具有低温降解多环芳烃功能的交替假单胞菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株具有低温降解石油功能的交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.QN?1，其保藏号为CGMCC No.11635。该菌株筛选自我国北方受石油污染的海域，可在低温条件下降解石油，特别是可在0℃的极端环境降解石油中的萘。本发明的交替假单胞菌QN?1可应用于海洋石油污染的生物修复工作，尤其可应用于我国北方海域冬季(包括冰期)等低温环境下萘的降解。CGMCC No.1163520151109
【专利说明】
具有低温降解多环芳烃功能的交替假单胞菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株海洋低温菌及其在海洋萘污染生物修复中 的应用。所述菌株能在〇°C~15°C的低温条件下降解石油烃，特别是具有在0°C的极端条件 下高效降解石油烃中萘的特点，可用于我国北方海域溢油污染和萘污染的生物修复工作。
【背景技术】
[0002] 随着海洋运输业的高速发展和海洋开采业的快速崛起，海洋溢油事故日益频发， 危害巨大。特别是低温海域发生的溢油由于温度低，使有机污染物持久存在，会对当地生态 系统造成更大的危害。石油中多环芳烃(PAHs)具有广泛的毒性、致癌性及致畸诱变作用，通 过生物累积及食物链的传递作用，会给海洋生物和人类健康带来极大危害，已经引起各国 学者的高度重视。虽然PAHs在原油中的含量仅占1%左右，但通常溢油总量较大，因此其中 PAHs的含量不容忽视。利用微生物修复海洋溢油具有成本低、效果好、对环境负面影响小、 无二次污染等优点，因此日益受到人们的重视。环境温度对石油的生物降解影响很大，而我 国北方海域冬季的海洋表面温度较低，大约在2 °C左右，部分海域也会有结冰期。虽然目前 已经发现了一些海洋石油烃低温降解菌，但菌源主要来自极地环境，而且多是烷烃低温降 解菌，PAHs低温降解菌非常少。由于自然环境相当复杂，外源菌的进入会给本地生态环境带 来诸多问题。为了避免引入大量外来菌种而造成海洋原有生态系统的破坏，进行生物修复 时应选用土著菌种。但是，目前我国关于海洋石油烃低温降解菌的研究较少，特别是对海洋 PAHs低温降解菌的研究成果更为匮乏。萘为常见的PAHs，本发明的内容是提供一株筛选自 我国北方受污染海域的石油降解菌，该菌为交替假单胞菌，可在低温条件下降解石油，特别 是可在0°C的极端环境下高效地降解萘。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对上述现有技术的不足提供一株在低温条件下可降解石油 的海洋石油降解菌。该菌株筛选自我国北方受石油污染的海域，可在低温条件下降解石油 中的多环芳烃，特别是可在〇°C的极端环境下高效地降解石油中的萘。
[0004] 本发明所提供的具有在低温条件下降解多环芳烃功能的交替假单胞菌 (Pseudoalteromonas sp. )QN-1是从胶州湾海域筛选获得的。2013年11月22,中石化输油储 运公司潍坊分公司输油管线破裂。事故发生后，部分原油沿着雨水管线进入胶州湾，污染附 近海域。溢油发生一周后，取表层被原油污染的海水，经过筛选得到Pseudoalteromonas sp.QN-1〇
[0005] 该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称:CGMCC，地址 为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)保藏，保藏 号为CGMCC No. 11635，保藏日期为2015年11月09日。
[0006] 本发明的Pseudoalteromonas sp · QN-1 的特征如下：
[0007] (1)菌落特征:乳白、近似圆形、隆起、光滑、湿润。
[0008] (2)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于交替假单胞菌属 (卩8611(1〇&]^61'01]10的8)。菌株？8611(1〇&]^61'01]1011&8 8。.(^-1的163抑嫩序列具体可见序列 表。
[0009] (3)萘降解性能特征：在0 °C的条件下，经过3 0天的降解实验后，萘降解率可达 80.6%〇
[0010] 本发明还提供交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)QN_l在低温条件下降解石 油中的应用，优选地，该菌降解石油中的石油烃，更优地该菌高效地降解萘。所述低温条件 是指0°C~15°C，尤其是指0°C。本发明的交替假单胞菌QN-1可应用于海洋石油污染的生物 修复中，尤其可应用于低温环境中。
[0011] 本发明的有益效果：
[0012] 本发明的？8611(1〇31丨61'01]101^8 8口.(^-1是一株高效海洋低温萘降解菌，即使是在0 °c的条件下还能保持较高的萘降解活力。
[0013] 本发明的菌株培养方法简单，培养基原料易得。该菌株对萘降解能力强，对菲和蒽 等PAHs也具有一定降解能力，对石油中烷烃也具有一定降解能力，适用于海洋萘污染的生 物修复工作，也可为我国北方海域溢油(包括冰期溢油）的生物修复工作提供优良的PAHs降 解菌。
【具体实施方式】
