一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法
【专利摘要】本发明提供一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，包括以下步骤：取枯草芽胞杆菌菌落接入摇瓶培养；配制种子发酵培养基，其中种子发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7；将摇瓶种子液接入种子发酵培养基中发酵，培养8～13小时，得到种子罐菌液；配制液体发酵培养基，其中液体发酵培养基的初始的pH值为6.5～7.7；将种子罐菌液无菌转入液体发酵培养基中，培养22～31小时，放罐，得到枯草芽胞杆菌高密度发酵液。本发明的目的是提供一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，该方法生产的枯草芽胞杆菌活菌数多、芽孢形成率高、简便经济，适用于枯草芽胞杆菌的工业化规模发酵。
【专利说明】
一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法
技术领域
[0001]本发明涉及微生物发酵工程领域，特别涉及一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法。
【背景技术】
[0002]枯草芽胞杆菌是一类广泛存在的可产生芽孢的革兰氏阳性细菌，生长迅速，代谢旺盛，可产生脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等多种代谢产物，对人畜无害，不污染环境，在饲料、畜牧行业应用广泛。有些枯草芽胞杆菌还具有纤维素和半纤维素水解活性，可有效降解农作物秸杆和畜禽粪便，是有机物料腐熟剂的重要菌种来源。随着现代生活质量的提高和人们环保意识的增强，对绿色健康食品的需求越来越大，由于化学农药和化学肥料大量使用所带来的农药残留、环境污染等问题，使得生物防治在植物病害防控中的作用越来越突出。枯草芽胞杆菌可产生多种高效广谱抗生素，是植物病害防治中使用最广泛的微生物种群之一，与其他芽胞杆菌一起占据着全世界商业化应用的生物农药市场的二分之一。
[0003]芽孢具有极强抗逆性、可抵抗高温、干旱、紫外线和有机溶剂等多种不良环境，使之在后续加工机械化生产及高温干燥的过程中，可以保证微生物制剂的活性，提高产品质量和贮存期。由于芽孢不是细菌生活史中不可缺少的部分，只是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆性休眠体，因此芽孢形成受很多因素影响，培养基所含碳源、氮源、无机盐的种类和配比，发酵参数如pH、温度、溶氧、发酵时间等都对芽孢形成具有重要作用，根据不同菌株，需要通过实验寻求最佳的适宜于芽孢形成的培养基配方并制定合理有效的发酵生产工艺。
[0004]发酵液所含的有效活菌数是微生物制剂的重要生产指标，一方面关系到生产成本，另一方面也与制剂发挥功效直接相关。微生物制剂商业应用的关键在于目标微生物的高效生产，目前关于枯草芽胞杆菌发酵，大多是在实验室摇瓶条件下进行，大规模工业化发酵生产研究较少，且存在有效菌数少或芽孢形成率低、发酵周期长、生产成本高等问题。
【发明内容】
[0005]本发明旨在解决上面描述的问题。本发明的目的是提供一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，该方法生产的枯草芽胞杆菌活菌数多、芽孢形成率高、简便经济，适用于枯草芽胞杆菌的工业化规模发酵。
[0006]具体包括以下步骤:
[0007](I)取枯草芽胞杆菌菌落接入摇瓶培养，制成摇瓶种子液。
[0008](2)在种子发酵罐中配制种子发酵培养基，其中种子发酵培养基的初始的pH值为6.5?7.7。
[0009](3)将摇瓶种子液接入种子发酵培养基中发酵，其中，接种体积百分比为0.3?0.6%,发酵温度为30?35°C，种子发酵罐转速为180?200转/分，通气量为1: 0.3?1: 0.6，罐压为0.02?0.081^?，培养8?13小时，得到种子罐菌液。
[0010](4)在液体发酵罐中配制液体发酵培养基，其中液体发酵培养基的初始的pH值为6.5?7.7。
[0011](5)将种子罐菌液无菌转入液体发酵培养基中，其中，接种体积百分比为8?12%，发酵温度为30?35°C，液体发酵罐转速为150?175转/分，通气量为1:0.3?1:1.8，罐压为0.02?0.08Mpa，培养22?31小时，放罐，得到枯草芽胞杆菌高密度发酵液。
[0012]其中，步骤(3)包括:
[0013]接种体积百分比为0.5%，发酵温度为32°C，种子发酵罐转速为200转/分，通气量为1:0.5，罐压为0.03?0.06Mpa，培养9?12小时。
