大环内酯类新化合物及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明提供了两种大环内酯类新化合物及其制备方法与应用，所述大环内酯类新化合物的结构式如下：本发明的化合物是由冰城链霉菌突变菌株Streptomyces bingchenggensis BC?120?4经培养和液体发酵，发酵液经过滤后，用甲醇浸提，乙酸乙酯萃取，浓缩后硅胶柱层析，RP?18柱层析后所得到的化合物。本发明的化合物具有较强的杀螨杀线虫活性。
【专利说明】
大环内酯类新化合物及其制备方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明属于农药技术领域，具体涉及一类具有杀虫活性的大环内酯类抗生素，及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 米尔贝霉素是日本三共公司以二斑叶螨为试虫，从微生物发酵液中分离得到的具 有抗虫活性的代谢产物。经过大量的实验研究，1983米尔贝霉素 A3/A4(A3/A4 = 3:7)被用作 杀螨剂。1990年，1 %的米尔贝霉素乳油(milbeknock)在日本被批准作为杀螨剂用于茶叶、 茄子。1993年，1 %的米尔贝霉素乳油(koromite)用作桃、梨、草莓、茄子、西瓜、花卉的杀虫 剂也被日本批准使用。由于其高效的杀虫能力和低毒特性，米尔贝霉素已在日本、欧美等多 个国家推广使用。因此开发高效低毒、易降解、无污染的米尔贝霉素类杀虫药具有重要的应 用价值。
[0003] 冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis是本实验室从土壤中分离得到的米 尔贝霉素产生菌。与其它米尔贝霉素产生菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus和Streptomyces griseochromogenes一样，冰城链霉菌 Streptomyces bingchenggensis除了产生米尔贝霉素 A3/A4外，还产生其它米尔贝霉素系 列化合物及其它的次级代谢产物。通过对Streptomyces bingchenggens i s进行常温常压等 离子诱变，我们获得了一株米尔贝霉素 A3/A4高产菌株Streptomy ces bingchenggensis BC-12〇-4(Hai-Yan ffang,Ji Zhang,Yue-Jing Zhang,Bo Zhang,Chong-Xi Liu,Hai-Rong He,Xiang-Jing ffang,ffen-Sheng Xiang.Combined application of plasma mutagenesis and gene engineering leads to 5-〇xomilbemycins A3/A4 as main components from Streptomyces bingchenggensis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014, 98:9703-9712)。因此，对该突变菌株发酵代谢产物的分离纯化可以发现新型、更高生物活 性的米尔贝霉素结构类似物，为米尔贝霉素生物合成机制的研究提供新的视角，也为新型 米尔贝霉素的药物开发提供丰富的实验材料。
[0004] 本发明主要涉及由冰城链霉菌突变菌株（Streptomyces bingchenggensis BC- 120-4)得到的新的米尔贝霉素类化合物，及它们的制备方法和应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一类具有强杀虫活性的大环内酯类化合物。
[0006] 本发明的另一个目的是提供这类大环内酯类化合物的制备方法。
[0007] 本发明提供的两种新大环内酯类化合物的分子结构分别如下：
[0008]
[0009]上述大环内酯类新化合物的制备方法是:将冰城链霉菌突变菌株经斜面培养、种 子培养、摇瓶发酵及分离纯化而得。
[0010]所述的冰城链霉菌突变菌株为Streptomyces bingchenggensis BC-120-4。
[0011] 所述的斜面培养为:培养基组成:葡萄糖l〇_12g/L，麦芽糖3-4g/L，酵母抽提粉3_ 4g/L，K2HP〇4.3H2〇 0.5-0.6g/L，MgS〇4· 7H20 0.5-0.6g/L，NaCl 0.5-0.6g/L，KN03 1.0-1.2g/L，琼脂粉20-25g/L，pH 7.0-7.2，用去离子水配制，于121°C下灭菌20min。接菌后置于 28 °C培养箱中，培养8-9天。
[0012] 所述的种子培养为：种子培养基组成：葡萄糖5-6g/L，麦芽糊精5-6g/L，可溶性淀 粉1.0-1.2g/L，酵母粉5-6g/L，牛肉膏 1.0-1.2g/L，酪蛋白胨1.0-1.2g/L，pH 7.0-7.2，用蒸 馏水配制，于121°C下灭菌20min。向菌种斜面上加入10ml无菌水，用已灭菌的接种环刮下孢 子制成孢子悬液，使其浓度为l〇 7_l〇8c. f. u. mr1，然后取2ml孢子悬液接种于种子培养摇瓶 中，种子摇瓶装液量为25ml/250ml，置于250rpm旋转式摇床，28°C培养46-52h。