[0014] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方 法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
[0015] 下述实施例采用的培养基及其组成为如下：
[0016] MMC培养基为：NaCl 24g，NH4N03 1.0g，KCl 0.7g，KH2P〇4 2.0g，Na2HP〇43.0g， MgS〇4.7H20 7.0g，微量元素 CaCl2 0.02mg/L，FeCl3.6H20 0.5mg/L，CuS〇4〇.005mg/L， MnCl2.4H2〇 0.005mg/L，ZnS〇4.7H20 0.1mg/L，加去离子水至lL，pH 7.4;
[0017] 2216E液体培养基为：蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁0. lg，加去离子水至lOOOmL， pH值7.4~7.8;
[0018] 2216E琼脂培养基为:蛋白胨5g，酵母膏1 g，磷酸高铁0. lg，琼脂15g，加去离子水至 100〇1^，？田直7.4~7.8。
[0019] 实施例1菌株Pseudoalteromonas sp · QN-1的分离与鉴定 [0020]菌株Pseudoalteromonas sp.QN-Ι的分离
[0021] (1)样品采集:胶州湾；
[0022] (2)富集驯化:于250mL三角瓶中加入100mL MMC培养液，120°C下灭菌15min。二氯 甲烷用0.22μπι孔径的耐有机溶剂滤膜过滤除菌。称取0.2g萘溶于20mL除菌后的二氯甲烷 中，然后转入到已灭菌的l〇〇mL MMC培养液里，放于摇床上振荡过夜使二氯甲烷挥发。待二 氯甲烷挥发后，加入海水样品5mL，置入低温生化培养箱，于120r/min、10 °C下振荡培养30d， 然后从中取5mL培养液再次转接:将5mL培养液加入到含有0.2g萘的100mL MMC培养液中（处 理方法同上），于120r/min条件下培养30d。每轮培养温度降低1°C，直至0°C，并在0°C条件下 长期驯化。
[0023] (3)分离纯化:将经过富集驯化的微生物培养液进行梯度稀释，并在2216E固体培 养基上进行平板划线，〇°C培养直至长出清晰菌落。挑选生长良好的菌落，在已灭菌的2216E 固体培养基上分3个区域进行划线，置入生化培养箱，于0°C下培养。挑取3区具有生长优势 的单菌落，进行二次划线分离。如此反复多次划线，直到分离出菌落单一的菌株，命名为菌 株QN-1〇
[0024] 2.菌株Pseudoalteromonas sp.QN-Ι的鉴定
[0025] (1)菌落特征:乳白、近似圆形、隆起、光滑、湿润。
[0026] (2)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于交替假单胞菌属 (Pseudoalteromonas)，被分类为交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。该菌株已在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No . 11635，保藏日 期为2015年 11 月09日。16S rDNA序列如SEQ ID No.l。
[0027] 实施例2菌株Pseudoalteromonas sp · QN-1 的发酵
[0028] 用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基的三角 瓶锥形中，低温振荡培养7(1(0°(：，12(^/1^11)，成为种子液；将种子液按10%体积比加入 2216E液体培养基中，0 °C下培养7天，获得发酵液。
[0029] 实施例3在0°C条件下菌株Pseudoalteromonas sp.QN-1萘降解率的测定
[0030] (1)降解菌种子液
[0031]用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基的三角 瓶锥形中，低温振荡培养7d(0°C，120r/min)。
[0032] (2)降解培养
[0033] 称取0.2g萘溶于20mL已过滤灭菌的正己烷中，移至装有100mL已灭菌的MMC液体培 养基的三角瓶锥形中，放置到振荡器上振荡直至正己烷挥发完全，按照10%的接种量接种 降解菌种子液，低温振荡培养30d(0°C，12〇 r/min)。以不接种降解菌的培养液作为空白组。 [0034] (3)萃取
[0035]降解培养结束后，在培养液中加入3mL 50%的硫酸溶液进行酸化。将酸化后的培 养液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充 分振荡后静置。液体明显分层后把下层液体转至三角瓶中，上层液离心后通过铺满无水硫 酸钠的砂芯漏斗过滤除水后收集，进行下一步分析。萃取2~3次，然后合并上层液，旋转蒸 发，进行气相色谱分析。
[0036] (4)气相色谱法测量
[0037] 气相色谱仪实验条件:载气N2流量25mL/min;H2流量30mL/min;汽化室温度280 °C ; 毛细管色谱柱30(1)111\0.32((1)111111小10检测器温度300°(：;柱头压力145即&;进样量为14^ 进样方式为不分流进样。气相色谱程序升温条件:初始温度60°C，每分钟升温20°C，在100°C 保留2min，然后每分钟升温20°C，在280°C保留5min。