[0014]步骤(5)包括:
[0015]接种体积百分比为10%，发酵温度为32?35°C，液体发酵罐转速为170转/分，通气量为1: 0.5?1:1.5，罐压为0.03?0.06Mpa，培养25?30小时。
[0016]其中，种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.8?7.5。
[0017]其中，种子发酵培养基和液体发酵培养基均包括以下组分和组分含量:葡萄糖0.8?1.0%，玉米粉0.8?1.2%，酵母粉0.3?0.5%，豆柏粉1.8?2.5% ,CaCO30.2?0.5 %，K2HPO40.I?0.3 % ,MgSO40.04?0.06 % ,MnSO40.02?0.03 %，泡敌0.05?0.I %，其余为水。
[0018]其中，葡萄糖、玉米粉、酵母粉、豆柏粉、CaC03、K2HP04、MgS04、MnS04的含量为质量百分含量，泡敌为体积百分含量。
[0019]其中，种子发酵罐为500L种子发酵罐，种子发酵培养基为300L，液体发酵罐为5000L液体发酵罐，液体发酵培养基为3000L。
[0020]其中，步骤(2)包括:
[0021]对种子发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118?121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的种子发酵培养基的初始PH值为6.5?7.7。
[0022]步骤(4)包括:
[0023]对液体发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118?121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的液体发酵培养基的初始PH值为6.5?7.7。
[0024]其中，步骤(I)包括:
[0025]用灭菌接种铲铲取枯草芽胞杆菌菌落，接入摇瓶中的NA液体培养基，34°C，180转/分，震荡培养10?14小时，生长至0D6QQ0.8?1.2，形成枯草芽胞杆菌摇瓶种子液。
[0026]NA液体培养基的pH值为7.0?7.2，NA液体培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水1L。
[0027]其中，步骤(I)之前还包括步骤:(11)将保存的枯草芽胞杆菌菌种进行活化。
[0028]其中，步骤(11)包括:从保存枯草芽胞杆菌菌种的斜面蘸取少许菌落划线于NA固体平板，置于32°C培养箱培养30?48小时，至枯草芽胞杆菌长出形成菌落。
[0029]其中，NA固体平板的培养基的pH值为7.0?7.2，NA固体平板的培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，琼脂粉20g，水1L。
[0030]接种比例、发酵pH值、发酵温度、转速、通气量、罐压以及培养时间都均与最终放罐后发酵液的含菌量相关。
[0031]其中，发酵温度、培养时间、接种比例和发酵pH值，均是影响菌株生长的条件参数，他们的数值适宜，是提高含菌量的重要条件;而转速和通气量则通过溶氧量，间接影响菌株的发酵环境，通气量和转速过高，泡沫增多，容易产生逃液和物质挥发，导致发酵液减少，通气量和转速过低，则溶氧量不够，因此，转速和通气量的取值是否合适，也影响最终发酵液的含菌量。
[0032]另外，对于有氧发酵，发酵过程中需要通过滤后的空气，一般发酵罐维持一定的液位，液位上部空余部分保持一定的压力，这个压力即为罐压。罐压的目的包括:1.维持罐内正压，避免外界空气进入污染;2.—定的罐压可以增加溶氧量，有效的溶氧可以提升好氧菌发酵的效率。但是罐压增加，也相应提高ω2分压，对有些微生物的正常生长可能产生不利影响，并且浪费空气压缩动力，因此罐压也不能过大。罐压一般控制在0.04?0.06MPa，具体情况要视培养情况和设备条件来定，适宜的罐压，直接影响发酵液的发酵质量。
[0033]另外，各发酵参数以及培养基中各营养素的含量和配比，还影响最终生产的菌群中芽孢体的含量。芽孢体具有极强抗逆性，能够保证芽胞杆菌在后续微生物制剂加工生产过程中，依然保持良好的活性，其含量是评判芽胞杆菌发酵的重要因素。
[0034]本发明所提供的枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，通过控制各发酵参数和培养基的组成，具有以下有益效果:
[0035](I)本发明的发酵方法，以大量的实验为基础，通过设定适宜的发酵参数包括罐压、转速、通气量、接种比例、发酵pH值、发酵温度、培养时间等，使得最后制得的发酵液具有较高的含菌量，经过实验证明，最后发酵液中枯草芽胞杆菌的含菌量可以达到1.04X 11t3?1.24 X 1010CFU/mL ο
