一种鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种鼠白细胞介素?4受体α链融合TT表位重组蛋白及其制备方法，应用人工合成的方法获得了mIL?4Rα?EX?TT的基因，目的基因克隆入pET28a(+)原核表达载体，转化大肠杆菌BL21，在大肠杆菌中高效表达，经过离子交换层析获得了纯化的目的蛋白，以经纯化后得到的目的蛋白mIL?4Rα?EX?TT能够结合IL?4Rα，在体能能够产生抗体，为mIL?4Rα?EX?TT自体疫苗的进一步研究和广泛应用奠定基础。
【专利说明】
一种鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白及其制备 方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药生物技术领域，涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目 的蛋白质的纯化及鉴定、目的蛋白质在体外的生物学活性检测等技术，具体地说，涉及一种 鼠白细胞介素-4受体 α链融合ΤΤ表位重组蛋白及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 支气管哮喘，简称哮喘，是一种常见的气道慢性炎症性疾病以气道高反应性和气 道黏液高分泌为主要临床特征，发病率较高且花费巨大。哮喘中黏液高分泌阻塞气道导致 气流受限，是肺功能第1秒呼气量(FEV1)下降加速的独立危险因素，成为重症哮喘的主要死 因。在Τ淋巴细胞等炎性细胞的参与下诱发气道慢性炎症，引起气道高反应，导致可逆性气 道阻塞性疾病。临床上主要表现为反复发作性喘息，呼吸困难、胸闷或咳嗽。
[0003] Thl/Th2淋巴细胞不平衡是儿童哮喘的主要表现和病因，哮喘发病机制复杂多样， 与多种细胞和细胞组分相关，以气道高反应性和气道黏液高分泌为主要临床特征。哮喘患 者伴有高IgE血症以及T淋巴细胞浸润，提示免疫反应在哮喘发病中具有重要的作用，主要 表现为慢性气道炎症、气流受限及气道高反应性。支气管哮喘的气道炎症是特殊类型的慢 性气道炎症，甚至在轻度哮喘也存在，主要以活化的T淋巴细胞浸润、炎性介质的产生、肥大 细胞的激活为特点。
[0004] T淋巴细胞是一群具有免疫活性的小淋巴细胞，成熟的T淋巴细胞是高度不均一的 细胞群体，包括不同的T细胞亚群，主要有Th 1、Th2、Thl 7和Treg等，在免疫应答和过敏性反 应中发挥不同的生物学作用。在正常机体中，这些T淋巴细胞亚群保持一种平衡状态，但是 在感染和免疫性疾病中，T淋巴细胞亚群之间的平衡被打破，免疫调节失衡，导致炎性因子 "风暴"，致使疾病发展。Thl/Th2比例失调是哮喘发生的一个主要因素，在哮喘发生发展中 发挥重要的生物学作用。在IL-4诱导下⑶II促进ThO细胞向Th2发育，导致Thl减少，Th2增 加。Th2细胞促进B淋巴细胞产生大量IgE和分泌炎症性细胞因子，进而刺激其他细胞产生一 些列炎性介质，最终诱发速发型变态反应和慢性气道炎症。IL-9和IL-13是经典的促气道黏 液产生Th2型细胞因子。IL-13是调控气道黏液分泌的关键和强效介质，缺少IL-13参与，不 论IL-9或是其他Thl细胞因子均不能诱导产生黏液。若完全阻断IL-13,可彻底消除黏液分 泌，而部分阻断仅能引起气道黏液分泌与维持量的小幅减少。IL-13调控黏液产生依赖于 IL-4Ra和信号传导及转录激活因子6(STAT6)，IL-13与受体结合，导致STAT6磷酸化，并下调 F0XA2,而F0XA2是调控杯状细胞分化的多种信号传导通路的共同交会点，可抑制MUC5AC转 录，阻止杯状细胞增生进展。
[0005] Th2型细胞来源的IL-4和IL-13是经典的促气道黏液产生的细胞因子，是调控气道 黏液分泌的关键介质。研究表明，阻断IL-4和IL-13能消除黏液分泌。IL-4Ra亚单位是IL-4 和IL-13的受体共用链，IL-4Ra的单克隆抗体能够同时阻断IL-4和IL-13信号通路，降低嗜 酸红细胞的数量。IL-13与其受体结合能够激活因子6(STAT6)，使STAT6磷酸化，进而下调 F0XA2，F0XA2在调控杯状细胞分化和调控气道黏蛋白的表达中发挥重要的作用。
