一种米曲霉菌株ysy035和富硒米曲霉的分离筛选方法及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035和富硒米曲霉的分离筛选方法及其应用，所述米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035于2016年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.12378；通过对米曲霉菌株进行分离、纯化、初筛和复筛，获得了富硒米曲霉；再对其进行规模化生产，获得了硒含量在8.0?11.0mg/g，有机硒含量在7.0?10.5mg/g的富硒产品。将本发明提供的富含有机硒的米曲霉替代普通米曲霉作为食品和保健品的添加剂，可进行持续补硒，有效防治因缺硒引起的疾病。CGMCC No.1237820160511
【专利说明】
一种米曲霉菌株YSY035和富砸米曲霉的分禹筛选方法及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及食品添加剂技术领域，尤其涉及一种米曲霉菌株YSY035和富砸米曲霉的分离筛选方法及其应用。
【背景技术】
[0002]砸作为人和动物必需的微量元素，具有多种生物学功能，如参与多种酶促反应，促进代谢过程中有毒过氧化物的分解，增强机体免疫力，抑制体内有毒物质的吸收，以及抗癌等作用。世界卫生组织建议并建议人体每天补充200yg的砸，但是，中国普遍存在砸摄入不足及不均衡，缺砸的现象比较普遍，全国22个省市约2/3的地区缺砸。砸的缺乏可引起多种疾病，常见的有克山病，大骨节病及缺血性心脏病等等。由于天然食品中的砸含量一般都比较低，仅靠天然食品来补充砸不能满足人体对砸的需求。
[0003]在自然界中砸以无机砸和有机砸两种形式存在。无论是哪种形式的砸都可参与肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶的合成。两种砸对砸缺乏而引起的种种疾病都有预防和治疗作用。但是有机砸较无机砸毒性小。吸收率更高。
[0004]如今，人们已经发现很多种生产有机砸的方法。如动物转化法、植物转化法以及微生物转化法，其中利用微生物进行砸的转化可以不受季节、气候的影响，且生产周期短，商业化生产优势更为显著。研究较多的富砸微生物主要有富砸酵母，但是，富砸酵母具有富砸效率低，投资额度大，生产成本较高等缺点，故很少能大规模生产。
[0005]米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。作为一种重要的工业真菌，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了 1000多年。并且已经被证明了是一种优秀的富砸载体，相较于其它富砸微生物的产率低及生产成本高等特点，米曲霉易于培养，对培养基的要求低，富砸的效率高。CNl 632128A提供了一种米曲霉有机砸制备方法，但其富砸量较低，并且发酵方法介绍较少。
【发明内容】
[0006]鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035和富砸米曲霉的分离筛选方法及其应用。
[0007]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]第一方面，本发明提供了一种米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏日期为2016年5月11日，保藏编号为CGMCC N0.12378，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0009]米曲霉菌株(Aspergillusoryzae)YSY035，保藏编号为CGMCC N0.12378，其形态学特征为菌落初呈白色、黄色后呈黄褐色或绿褐色，背面无色。用显微镜观察，菌丝发达，多分枝，有隔膜，菌丝顶端直接产生孢子梗，分生孢子串生。
[0010]以上形态特征与《真菌鉴定手册》中米曲霉的形态特征相符合；其分子生物学特征，以YSYO 35基因组为模板，PCR扩增到18 S rDNA特异性片段，经过测序，所得序列通过Blast与GeneBank中核酸数据进行分析比对，鉴定为米曲霉(Aspergi I Ius oryzae)。
[0011]米曲霉菌株(Aspergillusoryzae)YSY035，包含所述米曲霉菌株(AspergillusoryZae)YSY035和/或其代谢产物，并以其为活性成分的微生物制剂也属于本发明的保护范围。
[0012]第二方面，本发明还提供了一种富砸米曲霉的分离筛选方法，包括如下步骤:
[0013](I)菌种分离；
[0014](2)菌种纯化；
[0015](3)富砸米曲霉初筛:将得到的纯种米曲霉点种于亚砸酸含量为0.1-0.5mg/mL的亚砸酸钠抗性平板中观察菌落生长状况，当菌株变成红色时，初筛得到具有富砸能力的米曲霉；
[0016](4)富砸米曲霉复筛:将初筛得到的米曲霉菌株接种到马铃薯液体培养基中摇瓶培养3-4d，然后测定该富砸米曲霉的砸含量，筛选得到有机砸含量在2.0-5.0mg/g的富砸米曲霉。
[0017]目前对于富砸米曲霉的筛选，通常是采用富砸酵母的间接分离方法，而本发明则是直接利用米曲霉菌株进行富砸米曲霉的筛选，并筛选得到了有机砸含量在2.0-5.0mg/g的富砸米曲霉。
[0018]根据本发明，步骤(I)所述菌种分离是将收集到的样品利用无菌水进行稀释，再将其加入到马丁氏培养基平板中进行涂布。具体地，例如可将收集到的各种酱曲、酒曲样品加入到无菌水中充分混匀、进行梯度稀释，然后吸取适量稀释后的样品加入到马丁氏培养基平板中进行涂布。