[0013] 所述的摇瓶发酵为：发酵培养基组成(g/L):葡萄糖10-12,乳糖25-30,棉籽饼粉 25-30，CaC03 0 · 3-0 · 4，pH 7 · 0-7 · 2，用蒸馏水配制，于 121°C下灭菌20min。按8% (V/V)接种 量，将种子液接入到1L发酵摇瓶中，发酵摇瓶的装液量为100ml/L。置于250rpm旋转式摇床， 28 °C发酵培养7-8天。
[0014] 所述的分离和提纯的方法为:发酵液经100~200目筛网过滤后，滤渣用3-4倍体积 甲醇提取，提取液浓缩后用等体积乙酸乙酯萃取3-4次，将萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层 析和RP-18柱层析后，得到两种白色粉末状化合物1和化合物2。
[0015] 所述的硅胶柱层析用到的填料是100~200目的硅胶，流动相为石油醚：乙酸乙酯 =100:0-50:50(V/V)进行梯度洗脱，流速为10-20ml/min，依次收集洗脱液，薄层层析(TLC) 检测合并相同组分。
[0016] 所述的RP-18柱层析使用混合溶剂，即甲醇:水= 80:20-95:5(v/v)进行梯度洗脱， 流速为3-5ml/min，依次收集洗脱液，薄层层析(TLC)检测合并相同组分。
[0017] 本发明得到了两个新的大环内酯类化合物，新化合物对朱砂叶螨及松材线虫的杀 虫活性与商品化杀虫剂milbemycin A3/A4活性相当，可用于杀虫剂的开发。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作详细说明：
[0019] 实施例1
[0020] 1、发酵
[0021] (1)发酵菌种：发酵菌种是冰城链霉菌突变菌株，该菌株是公开于Hai-Yan Wang， Ji Zhang，Yue_Jing Zhang，Bo Zhang,Chong-Xi Liu，Hai_Rong He，Xiang-Jing Wang， ffen-Sheng Xiang. Combined application of plasma mutagenesis and gene engineering leads to 5-〇xomilbemycins A3/A4as main components from Streptomyces bingchenggensis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014, 98:9703-9712的冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis BC-120_4〇
[0022] (2)斜面培养：培养基组成（g/L):葡萄糖10,麦芽糖3,酵母抽提粉3，K2HP〇4 · 3H2〇0.5，MgS〇4*7H20 0.5，NaCl 0.5，KN〇3 1，琼脂粉20，pH 7.0,用去离子水配制，于 121°C 下灭菌20min。接菌后置于28°C培养箱中，培养8天。
[0023] (3)种子培养:种子培养基组成(g/L):葡萄糖5,麦芽糊精5,可溶性淀粉1，酵母粉 5,牛肉膏1，酪蛋白胨1，ρΗ 7.0,用蒸馏水配制，于121°C下灭菌20min。向菌种斜面上加入 10ml无菌水，用已灭菌的接种环刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为lOi.f.u.mr 1。然后取 2ml孢子悬液接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量为25ml/250ml，置于250rpm旋转式摇 床，28°C培养46h。
[0024] (4)发酵：发酵培养基组成（g/L):葡萄糖10，乳糖25，棉籽饼粉25，CaC03 0.3， pH7.0-7.2，用蒸馏水配制，于121°C下灭菌20min。按8 % (V/V)接种量，将种子液接入到1L发 酵摇瓶中，发酵摇瓶的装液量为l〇〇ml/L。置于250rpm旋转式摇床，28°C发酵培养8天。
[0025] 2、化合物分离
[0026] 30L发酵液经200目筛网过滤得到菌丝体滤饼3L。滤饼用去离子水洗后再用10L工 业甲醇浸泡过夜，过滤得甲醇提取液。所得提取液在45°C减压浓缩去除甲醇相直至剩余约 2L，然后用等体积乙酸乙酯分别萃取三次得乙酸乙酯萃取液，萃取液在减压条件下浓缩至 干，得到25g油状物质。
[0027]将所得的油状物质上硅胶柱(粒径100~200目）进行层析，用石油醚：乙酸乙酯= 100 :0-50 : 50(V/V)进行梯度洗脱，流速10ml/min，用250ml锥形瓶依次收集洗脱液，每份 250ml，经薄层层析检测(石油醚：乙酸乙酯= 2:1)后合并相同组分，得到组分一(RF = 0.72-0.78)、组分二（1^ = 0.63-0.71)、组分三(1^ = 0.48-0.62)。将组分一上1^-18柱进行层析， 用甲醇与水=80:20-95:5(V/V)进行梯度洗脱，流速3ml/min，用10ml试管依次收集洗脱液， 每份10ml，薄层层析(TLC)检测（石油醚：乙酸乙酯=2:1)，得到化合物1 (8.5mg)和化合物2 (6·lmg)〇
[0028] 3、结构鉴定
[0029]新化合物1
[0030] 性状：白色粉末
[0031] 溶解性:易溶于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水