[0006] TT830-844(QYIKANSKFGITEL)是破伤风毒素来源的非常有效的T细胞辅助表位。融 合TT830-844T细胞辅助表位的HER2融合蛋白能够明显提高自身抗原在体内诱导抗体的产 生，并抑制肿瘤的生长。同样地，融合了 TT830-844的豆荚蛋白也加强了其在体内产生抗体 的能力，达到了免疫治疗肿瘤的目的。本研究，我们观察其在小鼠体内产生抗体的能力，初 步研究了其在哮喘小鼠模型中对杯状细胞数量及黏蛋白分泌的影响。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白及其制 备方法，该方法制备的鼠 mIL-4Ra-EX_TT自体疫苗能够竞争结合IL_4Ra，在小鼠体内能够产 生抗体，具有生物学活性，为其广泛应用奠定基础。
[0008] 本发明利用大肠杆菌偏爱密码子，合成mIL-4Ra-EX-TT基因，构建mIL-4Ra-EX-TT 表达载体pET-28a-mIL-4Ra-EX-TT，重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导表达 后，经阴离子交换作用层析和分子筛层析两步层析纯化重组蛋白，最终获得了高纯度的 mIL-4Ra-EX-TT重组蛋白，并采用Western blot和HPLC对其进行鉴定。小鼠体内注射mIL-4R a-EX-TT观察其诱导产生自身抗体的能力。通过ELISA和竞争ELISA实验测定其结合活性，小 鼠体内观察其产生抗体的能力。
[0009] 其具体技术方案为：
[0010] 一种鼠白细胞介素-4受体a链融合TT表位重组蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[0011] -种本发明所述鼠白细胞介素-4受体a链融合TT表位重组蛋白的制备方法，包括 以下步骤：
[0012] 1)构建 mIL-4Ra-EX_TT 融合蛋白基因表达载体 pET-28a( + )-mIL-4Ra-EX_TT
[0013] 依据大肠杆菌偏爱的密码子，将mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白的氨基酸序列转化为基 因序列，5'端引入Nco I酶切位点，3'端引入Sal I酶切位点，设计的基因序列如SEQ ID N0: 2所示；
[0014] 上述基因合成后，用Nco I和Sal I两个限制性内切酶酶切pET28a载体，1.0%琼脂 糖凝胶电泳分离回收酶切大片段，再用Nco I和Sal I两个限制性内切酶酶切合成的含有 mIL-4Ra-EX-TT基因的pGH-mIL-4Ra-EX-TT质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切小片 段，将回收的大、小片段用T4连接酶在16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细 胞，提取质粒，DNA测序结果显示合成的mIL-4Ra-EX-TT基因成功的克隆入pET-28a载体;将 此质粒命名为 pET-22b( + )-mIL-4Ra-EX-TT;
[0015] 1 .mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白的表达、纯化
[0016] 重组质粒pET-28a-mIL-4Ra-EX-TT转化大肠杆菌BL21感受态细胞，12h后挑取边缘 整齐，生长状态良好的菌落，接种于LB培养液中，摇床37°C培养过夜，次日以1:100的比例接 种于新鲜LB培养液中，37 °C继续培养至细菌密度达到0D6QQ = 0.4~0.6，加入终浓度ImM IPTG，诱导4h后收集菌体；
[0017]按lg菌体加10ml裂菌缓冲液STE的比例将菌体重悬，在冰浴中300W超声裂解菌体 30min，工作5秒，间隙10秒；12000rpm X 20min，4°C下离心，收集超声上清；以30倍体积的A 液：20mM Tris-HCl pH 8.0，lmM EDTA进行透析透析，中间换液三到四次，透析后液体过 0·22μηι的滤膜，然后用经A液充分平衡的Q Sepharose Fast Flow层析纯化，用B液：20mM Tris-HCl pH 7.5,1M NaCl，lmM EDTA连续梯度洗脱6个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱 峰进行分析;将其对30倍体积PBS透析，用0.22μπι滤膜过滤除菌，目的峰再进行分子筛层析， 流动相为PBS pH 7.2缓冲液;收集目的峰;分装后-20°C保存备用；
[0018] 3)mIL-4Ra-EX_TT 融合蛋白鉴定 [0019] SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0020] 取20μ1待鉴定样品加入20yL2X载样缓冲液混匀，沸水中煮10min，12000rpmX lOmin离心，取10μ1上清进行15%SDS-PAGE，上样后电压为30V约lh，样品进入分离胶后电压 升至60V约4h，用0.5 %考马斯亮兰R-250振荡染色2h，脱色直至背景清洗后进行胶的保存； [0021] Western-Blot 检测产物