[0019]根据本发明，步骤(2)所述菌种纯化是将步骤(I)分离的单菌落接种于马丁氏培养基斜面中进行划线保存，25-28°C培养3-4d，直至得到纯种丝状真菌；在25-28°C培养3-4d后，可以向斜面中加入无菌水进行梯度稀释、涂布，观察菌落状态是否为同种微生物，如果不纯应继续进行纯化直至得到纯种丝状真菌，即菌落形态完全一致。
[0020]根据本发明，步骤(I)和步骤(2)所述马丁氏培养基的组成为:ΚΗ2Ρ04 lg,MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然;临用时每10mL培养基中加I %链霉素液0.3mL。
[0021]根据本发明，步骤(4)所述富砸米曲霉复筛中，马铃薯液体培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20-30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到100mL，加入葡萄糖20g。
[0022]根据本发明，步骤(4)所述砸含量的测定采用分光光度计法进行;所述分光光度计法是采用邻苯二胺为显色剂检测样品中的总砸含量和无机砸含量，通过差减法获得有机砸含量;具体地，采用分光光度计法测砸，称取0.1g样品消解24h，调节pH至中性，利用邻苯二胺的显色检测样品中砸含量，测定总砸和无机砸，通过差减法获得有机砸含量。
[0023 ]示例性地，本发明所述富砸米曲霉的分离筛选方法，可以包括如下步骤:
[0024](I)菌种分离:将收集到的各种酱曲和/或酒曲样品加入到无菌水中充分混匀，进行梯度稀释，然后吸取稀释样品加入到马丁氏培养基平板中进行涂布；
[0025]所述马丁氏培养基的组成为:ΚΗ2Ρ04 lg,MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0026](2)菌种纯化:将马丁氏培养基平板中长出的单菌落接种于马丁氏培养基斜面中进行划线保存，25°C培养3-4d，向斜面中加入无菌水进行梯度稀释，涂布，观察菌落状态是否为同种微生物，如果不纯继续进行纯化直至得到纯种丝状真菌；
[0027]所述马丁氏培养基的组成为:ΚΗ2Ρ04 lg,MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0028](3)富砸米曲霉初筛:将得到的纯种米曲霉点种于亚砸酸含量为0.1-0.5mg/mL的亚砸酸钠抗性平板中观察菌落生长状况，当菌株变成红色时，初筛得到具有富砸能力的米曲霉；
[0029](4)富砸米曲霉复筛:采用摇瓶培养法，将初筛得到米曲霉菌株接种到马铃薯液体培养基中摇瓶培养3-4d进行复筛，摇瓶中的马铃薯液体培养基为添加亚砸酸钠的马铃薯液体培养基；
[0030]所述添加亚砸酸钠的马铃薯液体培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20-30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到100mL，加入葡萄糖20g，亚砸酸钠的含量为0.5mg/mL;
[0031]采用分光光度计法测定该富砸米曲霉的砸含量，称取0.1g样品消解24h，调节pH至中性，利用邻苯二胺的显色检测样品中砸含量，测定总砸和无机砸，通过差减法获得有机砸含量在2.0-5.0mg/g的富砸米曲霉。
[0032]第三方面，本发明还提供了采用如第二方面所述富砸米曲霉的分离筛选方法分离筛选得到的富砸米曲霉。
[0033]经上述分离筛选方法得到的富砸米曲霉中富砸能力相对较强的菌株为第一方面所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035，将其培养后干燥制成粉末状产品，其有机砸含量可达到4.7mg/g0
[0034]经上述分离筛选方法得到的富砸米曲霉除了米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035以外，还可得到米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY033、米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY036和米曲霉菌株(AspergiIIus oryzae)YSY032，其有机砸含量均在2.0-5.0mg/g范围内。
[0035]第四方面，本发明还提供了一种提高米曲霉砸含量的方法，包括如下步骤:
[0036](I)将米曲霉菌株接种于察氏培养基，25_28°C培养4-7d，得到斜面孢子；
[0037](2)将斜面孢子接种于PDA培养基中，25_28°C培养4-7d，得到活化的孢子；
[0038](3)收集活化的孢子接种于种子培养基中，培养24_48h，然后以2_10%的接种量转接入发酵培养基中，培养48-72h;所述发酵培养基的组成为:淀粉10-20g/L，蛋白胨2_10g/L，磷酸二氢钾l-2g/L，硫酸镁0.5-lg/L，硫酸铵0.5-lg/L，亚砸酸钠0.1-0.5g/L ；
[0039](4)收集菌体，清洗并干燥。
[0040]根据本发明，步骤(I)所述察氏培养基的组成为:硝酸钠3g，磷酸氢二钾lg，硫酸镁0.58，氯化钾0.58，硫酸亚铁0.018，蔗糖3(^，琼脂158，水10001^，？!1值7.1-7.5。
[0041 ]根据本发明，步骤(2)所述TOA培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20-30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到100mL，加入葡萄糖20g和琼脂15-20go