[0036](2)本发明的发酵方法，通过配置合适的培养基以及发酵参数，使得最后制得的发酵液中枯草芽胞杆菌的芽孢含量达到9.2 X 19?1.12 X 1010CFU/mL，芽孢形成率为88.5 %?93.8%，为进一步制得高质量微生物制剂提供了优良原料基础。
[0037](3)本发明的发酵原料易得，发酵条件和参数简单易控制，设备常规，发酵周期短，25?30小时可停罐，符合工业化发酵生产要求，为可推广的工业型发酵。
【具体实施方式】
[0038]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
[0039]本发明的基本思想是，利用种子发酵罐和液体发酵罐，并配合合适发酵参数，使得制得的发酵液含菌多、芽孢形成率高，并且由于设备常规、操作简单等特点，该方法适合用于大规模工业发酵。
[0040]—种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，以下步骤:
[0041 ] (I)取枯草芽胞杆菌菌落接入摇瓶培养，形成枯草芽胞杆菌摇瓶种子液。
[0042](2)配置种子发酵罐的种子发酵培养基，其中所述种子发酵培养基的初始的pH值为6.5?7.7。
[0043](3)将枯草芽胞杆菌摇瓶种子液接入种子发酵罐发酵，其中，接种体积百分比为0.3?0.6 %，发酵温度为30?35 0C，种子发酵罐转速为180?200转/分，通气量为1: 0.3?1:
0.6，罐压为0.02?0.08Mpa，培养8?13小时，得到种子罐菌液。
[0044](4)配置液体发酵罐的液体发酵培养基，其中所述液体发酵培养基的初始的pH值为6.5?7.7。
[0045](5)将枯草芽胞杆菌种子罐菌液无菌转入液体发酵罐，其中，接种体积百分为8?12%,发酵温度为30?35 °C，液体发酵罐转速为150?175转/分，通气量为1: 0.3?1: 1.8，罐压为0.02?0.08Mpa，培养22?31小时，放罐得到枯草芽胞杆菌高密度发酵液。
[0046]步骤(3)具体包括:接种体积为0.5%,发酵培养基的初始pH值为6.8?7.5，发酵温度为32 0C，200转/分，通气量为1:0.5，罐压为0.03?0.06Mpa，培养9?12小时。步骤(5)包括:接种体积为10%，发酵培养基的初始PH值为6.5?7.7，发酵温度为32?35°C，170转/分，通气量为1: 0.5?1: 1.5，罐压为0.03?0.06Mpa，培养25?30小时。以上两个步骤的具体操作细化，可进一步提高最终的菌株和芽孢的生成量。
[0047]种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.8?7.5，通过调整发酵培养基到合适的pH值，可以进一步提高发酵效果。
[0048]另外，种子发酵培养基和液体发酵培养基均包括以下组分和组分含量:葡萄糖0.8?1.0%，玉米粉0.8?1.2%，酵母粉0.3?0.5%，豆柏粉1.8?2.5% ,CaCO30.2?0.5 %，Κ2ΗΡ040.1?0.3%，MgSO40.04 ?0.06% ,MnSO40.02 ?0.03%，泡敌 0.05% ?0.1 %。其中葡萄糖、玉米粉、酵母粉、豆柏粉、CaCO3、K2HP04、MgS04、MnS04的组分含量为质量百分含量，泡敌为体积百分含量。
[0049]发酵培养基的各成分以及比例也是影响芽孢形成的重要因素。在其他条件保持最适的条件下，将种子发酵培养基和液体发酵培养基作以上成分配制时，本发明的发酵方法的芽孢的形成率可以达到90%以上。
[0050]在本发明的步骤(2)中，种子发酵罐为500L种子发酵罐，种子发酵培养基为300L;在本发明的步骤(3)中，液体发酵罐为5000L液体发酵罐，液体发酵培养基为3000L。
[0051]控制发酵罐装液体积，使其与接种量、通风情况、罐压相匹配，以获得足够的溶氧，可以降低从摇瓶到发酵罐放大培养时产生的延迟期，进而进一步控制整个工业发酵的周期。
[0052]步骤(I)具体可以包括:用灭菌接种铲铲取枯草芽胞杆菌菌落，接入摇瓶中的NA液体培养基，34°C，180转/分震荡培养1?14小时，生长至OD6qq0.8?1.2，形成枯草芽胞杆菌摇瓶种子液;NA液体培养基的pH值为7.0?7.2，NA液体培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，水1L。摇瓶为2000mL三角瓶，摇瓶内装有500mLNA液体培养基。
[0053]步骤(I)为实验室摇瓶培养阶段，是整个工业发酵方法的基础阶段，通过对培养参数进行合理的配置，能够保证放大培养前的种子液质量。
[0054]步骤(I)之前还包括步骤:(11)将保存的枯草芽胞杆菌菌种进行活化。