[0022] 在SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸 纤维膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液中100V恒压电泳lh，将蛋白转移至PVDF膜上；电 转移结束后，取出PVDF膜，洗涤液TBST清洗后浸入封闭液中4 °C封闭过夜;次日，TBST室温洗 膜3次，每次5min;加入1:2000稀释的兔抗鼠 IL-4Ra单克隆抗体，室温孵育lh; TBST室温洗3 次，每次5min;再加入1:5000的HRP标记山羊抗兔IgG二抗，室温孵育lh; TBST室温洗3次，每 次5min;最后用TBST和TBS各洗3次，每次5min; PVDF膜按照ECL产品说明书进行显色。
[0023]进一步，步骤2)中所述LB培养液含氨苄青霉素 100mg/L。
[0024] 进一步，步骤2)中所述裂菌缓冲液STE具体为：20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，lmM EDTA。
[0025] 进一步，，步骤3)中所述转移缓冲液具体为：25mM Tris、192mM Glycine、20%甲 醇。
[0026] 进一步，步骤3)中所述洗涤液 TBST具体为：20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl、 0.05%Tween_20。
[0027] 进一步，步骤3)中所述TBS具体为：20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl。
[0028] 进一步，步骤3)中所述封闭液含5%脱脂奶粉的TBST。与现有技术相比，本发明的 有益效果为：
[0029] 1)利用基因人工合成技术成功构建了 mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白的基因表达载体 pET-28-a-mIL-4Ra-EX-TT，其鉴定结果与预期一致。
[0030] 2)工程菌pET-28-a-mIL-4Ra-EX-TT/BL21经ImM IPTG诱导后便可高效表达目的蛋 白，诱导后菌体的超声裂解后，经离子交换作用层析，可得到纯度大于95%的目的蛋白。
[0031] 3)采用免疫印迹证明mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白可与IL-4Ra克隆抗体特异性结合， HPLC分析结果表明制备的mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白纯度可达95 %以上。
[0032] 4)纯化的mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白与mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白能够在小鼠体内产 生抗体，其效价能够达到1:10000，且mIL-4Ra-EX-TT自体疫苗产生的抗血清能够竞争结合 mIL_4Ra0
[0033] 5)mIL-4Ra-EX_TT自体疫苗对哮喘小鼠气道炎症具有明显的减轻作用。
【附图说明】
[0034] 图 1 是pET28-a-mIL-4Ra-EX_TT 的质粒 DNA 测序结果图；
[0035] 图2是目的蛋白质经过阴离子柱层析分离的色谱图，1;穿过峰；2,3:杂蛋白洗脱 峰;4:目的蛋白洗脱峰；
[0036] 图3是目的蛋白质经过阴离子柱层析分离后获得的目的蛋白峰，然后进行分子筛 层析的结果。
[0037]图4是mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白的诱导表达和纯化结果，图中M:蛋白质分子量 marker; 1:裂菌上清;2:裂菌沉淀;3:阴离子层析目的峰;4:分子筛层析目的峰；；
[0038]图5是mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白的免疫印迹鉴定：1:对阴离子层析目的峰的免疫印 迹分析;2:对分子筛层析目的峰的免疫印迹分析
[0039] 图6是mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白的HPLC鉴定结果；
