一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法及其应用，从三七块根上切下休眠芽，用清水洗净表面后，再用70%乙醇浸泡1.5分钟，用无菌水清洗3遍；把休眠芽放入含有10%次氯酸钠溶液中，表面消毒10分钟，接着用无菌水冲洗3遍；再把休眠芽放入到含有MS培养基的锥形瓶中，光照培养1个月后，菌丝长出。在光学显微镜下挑取单个孢子，并培养于PDA培养基中。本发明的三七内生真菌枝顶孢霉可以促进三七的萌发及根系的发育。CGMCC No:1237420160421
【专利说明】
一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]内生真菌是一类生长于健康活体植物组织中的特殊的真菌，它们是植物组织内的正常菌群，主要存在于表面细胞层下的组织中，而且宿主组织暂时没有症状。内生真菌与宿主长期共存，因此可能存在着能与植物宿主的遗传信息相互交换的遗传系统，具有独特的生物学和遗传学特性，能产生具有多种生物活性的新型化合物，如抗菌素、植物生长调节剂、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等。植物来源的活性物质含量一般很低，而且目前世界上的植物资源也日益减少，因此从植物中获得生物活性物质的成本很高，但若能利用植物内生真菌发酵产生活性物质，则成本必然下降，而且对保护环境、维持可持续发展亦有重大意义。因此内生真菌近年来吸引了众多学者的研究兴趣。
[0003]三七是一种中药材，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，但三七内生真菌的研究、相关应用还未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目地旨在提供一种三七内生真菌枝顶孢霉，该三七内生真菌枝顶孢霉分类为Acremonium yunnanensis,于2016年4月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.12374。保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0005]本发明的另一目地是提供一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法及其应用。
[0006]本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉，是将三七块根上的休眠芽切下，经过清洗、消毒、培养、分离后得到的内生真菌枝顶孢霉。
[0007]上述三七内生真菌枝顶孢霉的核糖体DNA序列为:
[0008]
TCCGTAGGGTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTGTAAAAACTCCCAAACCATTGTGAACCTACCACTGTTGCTT
CGGCGGCCTCGCCCCGGGCGCGTTCGCGCGGCCCGGACCCAGGCGTCCGCCGGAGGCTCCAAACTCTTGTGTTTTAG
TGTATTTCTGAGTGGCATAAGCAAATAAATCAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAAC
GCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCC
AGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGACCCGTTCGCGGGACCTGGCGTTGGGGATC
AGCCTGCCCCTGGCGGCGGCTGGCCCTGAAATCCAGTGGCGGTTCCCTCGCGAACTCCTCCGTGCAGTAATTAAACC
TCTCGCGGCAGGATAGCGGTTGAACCACGCCGTTAAACCCCCCACTTCTCAAGGTTGACCTCAGATCAGGTAGGAAT
ACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAGGCCGGAGGAo
[0009]本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法，具体步骤如下:
[0010]首先，从三七块根上切下休眠芽，用水清洗表面，再用乙醇浸泡I?2分钟，最后用无菌水清洗2?4遍；
[0011]其次，将所述休眠芽放入次氯酸钠溶液中，消毒8?12分钟，再用无菌水冲洗2?4遍；
[0012]最后，将所述休眠芽放到含有MS培养基的容器中，光照培养25?35天后即得三七内生真菌枝顶孢霉。
[0013]其中，乙醇的浓度为70%，次氯酸钠溶液的浓度为10%。
[0014]本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉在以下方面的应用:
[0015]本发明一种三七内生真菌枝顶孢霉在促进植物发育及种子根系发育上的应用，所述植物包括人参、水稻、玉米、小麦、重楼、马铃薯等。