[0042]根据本发明，步骤(3)所述种子培养基的组成为:葡萄糖10_20g，酵母浸粉l_5g，蛋白胨2-5g，硫酸铵l-2g，磷酸二氢钾l-2g，硫酸镁0.5-lg和水1000mL。
[0043]根据本发明，步骤(3)所述发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾I g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠0.2g/L。
[0044]本发明中通过对发酵培养基的氮源和碳源进行优化，以蛋白胨为主要氮源的培养基米曲霉富砸效果最好，酵母浸粉次之;采用上述组成的发酵培养基，能够大大增加米曲霉的富砸效果，使其培养后干燥制成粉末状产品，砸含量可达到8.0-11.0mg/g，有机砸含量为7.0-10.5mg/g，富砸米曲霉生物量的干重为20-25g/L。
[0045]示例性地，本发明所述提高米曲霉砸含量的方法，具体包括如下步骤:
[0046](I)从黄酒曲中筛选出一株具有富砸米曲霉菌株；
[0047](2)将该米曲霉菌株接种于察氏培养基中，25_28°C培养4-7d，得到斜面孢子，保藏于 4。。；
[0048]所述察氏培养基的组成为:硝酸钠3g，磷酸氢二钾Ig，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.0lg,蔗糖30g，琼脂15g和水100mUpH值7.1-7.5;
[0049](3)将斜面孢子接种于PDA培养基中，25-28°C培养4-7d，得到活化的孢子；
[0050]所述PDA培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20-30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g和琼脂15-20g;
[0051](4)收集活化的孢子并将其先后进行一级液体种子培养和二级液体种子培养，培养24-48h，然后以2-10 %接种量转接入发酵培养基中，培养48-72h ；
[0052]其中，一级液体种子培养用到的培养基为PDA培养基;二级液体液体种子培养基的组成为:葡萄糖10g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.5g和水lOOOmL；
[0053]发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠0.5g/L；
[0054](5)采用离心或者过滤的方法收集菌体，离心转速3000-6000rpm，过滤采用纱布、滤纸或抽滤的方法；
[0055](6)对菌体进行清洗，以除去胞外附着的无机砸，采用的方法是使用缓冲溶液或者生理盐水洗涤，也可采用无菌水洗涤；
[0056](7)采用自然风干、烘干或真空冷冻进行干燥；
[0057](8)将干燥后的菌体粉碎，过筛，采用紫外分光光度法测定其总砸及有机砸的含量。
[0058]第五方面，本发明还提供了一种富砸制剂，所述富砸制剂是由富砸米曲霉制得的，存在形式为干粉;所述富砸制剂中的有机砸含量为7.0-10.5mg/g。其中的富砸米曲霉优选采用如第一方面所述的米曲霉菌株(AspergiIIus oryzae)YSY035，也可以采用如第二方面所述的筛选方法获得的其它富砸米曲霉菌株。
[0059]第六方面，本发明还提供了如第五方面所述富砸制剂的制备方法，包括以下步骤:
[0060](I)将斜面保藏的富砸米曲霉孢子接种于PDA斜面中，25-28°C培养4-7d，进行活化；
[0061 ] (2)将活化的孢子接种于装有PDA的茄子瓶斜面中，25-28°C培养4-7d，进行活化；
[0062](3)收集茄子瓶中的孢子先后进行一级液体种子培养和二级液体种子培养；
[0063](4)将二级种子培养液接种到发酵罐中进行发酵培养；
[0064](5)收集菌体，清洗并干燥。
[0065]根据本发明，步骤(3)中用到的一级液体种子培养基为PDA培养基;二级液体种子培养基的组成为:葡萄糖10g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.5g和水 lOOOmL。
[0066]优选地，步骤(4)所述发酵培养用到的发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠0.5g/L。
[0067]示例性地，所述富砸制剂的制备方法，具体包括以下步骤:
[0068](I)将斜面保藏的富砸米曲霉孢子接种于PDA斜面中28°C培养4d，进行活化；
[0069](2)将活化的孢子接种于装有60mL PDA的茄子瓶斜面中，28°C培养4_7d，进行活化；
[0070](3)收集茄子瓶中孢子进行一级液体种子培养；
[0071 ]所述一级种子培养基的组成为:去皮土豆200g加适量水，加热至沸腾，维持20-30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g和琼脂15-20g;
[0072](4)将一级液体种子培养液接种于二级种子罐中进行二级种子培养；
[0073]所述二级种子培养基的组成为:葡萄糖10g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾Ig，硫酸镁0.5g和水100mL;
[0074](5)将二级种子培养液接种到体积为500-1000L的发酵罐中进行发酵培养，装液量为50?80% (体积)；发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠0.5g/L ；
[0075](6)采用叠片式分离机或者板框过滤对菌体进行收集，洗涤除去胞外砸；