[0040]图7是mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白免疫小鼠抗血清效价结果；
[0041 ] 图8是mIL-4Ra-EX_TT融合蛋白诱导抗血清与mIL_4Ra单抗竞争结合mIL_4Ra结果；
[0042]图9是mIL-4Ra-EX_TT自体疫苗对哮喘小鼠气道炎症的影响结果；
[0043]图10是mIL-4Ra-EX_TT自体疫苗对哮喘小鼠气道黏液分泌的影响结果。
【具体实施方式】
[0044]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0045]按照本发明采用的技术方案是:利用大肠杆菌偏爱密码子，合成mIL-4Ra-EX_TT融 合蛋白基因，构建mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白基因表达载体pET-28a(+)-mIL-4Ra-EX-TT，重组 质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导表达后，经阴离子交换作用层析和分子筛层 析纯化重组蛋白，最终获得了高纯度的mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白，并采用Western blot和 HPLC对其进行鉴定。体内外检测其诱导自身抗体的能力，观察其对小鼠哮喘的治疗效果。结 果表明，mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白在小鼠体内能够成功诱导出自身抗体，诱导的抗血清具有 生物学活性，能够有效减轻小鼠哮喘的发生。。
[0046] 实现上述mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白的制备方法，按照以下步骤进行：
[0047] 1.合成 mIL-4Ra-EX-TT 基因序列
[0048]由genebank获得鼠 IL_4Ra的（GI:124336)胞外段序列，根据文献获得TT83q-844表位 的氨基酸序列。依据大肠杆菌偏爱密码子，将mIL-4Ra-EX-TT的氨基酸序列转化为基因序 列，两段重复的基因序列用GGATCC(对应GS)串联，5 '端引入Nco I酶切位点CCATGG，3 '端引 入终止密码子TAA和Sal I酶切位点GTCGAC，合成目的基因 mIL-4Ra-EX-TT。合成的基因序列 如下：
[0049] 5 '-CCATGGATCAAAGTTCTGGGCGAACCGACCTGCTTTAGCGATTATATTCG
[0050] 起始码Nco I
[0051 ] CACCTCTACATGCGAATGGTTTCTGGATAGTGCGGTTGATTGCTCTAGCCAGTTATGCTTACATTATCG TCTGATGTTCTTCGAGTTTAGCGAAAATCTGACATGCATCCCACGCAATAGTGCAAGCACCGTTTGCGTTTGTCACA TGGAGATGAATCGTCCGGTGCAGTCAGATCGCTATCAGATGGAACTGTGGGCCGAACATCGCCAGCTGTGGCAGGGT AGCTTTAGTCCTTCAGGCAATGTTAAACCACTGGCCCCGGATAATCTGACACTGCATACAAATGTGAGCGATGAATG GCTGTTAACGTGGAATAACCTGTATCCAAGTAACAATTTGCTGTATAAGGATCTGATTAGTATGGTTAATATCTCTC GTGAAGATAATCCGGCAGAGTTTATTGTGTATAATGTGACCTACAAAGAACCTCGCCTGAGCTTTCCTATCAATATC CTGATGTCAGGTGTGTATTATACCGCTAGGGTGCGCGTTCGCTCACAGATATTAACGGGTACATGGAGTGAATGGTC TCCGAGCATTACCTGGTATAATCATTTTCAGCTGCCGCTGATCCAGCGCGGATCCCAGTATATCAAAGCCAATTCTA AATTCATTGGCATC
[0052] Linker BamH I
[0053] ACGGAATAA GTCGAC-3,
[0054] 终止码Sal I
[0055] 2 ·构建mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白基因表达载体