[0055]步骤(II)具体包括:步骤(I I)包括:从保存枯草芽胞杆菌菌种的斜面蘸取少许菌落划线于NA固体平板，置于32°C培养箱培养30?48小时，至枯草芽胞杆菌长出形成菌落;其中，NA固体平板的培养基的pH值为7.0?7.2，NA固体平板的培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，琼脂粉 20g，水 1L。
[0056]另外，步骤(2)和步骤(4)均包括灭菌程序。其中步骤(2)具体包括:对种子发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118?121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的种子发酵培养基的初始PH值为6.5?7.7。步骤(4)具体包括:对液体发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118?121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的液体发酵培养基的初始pH值为6.5?7.7。
[0057]此外，当种子发酵培养基和液体发酵培养基的初始pH值均为6.8?7.5时，步骤(2)具体可以包括，对种子发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118?121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的种子发酵培养基的初始PH值为6.8?7.5。步骤(4)具体包括:对液体发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118?121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的液体发酵培养基的初始pH值为6.8?7.5o
[0058]需要说明的是，本发明的工业发酵方法适用于枯草芽胞杆菌菌株B201，由国家微生物菌种保藏管理中心保存，保存序号是5786。
[0059]为进一步说明本发明的一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法并做进一步的解释，下面将配合具体的实施例进行详述。
[0060]实施例1发酵方法I
[0061](11)取无菌斜面保存的枯草芽胞杆菌B201划线于NA固体平板，32°C静止培养30小时，至清晰单菌落长出。嫩固体培养基按质量百分比包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，琼脂2(^，水比，？!1为7.0。
[0062](I)将NA固体平板上长出的B201菌落接种于500mLNA液体种子培养基，置于2L三角瓶中，34°C，180转/分震荡培养10小时，测定OD6QQ为0.8，NA液体培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水lL，pH7.0。
[0063](2)配制种子发酵罐的种子发酵培养基，其中种子发酵罐为500L，装液量为300L，对种子发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118°C，灭菌时间为30min，灭菌后的种子发酵培养基的初始PH值为6.8。
[0064](3)将步骤(I)中的种子液接种于步骤(2)的种子发酵罐，种子发酵培养基组成(质量百分比)为:葡萄糖1.0%，玉米粉1.2%，酵母粉0.3%，豆柏粉2.5%，CaC030.2%，K2HPO40.I % ,MgSO40.06 % ,MnSO40.02% ,泡敌(体积百分比)0.05%,余量为水，接种量为
0.3%,种子罐发酵条件为30 0C，200转/分，通气比1: 0.5，罐压0.04Mpa，培养8小时，结晶紫染色观察枯草芽胞杆菌菌体生长良好。
[0065](4)配制液体发酵罐的液体发酵培养基，其中液体发酵罐为5000L，装液量为3000L，对液体发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的液体发酵培养基的初始的pH值为7.2;
[0066](5)将步骤(3)中的发酵液全部转入步骤(4)的液体发酵罐，液体发酵培养基组成(质量百分比)为:葡萄糖1.0%，玉米粉1.2%，酵母粉0.3%，豆柏粉2.5%，CaC030.2%，K2HPO40.1 MgSO40.06% ,MnSO40.02%，泡敌(体积百分比)0.05%，余量为水。发酵罐发酵条件为30°C，150转/分，通气比O?8小时1:0.5，9?10小时1:0.8，11?12小时1:1.0，13?16小时1: 1.2，17?25小时1: 1.8，罐压0.05Mpa，培养22小时，结晶紫染色观察枯草芽胞杆菌。