[0016]本发明一种三七内生真菌枝顶孢霉其遗传物质及次生代谢产物在植物发育、抗病及根系发育上的应用，所述遗传物质包括DNA、RNA、蛋白质、小RNA，其中，小RNA包含microRNA ；所述次生代谢产物包括植物激素、酚类物质、酮类物质、醇类物质、苯丙素类、醌类、单宁类、类萜、留体、生物碱等，其中，植物激素包含生长素、水杨酸、细胞分裂素、赤霉素、类固醇、乙烯、水杨酸、茉莉酸、独脚金内酯、多肽类激素、油菜素内酯。
[0017]本发明一种三七内生真菌枝顶孢霉在促进三七根系发育、三七小苗及种子根系发育上的应用。
[0018]本发明相对于现有技术具有以下优点:
[0019]1、本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉，可以促进三七小苗及种子的根系发育，对三七的大面积种植及提高三七产量具有巨大帮助。
[0020]2、本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法过程简单，操作方便，所需试剂经济有效，可以用于大量提取这种有益的三七内生真菌枝顶孢霉。
[0021]3、本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法所用三七材料单一，容易获取，可以在不损害三七产量的情况下分离内生真菌。
[0022]4、本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉的应用，可缩短三七的出苗时间，节约大量的人力成本、减少农药化肥的使用，具有重要的经济价值。
【附图说明】
[0023]图1为三七内生真菌枝顶孢霉扩增后的核糖体DNA序列；
[0024]图2为三七内生真菌枝顶孢霉的菌丝及孢子形态；
[0025]图3为三七内生真菌枝顶孢霉促进效果图一；
[0026]图4为三七内生真菌枝顶孢霉促进效果图二；
[0027]图5为三七内生真菌枝顶孢霉促进效果图三。
【具体实施方式】
[0028]以下结合具体实施例，对本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法及其应用做进一步的详细说明。
[0029]本发明的一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备:
[0030]从三七块根上切下休眠芽，用清水洗净表面后，再用70 %乙醇浸泡1.5分钟，用无菌水清洗3遍;把休眠芽放入含有10%次氯酸钠溶液中，表面消毒10分钟，接着用无菌水冲洗3遍;再把休眠芽放入到含有MS培养基的锥形瓶中，光照培养I个月后，菌丝长出。在光学显微镜下挑取单个孢子，并培养于PDA培养基中。
[0031 ] 菌落直径长到4厘米时，挑取一部分菌丝及孢子进行形态观察；收集菌丝，通过CTAB的方法提取基因组DNA，用ITSl (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)和ITS4(5TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ’)引物进行PCR扩增，扩增反应程序:
[0032]1、95Γ预变性4分钟；
[0033]2、95°C 变性 I 分钟；
[0034]3、55 °C 退火 30 秒；
[0035]4、72 Γ 延伸 45 秒；
[0036]5、重复2-4步反应30个循环；
[0037]6、72Γ 延伸 10 分钟。
[0038]反应完成后，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。PCR产物纯化后，送到生物技术公司用ITSl及ITS4引物测序所克隆到核糖体DNA的序列。在NCBI数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中，把枝顶孢霉核糖体DNA的测序结果登录GeneBank进行BLAST比对后，所扩增得到的序列同NCBI数据库中已知枝顶孢属序列的最大相似性为93.7%，扩增后的DNA序列如图1所不。
[0039]如图2所示，该枝顶孢霉的形态特征如下:
[0040]1、营养菌丝无明显增厚，匍匐生长，分枝，具隔膜。
[0041]2、分生孢子梗细长、直立，无色，无分枝，分生孢子梗基部大部分不具分隔，分生孢子梗瓶梗型。
[0042]3、分生孢子生长在分生孢子梗的顶端。
[0043]4、分生孢子椭圆形，无色，单孢，分生孢子长宽比:1.73-2.14。
[0044]5、分生孢子大小:2.60 ?4.82X1.33 ?2.58μπι。
[0045]经过对菌丝及孢子的形态鉴定，并结合对所得核糖体DNA的序列鉴定，所得到的内生真菌属于枝顶孢霉，是一个新发现的种，命名为Acremonium yunnanensis Y.L.DuMHYAU30001o
[0046]该枝顶孢霉可以促进三七的萌发及根系的发育，具体操作方法如下:
[0047]把三七种子去皮、洗净、晾干后，放入含有珍珠岩及石英砂的育苗基质中，把含有菌丝浓度OD6qq为0.2-0.3的菌丝水溶液浇灌三七种子，每隔15-20天浇灌一次，重复两次。对照为用水浇灌的三七种子。经菌丝水溶液处理的三七种子在种子萌发及根系生长上均优于用水浇灌的种子。
