernando,2000)。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE(图1)和western杂交(未显示)确定氯化铯密度梯度分离后的MVP的纯度。基于此结果, 收集组分形成MMV MVP储液。通过利用负染色的透射电镜(图2)实现MMV MVP储液的可视化 以及浓度确定。 实施例2:克隆、表达以及纯化异源表位MMV MVP以制备储液 [0058] 制备MMV MVP,在其表面显示异源表位,因此能够用作MVP定量的靶标。为了克隆显 示异源表位的MMV MVP,首先合成MMV VP2基因的天然核苷酸序列(利用GenBank J02275.1, nucleotides 2794-4557,SEQ ID No.4作为模板),同时优化特定的密码子,以增加翻译效 率(SEQ ID No.5)。然后在氨基酸位置2处突变该序列(SEQ ID No.8),获得包括插入含 strepll标签的10个氨基酸序列的氨基酸序列(SEQ ID No.9)。然后使用与实施例1相同的 方法和程序克隆、表达、纯化以及制备含异源表位(strepll标签)的MVP储液。通过考马斯亮 蓝染色的SDS-PAGE(图3)和western杂交(未显示)确定氯化铯密度梯度分离后的MVP的纯 度。基于此结果,收集组分形成MMV MVP储液。通过利用负染色的透射电镜(图4)实现MMVMVP 储液的可视化以及浓度确定。通过利用链霉肌动蛋白和抗标签的mAb(未显示)的ELISA试验 进一步实现所得显示str印II标签的可视化。 实施例3:克隆、表达以及纯化异嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)MVP以制备储液 之前已显示使用共表达XMRV env和gag基因的Ad5载体感染细胞导致产生非感染颗粒 (Makarova,2011)。首先,可以使用基因的公开序列作为模板定制合成XMuLV gag和env基因 (分别为:GenBank accession number JF908817.1,nucleotides546_2156,SEQ ID No.10, and accession number K02730.1,nucleotides 291_2225,SEQ ID No.ll)。然后可以将核 实序列克隆至PUC57载体。然后,将env序列亚克隆至pDPl穿梭载体的CMV驱动的表达卡盒, 并且,将gag序列亚克隆至同一载体的MCMV驱动的表达卡盒,得到pDPl-XMuLV Venvgag。然 后,在共转染293-AD细胞以制备重组Ad5-XMuLV之前,可以将所述pDPl-XMuLV Venvgag质粒 线性化,并与pAdEasy-1质粒混合。可以通过在氯化铯梯度上双离心纯化重组腺病毒。为了 制备MVP储液,可以使用用友病毒吸收的Ad5-XMuLV感染MvlLu。然后,感染48小时后收集培 养基,通过0.45mm过滤,并且通过鹿糖梯度超滤进行浓缩/纯化。 实施例4:克隆、表达以及纯化含异源表位的XMuLV MVP,以制备储液 可以通过Suomalainen等1994中讨论的方法制备在其结构的表面含异源表位的XMuLV MVP。可选择地,可以合成XMuLV gag和/或env基因(分别为GenBank accession number JF908817.1,nucleotides 546-2156,SEQ ID No.10,and accession number K02730.1, nucleotides 291-2225,SEQ ID No. 11)之一的核苷酸序列,以包括用于异源标签的序列, 所述异源标签包括但不限于astrep-tag(氨基酸序列WSHPQFEK(SEQ ID No:l))、Flag tag (氨基酸序列DYKDDDDK(SEQIDNo:2))、或His-tag(氨基酸序列HHHHHH(SEQIDNo:3))。通 过以上实施例3所述的方法克隆、表达以及纯化。 实施例5:组装含核酸的XMuLV MVP
[0059] 为了制备含核酸片段的XMuLV MVP,如实施例4所述,可以首先从哺乳动物细胞表 达XMuLV gag和/或env蛋白。然后,根据公开的试验手册可以实施XMuLV gag和/或env蛋白 的离体组装,以包含可以我DNA或RNA的核酸(Gross等,1997; Yu等,2001)。 实施例6:通过离子交换树脂定量处理后从含mAb溶液中去除的MMV MVP