[0076](7)采用烘箱或者冷冻干燥的方法对菌体进行干燥，制成粉末状产品，对产品进行砸含量的测定。
[0077]根据本发明，所述富砸制剂的制备方法中用到的富砸米曲霉优选采用如第一方面所述的米曲霉菌株(AspergiIIus oryzae)YSY035，也可以采用如第二方面所述的筛选方法获得的其它富砸米曲霉菌株。
[0078]第七方面，本发明还提供了如第一方面所述的米曲霉菌株YSY035或第三方面所述的富砸米曲霉或如第五方面所述的富砸制剂在食品或保健品中的应用。
[0079]其中，可以将所述米曲霉菌株或富砸制剂用于果蔬、饮料或保健品中，作为食品和保健品的添加剂，可进行持续补砸，有效防治因缺砸引起的疾病。
[0080]与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果:
[0081 ]本发明提供的米曲霉菌株YSY035菌株以及由本发明提供的富砸米曲霉分离筛选方法中获得的其它富砸米曲霉，其均具有富砸效率高、易于培养和对培养基要求低的特点，在对其培养后干燥制成粉末状产品，砸含量可达到8.0-11.0mg/g，有机砸含量为7.0-10.5mg/g，富砸米曲霉生物量的干重可达到20-25g/L。
【附图说明】
[0082]图1示出了实施例1中不同米曲霉菌株的有机砸含量；
[0083]图2示出了碳源对米曲霉富砸含量的影响；
[0084]图3示出了氮源对米曲霉富砸含量的影响。
[0085]下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
【具体实施方式】
[0086]下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0087]为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下:
[0088]实施例1
[0089]米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035菌种的分离筛选方法与鉴定:
[0090](I)菌株分离:取Ig从食品厂收集到的黄酒曲，放入1mL无菌水中，充分振荡混匀，制备成10—1样品稀释液;然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10—2、10—3、10—4、10一5和10—6不同浓度的孢子悬液，吸取0.2mL不同浓度孢子悬液均匀涂布于马丁氏培养基平板上，于25 °C培养4d，观察并记录菌落生长状况；
[0091]其中，马丁氏培养基的组成为:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0092](2)菌株纯化:将马丁氏培养基平板中长出的单菌落接种于马丁氏培养基斜面中进行划线保存，置于25°C的恒温培养箱中培养3-4d，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时制成临时玻片，用显微镜检查其是否为单一的微生物；
[0093]将斜面培养的菌种依次制备成10—2、10—3、10—4、10—5和10—6不同浓度孢子悬浮液，均匀涂布在马丁氏培养基平板上进行纯化培养，并观察是否为同种微生物，是否为单一微生物，若不纯，则重复分离和纯化全过程，直至获得纯培养的丝状真菌菌株。将纯化后的丝状真菌保存于察氏培养基斜面中，经过形态学及分子学鉴定为米曲霉；
[0094]其中，马丁氏培养基的组成为:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0095](3)菌株筛选:纯化后得至IjS株米曲霉，将此8株米曲霉分别点种于亚砸酸钠抗性平板中观察菌落生长状况，通过预实验得知，有富砸能力的米曲霉富砸后菌株会变成红色，从而筛选得到具有初步富砸能力的米曲霉，结果显示此8株米曲霉均有一定富砸能力，为了进一步验证初筛结果且得到效果最好的富砸米曲霉，本实验采用摇瓶培养法，将初筛得到米曲霉菌株分别接种到摇瓶中进行复筛，摇瓶中的培养基为添加有亚砸酸钠的马铃薯液体培养基，该培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20_30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到100mL，加入葡萄糖20g，亚砸酸钠的含量为0.5mg/mL ；
[0096](4)砸含量测定:采用紫外分光光度计法测砸法，称取0.1g样品消解24h，调节pH至中性，利用邻苯二胺的显色检测样品中总砸含量及有机砸含量。选取其中富砸能力最强的菌株，标记为YSY035 (如图1所示)，其有机砸含量为4.7mg/g。
[0097]该米曲霉(Aspergillus oryzae)YSY035已于2016年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC N0.12378，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0098]实施例2
[0099]米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY033的分离筛选方法:
[0100](I)菌株分离:取Ig从食品厂收集到的酱曲，放入1mL无菌水中，充分振荡混匀，制备成10—1样品稀释液;然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10Λ10—3、10—4、10—5和10—6不同浓度的孢子悬液，吸取0.2mL不同浓度孢子悬液均匀涂布于马丁氏培养基平板上，于25 °C培养6d，观察并记录菌落生长状况；