[0067]观测结果:
[0068](I)菌体生长旺盛，16小时开始形成芽孢。
[0069](2)采用平板计数法，计算22小时放罐时活菌量和芽孢量，其中活菌量达到1.13 X1010CFU/mL，芽孢量1.06 X 1010CFU/mL，芽孢形成率为93.8 %。。
[0070]实施例2发酵方法2
[0071](11)取无菌斜面保存的枯草芽胞杆菌B201划线于NA固体平板，32°C静止培养48小时，至清晰单菌落长出。嫩固体培养基按质量百分比组成为:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，琼脂2(^，水比，？!1值为7.2。
[0072](I)将NA固体平板上长出的B201菌落接种于500mLNA液体种子培养基，置于2L三角瓶中，34°C，180转/分震荡培养14小时，测定OD6qq为1.2，NA液体培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水lL，pH7.2。
[0073](2)配制种子发酵罐的种子发酵培养基，其中种子发酵罐为500L，装液量为300L，对种子发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的种子发酵培养基的初始PH值为7.5。
[0074](3)将步骤(I)中的种子液接种于步骤(2)的种子发酵罐，种子发酵培养基组成(质量百分比)为:葡萄糖0.8%，玉米粉0.8%，酵母粉0.5%，豆柏粉1.8%，CaC030.5%，K2HPO40.1 MgSO40.04% ,MnSO40.03 %，泡敌(体积百分比)0.1 %，余量为水。接种量为
0.6%,种子罐发酵条件为35 0C，280转/分，通气比1:0.6，罐压0.05Mpa，培养13小时，结晶紫染色观察枯草芽胞杆菌菌体生长良好。
[0075](4)配制液体发酵罐的液体发酵培养基，其中液体发酵罐为5 O O O L，装液量为3000L，对液体发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的液体发酵培养基的初始的pH值为6.8。
[0076](5)将步骤(3)中的发酵液全部转入步骤(4)的液体发酵罐，液体发酵培养基组成(质量百分比)为:葡萄糖0.8%，玉米粉0.8%，酵母粉0.5%，豆柏粉1.8%，CaC030.5%，K2HPO40.1 % ,MgSO40.04% ,MnSO40.03%，泡敌(体积百分比)0.1 %，余量为水。发酵罐发酵条件为35°C，175转/分，通气比O?8小时1:0.5，9?10小时1:0.8，11?16小时1:1.0，17?22小时1:1.2，23?28小时1: 1.5，罐压0.03?&，培养31小时，结晶紫染色观察枯草芽胞杆菌菌体。
[0077]观测结果:
[0078](I)菌体生长旺盛，20小时开始形成芽孢。
[0079](2)采用平板计数法，计算31小时放罐时活菌量和芽孢量，其中活菌量为1.08 X1010CFU/mL，芽孢量9.8 X 109CFU/mL，芽孢形成率为90.7 %。
[0080]实施例3发酵方法3
[0081](11)取无菌斜面保存的枯草芽胞杆菌B201划线于NA固体平板，32°C静止培养40小时，至清晰单菌落长出。NA固体培养基按质量百分比组成包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，琼脂 20g，水 lL，pH7.1。
[0082](I)将NA固体平板上长出的B201菌落接种于500mLNA液体种子培养基，置于2L三角瓶中，34°C，180转/分震荡培养12小时，测定OD6QQ为1.1，NA液体培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水lL，pH7.1。
[0083](2)配制种子发酵罐的种子发酵培养基，其中种子发酵罐为500L，装液量为300L，对种子发酵培养基进行灭菌，120°C灭菌30min，灭菌后初始pH6.5。
[0084](3)将步骤(I)中的种子液接种于步骤(2)的种子发酵罐，种子发酵培养基组成(质量百分比)为:葡萄糖1.0%，玉米粉1.2%，酵母粉0.3%，豆柏粉2.5%，CaC030.2%，K2HPO40.2 % ,MgSO40.06 % ,MnSO40.02% ,泡敌(体积百分比)0.08%,余量为水。接种量为
0.5%,种子罐发酵条件为32 °C，200转/分，通气比1: 0.5，罐压0.03Mpa，培养9小时，结晶紫染色观察枯草芽胞杆菌菌体生长良好。
[0085](4)配制液体发酵罐的液体发酵培养基，其中液体发酵罐为5000L，装液量为3000L，对液体发酵培养基进行灭菌，118°C灭菌30min，灭菌后初始PH7.2。