[0060] 取出-8 0 °C保藏的含单克隆抗体(m A b 1)的N S 0收获细胞培养液体,并融化。以 lMTris滴定材料至pH7.5,然后通过0.22μπι滤膜过滤。将100微升的含60个拷贝的显示异源 表位strep II标签表位的VP2壳蛋白的MMV MVP(浓度为lx 109MVP/ml)储液加入10mLd mAb 操作液中(1%ν/ν添加)。因此,操作液的浓度为9.9x 106MVP/ml((0.1ml x lx 109MVP/ml)/ 10.lmLs)。然后按照供应商(GE healthcare)建议的说明书组装0.66cm x 2cm的Q Sepharose Fast Flow,并且用AKTA explorer以50mM Tris-HCl,50mM NaCl(pH 7.5)、 60cm/hr流速进行平衡。平衡后,将lO.lmls的含MVP操作液以60cm/hr的流速负载柱子。收集 操作收集物作为蛋白流过所显示的UV280痕迹。取200yL的收集物样品。
[0061 ]然后实施ELISA定量技术,确定从纯化处理中各个操作收集物去除的MVP的量。事 先以兔多克隆抗MMVVP2抗体(Alpha Diagnostic,Cat#MVMVP21-S)覆盖微孔板。向涂覆的微 孔中加入50yL各操作收集物样品,孵育1小时,并且以1X的磷酸缓冲液(PBS)清洗3次。在初 始处理材料时制备MMV MVP储液的系列稀释液,获得MVP浓度为lx 108MVP/ml、lx 106MVP/ ml、和lx 104MVP/ml。将50yL的各稀释液加入微孔、孵育并清洗。然后向各微孔加入兔多克 隆抗MMV VP2抗体,孵育1小时,并以1X的磷酸缓冲液(PBS)清洗3次。然后加入HRP连接的抗 兔抗体(1:500),孵育1小时,并以1X的磷酸缓冲液(PBS)清洗3次。加入TMB底物溶液,通过加 入停止液停止反应。测量450nm处的光密度(OD)。以下表2显示OD450结果。 表2:MMV MVP去除研究的0D45Q测量值
[0062]以三种已知浓度的稀释液样品(相关OD450和MVP浓度)确定了最佳试剂盒的线性方 程。该线性方程的等式为: Υ = 0·05251η(χ)+0·1235
[0063] 通过处理两种操作收集物的0D45Q结果,确定这些样品中的MVP浓度。因此,试验确 定任一已知操作收集物中残留〇MVP/ml。由于该ELISA试剂盒的检测限值是未知的,因此设 定该限值为最低测试MVP浓度(lx 104MVP/ml)。由操作液中MVP的已知数量计算MMV MVP的 对数减少值。该值>9.9x 102,因此为通过纯化技术处理溶液后从该溶液中去除的MVP的量。 实施例7:通过细小病毒过滤处理后从含Mab的溶液中去除的XMuLV MVP的定量
[0064] 可以通过使用本领域常规的方法,利用蛋白亲和以及离子交换层析柱纯化含单克 隆抗体的生物技术操作液。该溶液可以在_80°C冷冻数月,然后融化,并通过0.22μπι滤膜过 滤。然后将12.5mL的XMuLV MVP储液滴加到250mL的过滤的操作液(5 %峰值v/v)。取lmL该添 加了MVP的操作液样品,用于随后的定量。将所述操作液(含XMuLV MVP)以30psi加压通过 Vpro细小病毒过滤,收集过滤物。取lmL的该过滤物样品(操作液)。
[0065]以MVP稀释液制备系列XMuLV MVP操作液的系列稀释液,操作液的MVP浓度为1X 109、lx 107、lx 105、以及lx 103MVP/ml的稀释液。然后向涂覆抗XMuLV env表位的抗体的微 孔加入50yL的各稀释液。然后孵育1小时,并以lx PBS清洗3次。加入TMB底物溶液,通过加入 停止液停止反应。测量450nm处的光密度(0D),以生成反应0D和MVP浓度关系的数据曲线。以 下表3显不0D45Q结果。
[0066] 表3:XMuLV MVP去除研究的0D45Q测量值
[0067] 通过细小病毒过滤出来去除的XMuLV MVP的数量可以试验定量。如上系列稀释液 样品所述,将lmL的操作液样品(添加 MVP后)和操作收集物进行相同的ELISA方法。将所得 〇D45Q值带入最符合表3数据的等式,预测过滤前后溶液中MVP的数量。如实施例6所述,根据 定量去除病毒领域的常规方法,由该数据可以计算XMuLV MVP LRV。
【主权项】
1. 确定从溶液中去除的MVP的数量的方法,其特征在于,所述方法包括步骤: a) 向溶液中添加 MVP; b) 通过纯化技术处理溶液;以及 c) 定量从溶液中去除的MVP的量。2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述溶液包含目的生物物质。3. 根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述目的生物物质为抗体、非抗体、疫苗、 核酸制品、以及血液或血浆衍生物。4. 根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,通过处理制备所述生物物质,其中,所 述处理为细胞培养方法或发酵方法,并且,所述处理利用人细胞、动物细胞、植物细胞、昆虫 细胞、杂交瘤细胞、酵母细胞或细菌细胞。5. 根据权利要求2-4任意一项所述的方法,其特征在于,通过权利要求1的步骤b)纯化 所述目的生物物质。6. 