[0101]其中，马丁氏培养基的组成为:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0102](2)菌株纯化:将马丁氏培养基平板中长出的单菌落接种于马丁氏培养基斜面中进行划线保存，置于25°C的恒温培养箱中培养4d，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时制成临时玻片，用显微镜检查其是否为单一的微生物；
[0103]将斜面培养的菌种依次制备成10—2、10—3、10—4、10—5和10—6不同浓度孢子悬浮液，均匀涂布在马丁氏培养基平板上进行纯化培养，并观察是否为同种微生物，是否为单一微生物，若不纯，则重复分离和纯化全过程，直至获得纯培养的丝状真菌菌株。将纯化后的丝状真菌保存于察氏培养基斜面中，经过形态学及分子学鉴定为米曲霉；
[0104]其中，马丁氏培养基的组成为:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0105](3)菌株筛选:将纯化后得到的米曲霉菌株点种于亚砸酸钠抗性平板中观察菌落生长状况，通过预实验得知，有富砸能力的米曲霉富砸后菌株会变成红色，从而筛选得到具有初步富砸能力的米曲霉，结果显示纯化后得到的米曲霉均有一定富砸能力，然后采用摇瓶培养法，将初筛得到米曲霉菌株接种到摇瓶中进行复筛，摇瓶中的培养基为添加有亚砸酸钠的马铃薯液体培养基，该培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20min，4层纱布过滤，滤液补充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g，亚砸酸钠的含量为
0.5mg/mL；
[0106](4)砸含量测定:采用紫外分光光度计法测砸法，称取0.1g样品消解24h，调节pH至中性，利用邻苯二胺的显色检测样品中总砸含量及有机砸含量，得到一株富砸米曲霉菌株，标记为YSY033，其有机砸含量为3.0mg/g。
[0107]实施例3
[0108]米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY036的分离筛选方法:
[0109](I)菌株分离:取Ig从食品厂收集到的酱曲和酱油曲，放入1mL无菌水中，充分振荡混匀，制备成10—1样品稀释液;然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10—2、10一3、10—4、10—5和10—6不同浓度的孢子悬液，吸取0.2mL不同浓度孢子悬液均匀涂布于马丁氏培养基平板上，于26 °C培养4d，观察并记录菌落生长状况；
[0110]其中，马丁氏培养基的组成为:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0111](2)菌株纯化:将马丁氏培养基平板中长出的单菌落接种于马丁氏培养基斜面中进行划线保存，置于25°C的恒温培养箱中培养6d，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时制成临时玻片，用显微镜检查其是否为单一的微生物；
[0112]将斜面培养的菌种依次制备成10—2、10—3、10—4、10—5和10—6不同浓度孢子悬浮液，均匀涂布在马丁氏培养基平板上进行纯化培养，并观察是否为同种微生物，是否为单一微生物，若不纯，则重复分离和纯化全过程，直至获得纯培养的丝状真菌菌株。将纯化后的丝状真菌保存于察氏培养基斜面中，经过形态学及分子学鉴定为米曲霉；
[0113]其中，马丁氏培养基的组成为:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0114](3)菌株筛选:将纯化后得到的米曲霉菌株点种于亚砸酸钠抗性平板中观察菌落生长状况，通过预实验得知，有富砸能力的米曲霉富砸后菌株会变成红色，从而筛选得到具有初步富砸能力的米曲霉，结果显示纯化后得到的米曲霉均有一定富砸能力，然后采用摇瓶培养法，将初筛得到米曲霉菌株接种到摇瓶中进行复筛，摇瓶中的培养基为添加有亚砸酸钠的马铃薯液体培养基，该培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持28min，4层纱布过滤，滤液补充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g，亚砸酸钠的含量为
0.5mg/mL；
[0115](4)砸含量测定:采用紫外分光光度计法测砸法，称取0.1g样品消解24h，调节pH至中性，利用邻苯二胺的显色检测样品中总砸含量及有机砸含量，得到一株富砸米曲霉菌株，标记为YSY036，其有机砸含量为2.9mg/g。
[0116]实施例4
[0117]米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY032的分离筛选方法:
[0118](I)菌株分离:取Ig从食品厂收集到的酱油曲，放入1mL无菌水中，充分振荡混匀，制备成10—1样品稀释液;然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10—2、10—3、10—4、10一5和10—6不同浓度的孢子悬液，吸取0.2mL不同浓度孢子悬液均匀涂布于马丁氏培养基平板上，于26 0C培养4d，观察并记录菌落生长状况；
[0119]其中，马丁氏培养基的组成为:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0120](2)菌株纯化:将马丁氏培养基平板中长出的单菌落接种于马丁氏培养基斜面中进行划线保存，置于25°C的恒温培养箱中培养6d，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时制成临时玻片，用显微镜检查其是否为单一的微生物；