[0086](5)将步骤(3)中的发酵液全部转入步骤(4)的液体发酵罐，液体发酵培养基组成(质量百分比)为:葡萄糖1.0%，玉米粉1.2%，酵母粉0.3%，豆柏粉2.5%，CaC030.2%，K2HP040.3%,MgSO40.06%,MnSO40.02%,泡敌(体积百分比)0.08%，余量为水。发酵罐发酵条件为32°C，170转/分，通气比O?8小时1:0.5，9?10小时1:0.8，11?12小时1:1.0，13?16小时1: 1.2，17?25小时1: 1.5，罐压0.03Mpa，培养25小时，结晶紫染色观察枯草芽胞杆菌。
[0087]观测结果:
[0088](I)菌体生长旺盛，16小时开始形成芽孢。
[0089](2)采用平板计数法，计算25小时放罐时活菌量和芽孢量，其中活菌量为1.13 X110CFlVmL，芽孢量1.06 X 1010CFU/mL，芽孢形成率为93.8 %。
[0090]实施例4发酵方法4
[0091](11)取无菌斜面保存的枯草芽胞杆菌B201划线于NA固体平板，32°C静止培养36小时，至清晰单菌落长出。NA固体培养基按质量百分比组成包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，恥〇158，琼脂2(^，水比，？!1值为7.1。
[0092](I)将NA固体平板上长出的B201菌落接种于500mLNA液体种子培养基，置于2L三角瓶中，34°C，180转/分震荡培养12小时，测定OD6qq为1.2，NA液体培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水lL，pH7.1。
[0093](2)配制种子发酵罐的种子发酵培养基，其中种子发酵罐为500L，装液量为300L，121°C灭菌30min，灭菌后初始ρΗ7.7。
[0094](3)将步骤(I)中的种子液接种于步骤(2)的种子发酵罐，种子发酵培养基组成(质量百分比)为:葡萄糖0.9%，玉米粉1.0%，酵母粉0.4%，豆柏粉1.8%，CaC030.3%，K2HP040.2% ,MgSO40.05% ,MnSO40.03%，泡敌(体积百分比)0.08% ,余量为水。接种量为
0.5%,种子罐发酵条件为32 0C，200转/分，通气比1:0.5，罐压0.06Mpa，培养12小时，结晶紫染色观察枯草芽胞杆菌菌体生长良好。
[0095](4)配制液体发酵罐的液体发酵培养基，其中液体发酵罐为5 O O O L，装液量为3000L，对液体发酵培养基进行灭菌，118°C灭菌30min，灭菌后初始pH7.3。
[0096](5)将步骤(3)中的发酵液全部转入步骤(4)的液体发酵罐，液体发酵培养基组成(质量百分比)为:葡萄糖0.9%，玉米粉1.0%，酵母粉0.4%，豆柏粉1.8%，CaC030.3%，K2HPO40.2 % ,MgSO40.05% ,MnSO40.03%,泡敌(体积百分比)0.08 %，余量为水。发酵罐发酵条件为35°C，170转/分，通气比O?10小时1:0.5，11?14小时1:0.8，15?18小时1:1.0，19?22小时1: 1.2，23?30小时1: 1.5，罐压0.06Mpa，培养30小时，结晶紫染色观察枯草芽胞杆菌。
[0097]观测结果:
[0098](I)菌体生长旺盛，16小时开始形成芽孢。
[0099](2)采用平板计数法，计算30小时放罐时活菌量和芽孢量，其中活菌量达到1.04 X1010CFU/mL，芽孢量9.2 X 109CFU/mL，芽孢形成率为88.5 %。
[0100]综上所述，本发明的枯草芽胞杆菌的工业发酵方法具有以下有益效果:
[0101](I)本发明的发酵方法，以大量的实验为基础，通过设定适宜的发酵罐的罐压、转速和通气量以及发酵参数，使得最后制得的发酵液具有极高的含菌量，经过实验证明，最后发酵液中枯草芽胞杆菌的活菌量可以达到1.04 X 1iq?1.24 X 101QCFU/mL。
[0102](2)本发明的发酵方法，通过配置合适的培养基以及发酵参数，使得最后制得的发酵液中枯草芽胞杆菌的芽孢含量达到9.2 X 19?1.12 X 1010CFU/mL，芽孢形成率为88.5 %?93.8%，为制得高质量微生物制剂提供了优良原料基础。
[0103](3)本发明的发酵原料易得，发酵条件和参数简单易控制，设备常规，发酵周期短，25?30小时可停罐，符合工业化发酵生产要求，为可推广的工业型发酵。