根据权利要求1-5任意一项所述的方法,其特征在于,所述纯化技术为层析、过滤、超 滤、离心、或病毒灭活技术。7. 根据权利要求1-6任意一项所述的方法,其特征在于,在步骤a)中的所述溶液中的 MVP的量大于b)步骤后的溶液中的MVP的量。8. 根据权利要求1-7任意一项所述的方法,其特征在于,所述MVP包括病毒壳蛋白、包膜 蛋白、或病毒壳蛋白和病毒包I吴蛋白。9. 根据权利要求8所述的方法,其特征在于,在细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细 胞、动物、或哺乳动物细胞中制备所述病毒壳蛋白或包膜蛋白。10. 根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,病毒包膜蛋白或壳蛋白来自微小病毒 科或逆转录病毒科。11. 根据权利要求8-10任意一项所述的方法,其特征在于,所述病毒壳蛋白或包膜蛋白 进一步包括异源表位。12. 根据权利要求1-11任意一项所述的方法,其特征在于,所述MVP包括离体核酸。13. 根据权利要求1-12任意一项所述的方法,其特征在于,确定从溶液中去除的MVP的 数量包括利用用于确定溶液中M V P数量的定量技术,包括E L I S A、P C R、纳米图像 (nano imaging )、焚光、酶促法、显微法、分光光度法、透射电镜,或western杂交技术。14. 根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述定量技术使用能结合MVP表面上存 在的壳蛋白表位、包膜蛋白表位、或异源表位的抗体。15. 根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述定量技术使用能够结合与MVP连接 的连接分子的抗体。16. 根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述定量技术使用与MVP连接的分子,能 结合所述分子的抗体,或能结合与所述分子连接的核酸片段的引物。17. 根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述定量技术使用能结合MVP内包含的 离体核酸序列的引物。18. 根据权利要求1-17任意一项所述的方法,其特征在于,所述方法进一步包括: a) 向溶液中添加第二种MVP; b) 通过纯化技术处理溶液;以及 C)定量从溶液中去除的第二种MVP的量。19. 根据权利要求18所述的方法,其特征在于,将第一种MVP和第二种MVP同时或顺序加 入所述溶液中。20. 根据权利要求18或19任意一项所述的方法,其特征在于,向所述溶液中加入两种或 多种附加种类的MVP。21. -种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括: a) 至少一个含MVP储液的容器; b) 至少一个含定量溶液的容器。22. 根据权利要求21所述的试剂盒,其特征在于,所述定量溶液包括能够结合MVP或结 合与MVP连接的分子的抗体。23. 根据权利要求21或22所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包括第二抗体 溶液,所述第二抗体能够结合能与MVP结合的抗体,或者结合能与MVP连接的分子。24. 根据权利要求21或22所述的试剂盒,其特征在于,所述抗体与酶连接。25. 根据权利要求23所述的试剂盒,其特征在于,所述第二抗体与酶连接。26. 根据权利要求21-25中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包 括含固定的抗体或能与MVP连接的分子的ELISA板。27. 根据权利要求21-26中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述定量溶液包括引 物,所述引物能结合离体核酸序列,或结合能与分子连接的核酸片段,所述分子能与MVP连 接。28. 根据权利要求21-27中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包 括能结合MVP分子的溶液。29. 根据权利要求21-28中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括用于 实施ELISA或PCR技术的附加反应试剂。
【文档编号】B01D35/00GK105899684SQ201480049583
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年9月9日
【发明人】大卫·赛特琳, 阿鲁·达尔
【申请人】默克维溶液
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