[0038] 标准曲线绘制：用正己烧做为溶剂，分别配制50ppm、100ppm、200ppm、300ppm、 400ppm、500ppm的萘标准溶液。将标准溶液进行气相色谱分析，以萘浓度为横坐标，峰面积 为纵坐标，绘制标准曲线。
[0039]将空白组和实验组的萘溶液进行气相色谱分析，得到出峰面积，根据标准曲线可 得萘浓度。
[0040] (5)结果
[0041 ] 萘降解率的计算:降解率D = (Co-&) /Co X 100 %
[0042]式中Co:空白瓶(不加菌）中萘的浓度;&:实验瓶(加菌）中萘的浓度。
[0043]计算结果降解率为80.6%，说明在0°C条件下本发明的菌株对萘具有高效的降解 能力。
[0044] 实施例4菌株Pseudoalteromonas sp · QN-1石油经降解率的测定
[0045] (1)降解菌种子液
[0046] 0°C组：用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基 的三角瓶锥形中，低温振荡培养7d(0°C，120r/min)。
[0047] 15°C组：用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基 的三角瓶锥形中，低温振荡培养5d( 15°C，120r/min)。
[0048] (2)降解培养
[0049] 0°C组:称取0.5g原油溶于20mL已过滤灭菌的正己烷中，移至装有100mL已灭菌的 MMC液体培养基的三角瓶锥形中，放置到振荡器上振荡直至正己烷挥发完全，按照10%的接 种量接种菌株？8611(1〇31丨61'〇1]1〇1^3 8。.(^-1种子液，低温振荡培养60(1(0<€，1201'/111；[11)。以 不接种降解菌的培养液作为空白组。
[0050] 15°C组:称取0.5g原油溶于20mL已过滤灭菌的正己烷中，移至装有100mL已灭菌的 MMC液体培养基的三角瓶锥形中，放置到振荡器上振荡直至正己烷挥发完全，按照10%的接 种量接种菌株?8611(1〇31丨61'〇1]1〇1^3 3。.(^-1种子液，低温振荡培养60(1(15<€，1201'/111；[11)。以 不接种降解菌的培养液作为空白组。
[0051 ] (3)萃取
[0052]降解培养结束后，在培养液中加入3mL 50%的硫酸溶液进行酸化。将酸化后的培 养液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充 分振荡后静置。液体明显分层后把下层液体转至三角瓶中，上层液离心后通过铺满无水硫 酸钠的砂芯漏斗过滤除水后收集，进行下一步分析。萃取2~3次，然后合并上层液。
[0053] (4)原油标准曲线绘制
[0054] 称取O.lg油样品溶于正己烷中，移至100ml的容量瓶中，定容得到浓度为l.OOmg/ ml的油标准储备溶液。移取5ml油标准储备溶液于50ml容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度 为0. lmg/ml油标准使用液。分别移取一定量的0. lmg/ml油标准使用液于25ml容量瓶中，用 正己烷定容，得到一系列已知浓度的油溶液。采用紫外分光光度法，在227nm处测其吸光度。 以油浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
[0055] (5)吸光度测量
[0056]采用紫外分光光度计进行测量。在227nm的波长下，以正己烷的吸光度为参比，用 10mm石英比色皿测萃取液吸光度。若吸光值超过标准曲线范围，则对萃取液按照1/10的比 例逐级稀释。根据标准曲线，算出其相应的浓度。
[0057] (6)结果
[0058] 降解率的计算:降解率D = (Co-Ci) /Co X 100 %
[0059]式中Co:空白瓶(不加菌）中原油的浓度;&:实验瓶(加菌）中原油的浓度。
[0060] 计算结果为在0°C和15°C条件下，石油烃降解率分别为21 %和40%。说明在低温条 件下本发明的菌株对石油烃具有一定的降解能力。
【主权项】
1. 一株在海洋环境中具有低温降解多环芳经功能的交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp .QN-I，其保藏号为CGMCC No .11635。2. 如权利要求1所述的交替假单胞菌QN-I在低温条件下降解石油中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述交替假单胞菌QN-I降解多环芳烃。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述交替假单胞菌QN-I降解萘。5. 根据权利要求2~4的任一项所述的应用，其特征在于，所述低温条件为(TC~15°C。6. 根据权利要求2~4的任一项所述的应用，其特征在于，所述降解石油的环境为海洋 环境。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述低温条件为(TC。
【文档编号】C02F3/34GK105907677SQ201610290987
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】郭平, 林建国, 曹宾霞
【申请人】大连海事大学