[0121]将斜面培养的菌种依次制备成10—2、10—3、10—4、10—5和10—6不同浓度孢子悬浮液，均匀涂布在马丁氏培养基平板上进行纯化培养，并观察是否为同种微生物，是否为单一微生物，若不纯，则重复分离和纯化全过程，直至获得纯培养的丝状真菌菌株。将纯化后的丝状真菌保存于察氏培养基斜面中，经过形态学及分子学鉴定为米曲霉；
[0122]其中，马丁氏培养基的组成为:KH2PO4 lg，MgS04.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每10mL培养基中加1%链霉素液0.3mL;
[0123](3)菌株筛选:将纯化后得到的米曲霉菌株点种于亚砸酸钠抗性平板中观察菌落生长状况，通过预实验得知，有富砸能力的米曲霉富砸后菌株会变成红色，从而筛选得到具有初步富砸能力的米曲霉，结果显示纯化后得到的米曲霉均有一定富砸能力，然后采用摇瓶培养法，将初筛得到米曲霉菌株接种到摇瓶中进行复筛，摇瓶中的培养基为添加有亚砸酸钠的马铃薯液体培养基，该培养基的组成为:去皮土豆200g加100mL水，加热至沸腾，维持25min，4层纱布过滤，滤液补充水分到lOOOmL，加入葡萄糖20g，亚砸酸钠的含量为0.5mg/mL；
[0124](4)砸含量测定:采用紫外分光光度计法测砸法，称取0.1g样品消解24h，调节pH至中性，利用邻苯二胺的显色检测样品中总砸含量及有机砸含量，得到一株富砸米曲霉菌株，标记为YSY032，其有机砸含量为2.lmg/g。
[0125]实施例5
[0126]富砸米曲霉发酵培养基的优化:
[0127](I)菌种:采用实施例1筛选出的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY035。
[0128](2)将该米曲霉菌株接种于察氏培养基中，28°C培养4d，得到斜面孢子，再将该斜面孢子接种于PDA培养基中，28 °C培养4d，得到活化的孢子。
[0129]其中，察氏培养基的组成为:硝酸钠3g，磷酸氢二钾Ig，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.0lg，蔗糖30g，琼脂15g，水1000mL，pH值7.1-7.5;PDA培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20_30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到100mL，加入葡萄糖20g和琼脂15-20g。
[0130](3)收集活化的孢子接种于种子培养基中，培养24h，然后以2%接种量转接入发酵培养基中，培养48h。
[0131]其中，种子培养基的组成为:葡萄糖10_20g，酵母浸粉l_5g，蛋白胨2_5g，硫酸铵1-2g，磷酸二氢钾l_2g，硫酸镁0.5-lg和水1000mL。
[0132](4)考察碳源对富砸米曲霉产量及富砸能力的影响
[0133]基础发酵培养基A:蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L，亚砸酸钠0.2g/L。
[0134]分别加入葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、淀粉(浓度为20g/L)28 V培养4d，收集菌体进行清洗、干燥、粉碎，测定其总砸及有机砸含量。结果表明:该富砸米曲霉在以浓度为20g/L的淀粉作为主要碳源的培养基中的富砸效果最好，果糖次之(如图2所示)。
[0135](5)考察氮源对富砸米曲霉产量及富砸能力的影响
[0136]基础发酵培养基A:淀粉20g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L，亚砸酸钠0.2g/L。
[0137]分别加入酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏(浓度为2g/L)28°C培养4d，收集菌体用无菌水进行清洗、干燥、粉碎，测定其总砸及有机砸含量。结果表明:该富砸米曲霉在以浓度为2g/L的蛋白胨作为主要氮源的培养基中的富砸效果最好，酵母浸粉次之(如图3所示)。
[0138](6)经过碳源、氮源以及接种量、pH、温度、培养时间等条件优化，富砸米曲霉最佳的富砸配方为:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾I g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠0.2g/L。也就是说，通过采用该培养的发酵培养基，能够提高富砸米曲霉的砸含量。
[0139]实施例6
[0140]—种提高米曲霉砸含量的方法，包括如下步骤:
[0141 ] (I)菌种:采用实施例2筛选出的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)YSY033。
[0142](2)将该米曲霉菌株接种于察氏培养基中，28°C培养4d，得到斜面孢子，再将该斜面孢子接种于PDA培养基中，28 °C培养4d，得到活化的孢子。
[0143]其中，察氏培养基的组成为:硝酸钠3g，磷酸氢二钾Ig，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.0lg，蔗糖30g，琼脂15g，水1000mL，pH值7.1-7.5;PDA培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20_30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到100mL，加入葡萄糖20g和琼脂15-20g。