[0048]所产生的效果如图3，图4和图5所示。
[0049]将三七种子种于含有石英沙和珍珠岩的基质中，分别经水(A)及枝顶孢霉(B)处理后，三七种子的萌发率分别为17.33% (水)、29.33% (枝顶孢霉)，枝顶孢霉促进了三七小苗及种子的根系发育。
[0050]利用新分离到的枝顶孢霉处理三七，有效促进了三七种子萌发及根系发育，可明显促进三七生长，降低了人力成本，减少了农药化肥的使用，保护了生态环境。
[0051]本发明的三七内生真菌枝顶孢霉的遗传物质以及次生代谢产物也可以应用到植物发育、抗病及根系发育上，其中，遗传物质包括DNA、RNA、蛋白质、小RNA，小RNA包含microRNA;其中，次生代谢产物包括植物激素(如生长素、水杨酸、细胞分裂素、赤霉素、类固醇、乙烯、水杨酸、茉莉酸、独脚金内酯、多肽类激素、油菜素内酯等)、酚类物质、酮类物质、醇类物质、苯丙素类、醌类、单宁类、类萜、留体、生物碱等。
[0052]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种三七内生真菌枝顶孢霉，其特征在于，是将三七块根上的休眠芽切下，经过清洗、消毒、培养、分离后得到的内生真菌枝顶孢霉。2.如权利要求1所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉，其特征在于，所述内生真菌枝顶孢霉的核糖体DNA序列为: TCCGTAGGGTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTGTAAAAACTCCCAAACCATTGTGAACCTACCACTGTTGCTTCGGCGGCCTCGCCCCGGGCGCGTTCGCGCGGCCCGGACCCAGGCGTCCGCCGGAGGCTCCAAACTCTTGTCTTTTAGTGTATTTCTGAGTGGCATAAGCAAATAAATCAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGACCCGTTCGCGGGACCTGGCGTTGGGGATCAGCCTGCCCCTGGCGGCGGCTGGCCCTGAAATCCAGTGGCGGTTCCCTCGCGAACTCCTCCGTGCAGTAATTAAACCTCTCGCGGCAGGATAGCGGTTGAACCACGCCGTTAAACCCCCCACTTCTCAAGGTTGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAGGCCGGAGGAo3.如权利要求1或2所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法，其特征在于，步骤如下: 首先，从三七块根上切下休眠芽，用水清洗表面，再用乙醇浸泡I?2分钟，最后用无菌水清洗2?4遍； 其次，将所述休眠芽放入次氯酸钠溶液中，消毒8?12分钟，再用无菌水冲洗2?4遍； 最后，将所述休眠芽放到含有MS培养基的容器中，光照培养25?35天后即得三七内生真菌枝顶孢霉。4.如权利要求3所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法，其特征在于，所述乙醇浓度为70 %。5.如权利要求3所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉的制备方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液的浓度为10%。6.如权利要求1或2所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉在促进植物发育及种子根系发育上的应用。7.如权利要求1或2所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉其遗传物质及次生代谢产物在植物发育、抗病及根系发育上的应用。8.如权利要求1或2所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉在促进三七根系发育、三七小苗及种子根系发育上的应用。9.如权利要求6所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉的应用，所述植物包括人参、水稻、玉米、小麦、重楼、马铃薯。10.如权利要求7所述的一种三七内生真菌枝顶孢霉的应用，所述遗传物质包括DNA、RNA、蛋白质、小RNA，其中，小RNA包含mi croRNA ；所述次生代谢产物包括植物激素、酚类物质、酮类物质、醇类物质、苯丙素类、醌类、单宁类、类萜、留体、生物碱等，其中，植物激素包含生长素、水杨酸、细胞分裂素、赤霉素、类固醇、乙烯、水杨酸、茉莉酸、独脚金内酯、多肽类激素、油菜素内酯。
【文档编号】A01N63/04GK105907648SQ201610318707
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】杜云龙
【申请人】杜云龙