[0032] 分子式：C32H46〇8
[0033] 比旋度：[α| 厂-卜 170 (c 0.25, EtQH)
[0034] 高分辨质谱(HRESI-MS) :557.3122[M-H] - (calcd for C32H45O8 557.3120)
[0035] 紫外吸收光谱（UV absorption spectrum)Xmax(EtOH)nm(loge) :251(4.44)，200 (4.41)
[0036] 红外吸收光谱（IR absorption spectrum)Vmax cm-1:3461，2966，2930，1717，1450， 1381,1341,1042,988
[0037] 新化合物2 [0038]性状：白色粉末
[0039] 溶解性:易溶于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水
[0040] 分子式:C3lH44〇8
[0041 ]比旋度：[α]::: +丨 62 (c 0,30, EK)H)
[0042] 高分辨质谱(HRESI-MS) :543.2972[M-H] - (calcd for C31H43O8 543.2963)
[0043] 紫外吸收光谱（UV absorption spectrum)Xmax(EtOH)nm(loge) :251(4.43)，202 (4.34)
[0044] 红外吸收光谱（IR absorption spectrum)Vmax cm-^3451,2955,2926,1699,1452, 1379,1264,1054,964
[0045] 新化合物1和新化合物2的1H和13C NMR(⑶Cl3)数据见表1。
[0046] 表1新化合物1和新化合物2的1Η和13C NMR(CDC13)数据
[0048]
[0049] 化合物1的结构式为：
[0050]
[0051 ]化合物2的结构式为：
[0052]
[0053] 4、杀虫活性测定
[0054] (1)杀螨虫活性
[0055] 将含lg/ml单个纯化合物的甲醇溶液用含0.01 % (w/v)表面活性剂烷基酚聚氧乙 烯醚的水稀释10倍，制成l〇〇mg/ml的溶液，再经稀释制成0 · 1，0 · 05，0 · 025，0 · 01，0 · 005mg/l 的稀释溶液作为样品溶液。将对有机磷类杀虫药敏感的朱砂叶螨接种到5工豆的初生叶上。 接种一天后，将豇豆的叶子浸泡在样品溶液中l_2s。将叶子在25°C放置3天后，用显微镜观 察存活成虫的个数，计算死亡率（％)。
[0056] (2)杀线虫活性
[0057]将含lg/ml单个纯化合物的甲醇溶液用水稀释10倍，制成100mg/ml的溶液，再依次 稀释得到1，0.5，0.25，0.1和0.05mg/ml的溶液。取上述不同浓度溶液各?ομL分别加入到90μ 1含活松材线虫水悬液中。混合液震荡后在25°C放置15h。在显微镜下计数不动线虫的数量 和测试线虫的总数。计算测试线虫的死亡率（％ )。
[0058]新化合物1和新化合物2具有较强的杀螨和杀线虫活性，见表2。
[0059]表2新化合物1和新化合物2的杀螨和杀线虫活性
[0060]
[0061]
[0062] a米尔贝霉素 A3和A4混合(30:70)
[0063]实验结果表明，新化合物1和2表现了较高的杀虫活性，与商品化的米尔贝霉素 A3/ A4活性相当，具有潜在的开发价值，不仅可以作为米尔贝霉素 A3/A4的替代杀虫新药，还有 望为合成活性更高的化合物提供前体。
[0064] 实施例2 [0065] 1、发酵
[0066] (1)发酵菌种：发酵菌种是冰城链霉菌突变菌株，该菌株是公开于Hai-Yan Wang， Ji Zhang,Yue-Jing Zhang,Bo Zhang,Chong-Xi Liu,Hai-Rong He,Xiang-Jing Wang, ffen-Sheng Xiang. Combined application of plasma mutagenesis and gene engineering leads to 5-oxomilbemycins A3/A4as main components from Streptomyces bingchenggensis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014, 98:9703-9712的冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis BC_12〇-4〇
[0067] (2)斜面培养：培养基组成（g/L):葡萄糖12,麦芽糖4,酵母抽提粉4，K2HP〇4 · 3出00.6，]\%504.7!120 0.6，恥(：10.6，1(勵3 1.2，琼脂粉20印!17.2，用去离子水配制，于121 °C下灭菌20min。接菌后置于28°C培养箱中，培养8天。
[0068] (3)种子培养:种子培养基组成(g/L):葡萄糖6,麦芽糊精6,可溶性淀粉1.2,酵母 粉6，牛肉膏1.2，酪蛋白胨1.2，？!17.2，用蒸馏水配制，于121°(：下灭菌2〇 1^11。向菌种斜面上 加入l〇ml无菌水，用已灭菌的接种环刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为lOi.f.u.mr 1。然 后取2ml孢子悬液接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量为25ml/250ml，置于250rpm旋转 式摇床，28°C培养46h。