[0056] pET-28a( + )-mIL-4Ra-EX_TT用Nco I和Sal I两个限制性内切酶酶切pET28a载体， 1.0%琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切大片段，再用Nco I和Sal I两个限制性内切酶酶切合 成的含有mIL-4Ra-EX-TT基因的pGH-mIL-4Ra-EX-TT质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳分离回收 酶切小片段，将回收的大、小片段用T4连接酶在16 °C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，提取质粒，DNA测序结果显示合成的mIL-4Ra-EX-TT基因成功的连接到了 pET-28a载体（图 1)。将此质粒命名为pET-28a(+) -mlL-4Ra-EX-TT。
[0057] 3.mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白的表达、纯化
[0058] 重组质粒pET-28a( + )-mIL-4Ra-EX-TT转化大肠杆菌BL21感受态细胞，12h后挑取 边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于LB培养液(含氨苄青霉素 100mg/L)中，摇床37°C培 养过夜，次日以1:100的比例接种于新鲜LB培养液(含氨苄青霉素 100mg/L)中，37°C继续培 养至细菌密度达到〇D6QQ = 0.4~0.6，加入终浓度0.5mM IPTG，诱导4h后收集菌体。
[0059] 按lg菌体加 10ml裂菌缓冲液STE(20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，lmM EDTA) 的比例将菌体重悬，在冰浴中300W超声裂解菌体100次，工作5秒，间隙10秒。离心（12000rpm X20min，4°C)，收集超声上清。
[0060] 以30倍体积的A液：20mM Tris-HCl pH 8.0，lmM EDTA进行透析透析，中间换液三 到四次，透析后液体过〇.22μηι的滤膜，然后用经A液充分平衡的Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia公司）层析纯化，用B液：20mM Tris-HCl pH 7.5,1M NaCl，lmM EDTA连续梯度洗 脱6个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰进行分析（图2)。将其对30倍体积PBS透析，用 0.22μπι滤膜过滤除菌，目的峰再进行分子筛层析，流动相为PBS(pH 7.2)缓冲液。收集目的 峰。分装后-20 °C保存备用。
[0061 ] 4.mIL-4Ra-EX_TT 融合蛋白鉴定 [0062] 1)SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0063] 取20μ1待鉴定样品加入20yL 2 X载样缓冲液混匀，沸水中煮10min，离心 (12000rpmX10min)，取10μ1上清进行15%SDS-PAGE，上样后电压为30V约lh，样品进入分离 胶后电压升至60V约4h，用0.5%考马斯亮兰R-250振荡染色2h，脱色直至背景清洗后进行胶 的保存(图4)。
[0064] 2)Western_Blot 检测产物
[0065] 在SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸 纤维(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mM Tris、192mM Glycine、20%甲醇）中 100V恒压电泳lh，将蛋白转移至PVDF膜上。电转移结束后，取出PVDF膜，洗涤液TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl、0.05%Tween-20)清洗后浸入封闭液（含5%脱脂奶粉的 TBST)中4°C封闭过夜。次日，TBST室温洗膜3次，每次5min;加入兔抗鼠 IL-4Ra单克隆抗体（1 :2000稀释），室温孵育lh; TBST室温洗3次，每次5min;再加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗（1: 5000)，室温孵育lh; TBST室温洗3次，每次5min;最后用TBST和TBS(20mM Tris-HCl，pH7.5、 150mM NaCl)各洗3次，每次5min; PVDF膜按照ECL产品说明书进行显色。（图5).