[0104]最后应说明的是:在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0105]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本明各实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取枯草芽胞杆菌菌落接入摇瓶培养，制成摇瓶种子液； (2)在种子发酵罐中配制种子发酵培养基，其中所述种子发酵培养基的初始的pH值为6.5?7.7; (3)将摇瓶种子液接入种子发酵培养基中发酵，其中，接种体积百分比为0.3?0.6%，发酵温度为30?35°C，种子发酵罐转速为180?200转/分，通气量为1: 0.3?1: 0.6，罐压为0.02?0.08Mpa，培养8?13小时，得到种子罐菌液； (4)在液体发酵罐中配制液体发酵培养基，其中所述液体发酵培养基的初始的pH值为6.5?7.7; (5)将种子罐菌液无菌转入液体发酵培养基中，其中，接种体积百分比为8?12%，发酵温度为30?35°C，液体发酵罐转速为150?175转/分，通气量为1:0.3?1: 1.8，罐压为0.02?0.08Mpa，培养22?31小时，放罐，得到枯草芽胞杆菌高密度发酵液。2.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)包括: 接种体积百分比为0.5%，发酵温度为32°C，种子发酵罐转速为200转/分，通气量为1:0.5,罐压为0.03?0.06Mpa，培养9?12小时； 所述步骤(5)包括: 接种体积百分比为10%，发酵温度为32?35°C，液体发酵罐转速为170转/分，通气量为1: 0.5?1:1.5，罐压为0.03?0.06Mpa，培养25?30小时。3.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于， 所述种子发酵培养基和所述液体发酵培养基的初始pH值均为6.8?7.5。4.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于， 所述种子发酵培养基和所述液体发酵培养基均包括以下组分和组分含量:葡萄糖0.8?1.0%，玉米粉0.8?1.2%，酵母粉0.3?0.5%，豆柏粉1.8?2.5% ,CaCO30.2?0.5 %，K2HPO40.I?0.3 % ,MgSO40.04?0.06 % ,MnSO40.02?0.03 %，泡敌0.05?0.I %，其余为水； 其中，葡萄糖、玉米粉、酵母粉、豆柏粉、CaC03、K2HP04、MgS04、MnS04的含量为质量百分含量，泡敌为体积百分含量。5.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于， 所述种子发酵罐为500L种子发酵罐，所述种子发酵培养基为300L，所述液体发酵罐为5000L液体发酵罐，所述液体发酵培养基为3000L。6.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)包括: 对种子发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118?121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的种子发酵培养基的初始PH值为6.5?7.7。 所述步骤(4)包括: 对液体发酵培养基进行灭菌，灭菌温度为118?121°C，灭菌时间为30min，灭菌后的液体发酵培养基的初始PH值为6.5?7.7。7.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于，所述步骤(I)包括: 用灭菌接种铲铲取枯草芽胞杆菌菌落，接入摇瓶中的NA液体培养基，34°C，180转/分，震荡培养10?14小时，生长至0D6QQ0.8?1.2，形成枯草芽胞杆菌摇瓶种子液； 所述NA液体培养基的pH值为7.0?7.2，所述NA液体培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水1L。8.如权利要求1所述的工业发酵方法，其特征在于，所述步骤(I)之前还包括步骤: (11)将保存的枯草芽胞杆菌菌种进行活化。9.如权利要求8所述的工业发酵方法，其特征在于，所述步骤(11)包括: 从保存枯草芽胞杆菌菌种的斜面蘸取少许菌落划线于NA固体平板，置于32°C培养箱培养30?48小时，至枯草芽胞杆菌长出形成菌落； 其中，所述NA固体平板的培养基的pH值为7.0?7.2，所述NA固体平板的培养基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，琼脂粉20g，水1L。
【文档编号】C12R1/125GK105907661SQ201610218196
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】王 琦, 刘春红, 李燕, 张丽霞
【申请人】中国农业大学