[0069] (4)发酵：发酵培养基组成（g/L):葡萄糖12,乳糖30,棉籽饼粉30，CaC03 0.4， PH7.2,用蒸馏水配制，于121°C下灭菌20min。按8%(V/V)接种量，将种子液接入到1L发酵摇 瓶中，发酵摇瓶的装液量为l〇〇ml/L。置于250rpm旋转式摇床，28°C发酵培养8天。
[0070] 2、化合物分离
[0071] 30L发酵液经200目筛网过滤得到菌丝体滤饼3L。滤饼用去离子水洗后再用12L工 业甲醇浸泡过夜，过滤得甲醇提取液。所得提取液在45°C减压浓缩去除甲醇相直至剩余约 2L，然后用等体积乙酸乙酯分别萃取四次得乙酸乙酯萃取液，萃取液在减压条件下浓缩至 干，得到25g油状物质。
[0072]将所得的油状物质上硅胶柱(粒径100~200目）进行层析，用石油醚：乙酸乙酯= 100 :0-50 : 50(V/V)进行梯度洗脱，流速20ml/min，用250ml锥形瓶依次收集洗脱液，每份 250ml，薄层层析（TLC)检测（石油醚：乙酸乙酯= 2:1)合并相同组分，得到组分一（RF = 0.72-0.78)、组分二（1^ = 0.63-0.71)、组分三（1^ = 0.48-0.62)。将组分一上1^-18柱进行 层析，用甲醇与水=80:20-95:5 (V/V)进行梯度洗脱，流速5ml/min，用10ml试管依次收集洗 脱液，每份l〇ml，薄层层析(TLC)检测（石油醚：乙酸乙酯=2 :1)，得到化合物1(RF = 0.76， 9mg)和化合物2(RF = 0.74,8mg)。
【主权项】
1. 一种大环内醋类新化合物，其特征是:其结构式为：2. -种大环内醋类新化3. -种权利要求1或2所述的大环内醋类新化合物的制备方法，其特征是：将冰城链霉 菌突变菌株经发酵及分离纯化而得。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：所述的冰城链霉菌突变菌株为 Streptomyces bingchenggens iS BC-120-4;发酵前需对菌株进行斜面培养、种子培养。5. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是：所述的斜面培养为：斜面培养基组 成：葡萄糖l〇-12g/L，麦芽糖3-4g/L，酵母抽提粉3-4g/L，K油P〇4 ? 3出0 0.5-0.6g/L， MgS〇4.7H2〇 0.5-0.6g/L，化Cl 0.5-0.6g/L，KN〇3 1.0-1.2g/L，琼脂粉20-25g/L，pH 7.0- 7.2,用去离子水配制，灭菌，接菌后置于28°C培养箱中，培养8-9天，将培养得到的抱子用无 菌水配置成IO7-IO8C. f. U. mri的抱子悬液备用。6. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是：所述的种子培养为：种子培养基组 成：葡萄糖5-6g/L，麦芽糊精5-6g/L，可溶性淀粉1.0-1.2g/L，酵母粉5-6g/L，牛肉膏1.0- 1.2g/L，酪蛋白腺1.0-1.2g/L，pH 7.0-7.2，用蒸馈水配制，灭菌，取斜面培养所得107- 108C. f. U. ml-i抱子悬液接种于种子培养基中，置于旋转式摇床，28 °C培养46-5化。7. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是:所述的发酵:发酵培养基组成：葡萄 糖 10-12g/L，乳糖25-30g/L，棉巧饼粉25-30g/L，CaC〇3 0.3-0.4g/L，抑 7.0-7.2，用蒸馈水 配制，灭菌，将种子培养所得种子液接入到发酵培养基中，置旋转式摇床，28°C发酵培养7-8 天。8. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征是:所述的分离纯化的方法为:发酵液经100 ~200目筛网过滤后，滤渣用3-4倍体积甲醇提取，提取液浓缩后用等体积乙酸乙醋萃取3-4 次，将萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层析和RP-18柱层析后，得到两种化合物。9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征是:所述的硅胶柱层析用到的填料是100~ 200目的硅胶，流动相为石油酸：乙酸乙醋= 100 :0-50 :50(V/V)进行梯度洗脱，流速10- 20ml/min，依次收集洗脱液，薄层层析(TLC)检测合并相同组分;所述的RP-18柱层析使用混 合溶剂，即甲醇:水= 80:20-95:5(V/V)进行梯度洗脱，流速3-5ml/min，薄层层析(TLC)检测 合并相同组分。10.-种权利要求1或2所述的大环内醋类新化合物在制备杀蛾虫、杀线虫药中的应用。
【文档编号】A01P7/02GK105906650SQ201610269553
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】向文胜, 王继栋, 张继, 李建宋, 王相晶
【申请人】东北农业大学