[0066] 3)HPLC纯度鉴定
[0067] 用流动相（50mM Tris-HCl ImM EDTA pH 7.5)平衡TSK-Gel G3000SW色谱柱至基 线平稳，流速为0.5mVmin，取20μ1蛋白样品上样，用流动相洗脱，检测波长为280nm，记录并 分析结果(图6)。
[0068] 4)mIL-4Ra-EX_TT生物学活性测定
[0069] ①mI L-4Ra-EX-TT免疫小鼠 BALB/C小鼠12只，随机分为2组（生理盐水组和免疫 组），每组6只。每周免疫1次，共免疫4次，每次每只20ygmIL-4Ra-EX-TT，前3次为皮下两点注 射，每点1〇〇μ1，最后一次免疫为腹腔注射，每只200μ1。
[0070] ②ELISA检测抗体滴度末次免疫后，第7天眼球取血，4°C放置2h，12000 X g离心 1 Omi η，制备小鼠抗血清，于-20 °C保存。将商品化的ml L-4Ra包被酶标板，1 〇〇ng/孔，于4 °C过 夜。弃上清，以5mg/L BSA置37°C封闭2h;弃上清，以TBST(含lml/LTween20的TBS缓冲液)洗5 次，2min/次，每孔加入100μ1 HRP标记的小鼠二抗（1: 2500)，于37°C孵育lh;TBST洗3次；以 (PD显色15min;加入50μ1 2mol/L硫酸终止反应，490nm读取0D值，实验设置3个复孔，并设无 关蛋白空白对照，检测结果见图7。
[0071] ③竞争ELISA mIL-4Ra包被酶标板，l〇〇ng/孔，4°C过夜。弃上清，以5mg/L BSA置37 。(:封闭2h;弃上清，以TBST (含lml/L TWeen20的TBS缓冲液)洗5次，2min/次，每孔加入100ng 和不同比例的小鼠抗血清（1:4、1:10、1: 50和1: 250 )，37 °C封闭lh，弃上清，以TBST洗5次， 2min/次；每孔加入HRP标记的小鼠二抗（1: 2500)，于37 °C孵育lh; TBST洗3次；以0PD显色 15min;加入50μ1 2mol/L硫酸终止反应，490nm读取0D值，实验设置3个复孔，并设无关蛋白 空白对照，检测结果见图8。
[0072] 5)小鼠哮喘模型干预和治疗观察
[0073] ①哮喘模型制备和干预BALB/C小鼠18只，随机分为3组，分别为对照组、哮喘组和 mIL-4Ra-EX-TT干预组，每组6只。分别于第0、7天给予鸡卵蛋白（0VA)致敏液0.5ml致敏，对 照组以相同体积生理盐水替代。哮喘组和干预组于第14~28天给予雾化吸入1%0VA激发液 诱发哮喘，每次持续约5h，每日1次。干预组于第0天给予20yg mIL-4Ra-EX-TT蛋白免疫，每 周免疫1次，共免疫4次。
[0074]②HE染色检测气道炎症常规方法进行HE染色，并依据以往研究小鼠气道周围炎性 细胞浸润评分[1()]。〇分，无炎性细胞；1分，少许炎性细胞;2分，较多分布不均的炎性细胞;3 分，大量炎性细胞，分布均匀，少见聚集成团;4分，大量炎性细胞聚集成团，结果见图9。 [0075]③过碘酸-雪夫（PAS)染色石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精水化，流水浸洗2min;以 0.5 %高碘酸氧化液染色10min;冲洗2min; Schiff液染色10min;冲洗3min;以Mayer明研^苏 木素液染核2min;以0.5%盐酸酒精分化;脱水;二甲苯透明；中性树胶封固。显微镜观察计 数。随机选取5个视野，统计细胞数目，取平均值，结果见图10。
[0076]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。2. -种权利要求1所述鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白的制备方法，其特 征在于，包括以下步骤： 1)构建ml L-4Ra-EX-TT 融合蛋白基因表达载体 pET-28a (+) -ml L-4Ra-EX-TT 依据大肠杆菌偏爱的密码子，将mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白的氨基酸序列转化为基因序 列，5'端引入Nco I酶切位点，3'端引入Sal I酶切位点，设计的基因序列如SEQ ID N0:2所 示； 上述基因合成后，用Nco I和Sal I两个限制性内切酶酶切pET28a载体，1.0%琼脂糖凝 胶电泳分离回收酶切大片段，再用Nco I和Sal I两个限制性内切酶酶切合成的含有mIL-4R α-ΕΧ-ΤΤ基因的pGH-mIL-4Ra-EX_TT质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切小片段，将回 收的大、小片段用T4连接酶在16 °C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取 质粒，DNA测序结果显示合成的mIL-4Ra-EX-TT基因成功的克隆入pET-28a载体;将此质粒命 名为 pET-22b ( + ) -mIL-4Ra-EX-TT; 2 )mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白的表达、纯化 重组质粒pET-28a-mIL-4Ra-EX-TT转化大肠杆菌BL21感受态细胞，12h后挑取边缘整 齐，生长状态良好的菌落，接种于LB培养液中，摇床37 °C培养过夜，次日以1:100的比例接种 于新鲜LB培养液中，37°C继续培养至细菌密度达到OD6qq = 0.4~0.6，加入终浓度ImM IPTG， 诱导4h后收集菌体； 按Ig菌体加 IOm 1裂菌缓冲液STE的比例将菌体重悬，在冰浴中30OW超声裂解菌体 30min，工作5秒，间隙10秒；12000rpm X 20min，4°C下离心，收集超声上清；以30倍体积的A 液：20mM Tris-HCl pH 8.0, ImM EDTA进行透析透析，中间换液三到四次，透析后液体过 0·22μηι的滤膜，然后用经A液充分平衡的Q Sepharose Fast Flow层析纯化，用B液：20mM Tris-HCl pH 7.5, IM NaCl，ImM EDTA连续梯度洗脱6个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱 峰进行分析;将其对30倍体积PBS透析，用0.22μπι滤膜过滤除菌，目的峰再进行分子筛层析， 流动相为PBS pH 7.2缓冲液;收集目的峰;分装后-20°C保存备用； 3 )mIL-4Ra-EX-TT融合蛋白鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 取20μ1待鉴定样品加入20yL 2 X载样缓冲液混匀，沸水中煮lOmin，12000rpmX IOmin 离心，取10μ1上清进行15%SDS-PAGE，上样后电压为30V约lh，样品进入分离胶后电压升至 60V约4h，用0.5 %考马斯亮兰R-250振荡染色2h，脱色直至背景清洗后进行胶的保存； ￥68七6111-131〇1：检测产物 在SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照BiO-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维 膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液中IOOV恒压电泳Ih，将蛋白转移至PVDF膜上；电转移 结束后，取出PVDF膜，洗涤液TBST清洗后浸入封闭液中4 °C封闭过夜;次日，TBST室温洗膜3 次，每次5min;加入1:2000稀释的兔抗鼠 IL-4Ra单克隆抗体，室温孵育Ih; TBST室温洗3次， 每次5min;再加入1: 5000的HRP标记山羊抗兔IgG二抗，室温孵育Ih; TBST室温洗3次，每次 5min;最后用TBST和TBS各洗3次，每次5min; PVDF膜按照ECL产品说明书进行显色。3. 根据权利要求2所述鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白的制备方法，其特 征在于，步骤2)中所述LB培养液含氨苄青霉素 I OOmg/L。4. 根据权利要求2所述鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白的制备方法，其特 征在于，步骤2)中所述裂菌缓冲液STE具体为：20mM Tris-HCl pH 7.5, IOOmM NaCl，ImM EDTA。5. 根据权利要求2所述鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白的制备方法，其特 征在于，步骤3)中所述转移缓冲液具体为:25mM Tris、192mM Glycine、20%甲醇。6. 根据权利要求2所述鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白的制备方法，其特 征在于，步骤3)中所述洗涤液TBST具体为：20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl、0.05 % Tween-20〇7. 根据权利要求2所述鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白的制备方法，其特 征在于，步骤3)中所述TBS具体为:20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl。8. 根据权利要求2所述鼠白细胞介素-4受体α链融合TT表位重组蛋白的制备方法，其特 征在于，步骤3)中所述封闭液含5%脱脂奶粉的TBST。
【文档编号】C12N15/66GK105906718SQ201610284192
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】吴守振, 段明玥, 张书婉, 鱼丽娟, 刘翠翠
【申请人】西安市儿童医院