[0144](3)收集活化的孢子接种于种子培养基中，培养24h，然后以2%接种量转接入发酵培养基中，培养48h。
[0145]其中，种子培养基的组成为:葡萄糖10_20g，酵母浸粉l_5g，蛋白胨2_5g，硫酸铵1-2g，磷酸二氢钾l_2g，硫酸镁0.5-lg和水100mL;发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠0.2g/L。
[0146](4)收集菌体，清洗并干燥。
[0147]实施例7
[0148]一种富砸干粉的制备方法，包括以下步骤:
[0149](I)将斜面保藏的富砸米曲霉菌株(Aspergi I Ius oryzae)YSY035的孢子接种于PDA斜面中，28 °C培养4d，进行活化；
[0150](2)将活化的孢子接种于装有60mL PDA的茄子瓶斜面中，28°C培养7d，进行活化；
[0151](3)收集茄子瓶中的孢子先后进行一级液体种子培养和二级液体种子培养;该步骤中用到的一级液体种子培养基为roA培养基;二级液体种子培养基的组成为:葡萄糖1g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸钱2g，磷酸二氢钾Ig，硫酸镁0.5g和水lOOOmL。
[0152](4)将二级种子培养液接种到1000L的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠
0.2g/L；
[0153](5)采用叠片式分离机或者板框过滤对菌体进行收集，洗涤除去胞外砸；
[0154](6)采用烘箱或者冷冻干燥的方法对菌体进行干燥，制成粉末状产品，对产品进行砸含量的测定，其砸含量在11.0mg/g，有机砸含量为10.5mg/g。
[0155]实施例8
[0156]一种富砸干粉的制备方法，包括以下步骤:
[0157](I)将斜面保藏的富砸米曲霉菌株(Aspergi I Ius oryzae)YSY033的孢子接种于PDA斜面中，28 °C培养4d，进行活化；
[0158](2)将活化的孢子接种于装有60mL PDA的茄子瓶斜面中，28°C培养7d，进行活化；
[0159](3)收集茄子瓶中的孢子先后进行一级液体种子培养和二级液体种子培养;该步骤中用到的一级液体种子培养基为TOA培养基;二级液体种子培养基的组成为:葡萄糖1g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸钱2g，磷酸二氢钾Ig，硫酸镁0.5g和水lOOOmL。
[0160](4)将二级种子培养液接种到1000L的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠
0.2g/L；
[0161](5)采用叠片式分离机或者板框过滤对菌体进行收集，洗涤除去胞外砸；
[0162](6)采用烘箱或者冷冻干燥的方法对菌体进行干燥，制成粉末状产品，对产品进行砸含量的测定，其砸含量在9.lmg/g，其有机砸含量为8.5mg/go
[0163]实施例9
[0164]—种富砸干粉的制备方法，包括以下步骤:
[0165](I)将斜面保藏的富砸米曲霉菌株(Aspergi I Ius oryzae )YSY032的孢子接种于PDA斜面中，28 °C培养4d，进行活化；
[0166](2)将活化的孢子接种于装有60mL PDA的茄子瓶斜面中，28°C培养7d，进行活化；
[0167](3)收集茄子瓶中的孢子先后进行一级液体种子培养和二级液体种子培养;该步骤中用到的一级液体种子培养基为TOA培养基;二级液体种子培养基的组成为:葡萄糖1g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸钱2g，磷酸二氢钾Ig，硫酸镁0.5g和水lOOOmL。
[0168](4)将二级种子培养液接种到1000L的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠
0.2g/L；
[0169](5)采用叠片式分离机或者板框过滤对菌体进行收集，洗涤除去胞外砸；
[0170](6)采用烘箱或者冷冻干燥的方法对菌体进行干燥，制成粉末状产品，对产品进行砸含量的测定，其砸含量在8.2mg/g，有机砸含量为7.lmg/g ο
[0171]实施例10
[0172]将实施例7-9制得的富砸干粉添加到面粉中，其添加量为20-30mg/kg，可以做成砸含量在200-300yg/kg的蛋挞、蝴蝶酥、老婆饼等富砸糕点，达到增强砸的营养强化的目的。
[0173]另外，还可将上述制得的富砸干粉添加到果蔬、饮料或保健品中，同样能够达到增强砸的营养强化的目的。
[0174]通过上述实施例可以看出，本发明提供的米曲霉菌株YSY035菌株以及由本发明提供的富砸米曲霉分离筛选方法中获得的其它富砸米曲霉，其均具有富砸效率高、易于培养和对培养基要求低的特点，在对其培养后干燥制成粉末状产品，砸含量可达到8.0-11.0mg/g，有机砸含量为7.0-10.5mg/g，富砸米曲霉生物量的干重可达到20-25g/L，其在果蔬、饮料、糕点或保健品中，均能够达到增强砸的营养强化的目的。
[0175]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0176]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0177]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0178]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1.一种米曲霉菌株(Aspergillusoryzae)YSY035，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年5月11日，保藏编号为CGMCC N0.12378。2.—种富砸米曲霉的分离筛选方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)菌种分离； (2)菌种纯化; (3)富砸米曲霉初筛:将得到的纯种米曲霉点种于亚砸酸含量为0.1-0.5mg/mL的亚砸酸钠抗性平板中观察菌落生长状况，当菌株变成红色时，初筛得到具有富砸能力的米曲霉菌株； (4)富砸米曲霉复筛:将初筛得到的米曲霉菌株接种到马铃薯液体培养基中摇瓶培养3-4d，然后测定该富砸米曲霉的砸含量，筛选得到有机砸含量在2.0-5.0mg/g的富砸米曲霉O3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述菌种分离是将收集到的样品利用无菌水进行稀释，再将其加入到马丁氏培养基平板中进行涂布； 优选地，步骤(2)所述菌种纯化是将步骤(I)分离的单菌落用无菌接种环挑取置于无菌水中稀释，接种于马丁氏培养基进行单菌落培养，25-28°C培养3-4d，反复多次直至平皿中菌落形态一致，得到纯种丝状真菌； 优选地，步骤(I)和步骤(2)所述马丁氏培养基的组成为:ΚΗ2Ρ04 lg,MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖1g，I %孟加拉红水溶液3.3mL，琼脂15_20g，水100mL，pH值自然；临用时每I OOmL培养基中加I %链霉素液0.3mL。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述富砸米曲霉复筛中，马铃薯液体培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1000mL水，加热至沸腾，维持20-30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到100mL，加入葡萄糖20g，亚砸酸钠的含量为0.5mg/mL; 优选地，步骤(4)所述砸含量的测定采用分光光度计法进行； 优选地，所述分光光度计法是采用邻苯二胺为显色剂检测样品中的总砸含量和无机砸含量，通过差减法获得有机砸含量。5.根据权利要求2-4之一所述的富砸米曲霉的分离筛选方法分离筛选得到的富砸米曲霉O6.一种提高米曲霉砸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将米曲霉菌株接种于察氏培养基中，25-28°C培养4-7d，得到斜面孢子； (2)将斜面孢子接种于PDA培养基中，25-28°C培养4_7d，得到活化的孢子； (3)收集活化的孢子接种于种子培养基中，培养24-48h，然后以2-10%的接种量转接入发酵培养基中，培养48-72h;所述发酵培养基的组成为:淀粉10-20g/L，蛋白胨2_10g/L，磷酸二氢钾l_2g/L，硫酸镁0.5-lg/L，硫酸铵0.5-lg/L和亚砸酸钠0.1-0.5g/L ； (4)收集菌体，清洗并干燥。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述察氏培养基的组成为:硝酸钠3g，磷酸氢二钾Ig，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.0lg,鹿糖30g，琼脂15g，水100mL，pH值7.1-7.5; 优选地，步骤(2)所述PDA培养基的组成为:去皮土豆200g加500-1OOOmL水，加热至沸腾，维持20-30min，4层纱布过滤，滤液补充水分到100mL，加入葡萄糖20g和琼脂15_20g; 优选地，步骤(3)所述种子培养基的组成为:葡萄糖10-20g，酵母浸粉l-5g，蛋白胨2-5g，硫酸铵l_2g，磷酸二氢钾l-2g，硫酸镁0.5-lg和水100mL; 优选地，步骤(3)所述发酵培养基的组成为:淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.5g/L和亚砸酸钠0.2g/L。8.—种富砸制剂，其特征在于，所述富砸制剂是由富砸米曲霉制得的，存在形式为干粉;所述富砸制剂中的有机砸含量为7.0-10.5mg/go9.根据权利要求8所述富砸制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将斜面保藏的富砸米曲霉孢子接种于PDA斜面中，25-28°C培养4-7d，进行活化； (2)将活化的孢子接种于装有PDA的茄子瓶斜面中，25-28°C培养4-7d，进行活化； (3)收集前子瓶中的孢子先后进行一级液体种子培养和二级液体种子培养； (4)将二级种子培养液接种到发酵罐中进行发酵培养； (5)收集菌体，清洗并干燥； 优选地，步骤(3)中用到的一级液体种子培养基为PDA培养基;二级液体种子培养基的组成为:葡萄糖10g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.5g和水100mL。10.如权利要求1所述的米曲霉菌株YSY035或权利要求5所述的富砸米曲霉或如权利要求8所述的富砸制剂在食品或保健品中的应用。
【文档编号】C12N1/14GK105907652SQ201610510932
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】于赞, 毛亮
【申请人】北京源生元科技发展有限公司