一株耐低温的假单胞菌及其用图
【专利摘要】本发明涉及一株耐低温假单胞菌及其应用。具体涉及分离并鉴定了一株耐温的假单胞菌(Pseudomonas fragi)。该菌具有耐低温的特性，在4℃仍然可以正常生长，最适生长温度为10～16℃，可生长温度范围4～28℃。该菌可以低温条件下同时去除污水中的COD、NH3?N和TP。在8℃条件下，对人工配制污水(初始COD、NH3?N和TP分别为544mg/L、14mg/L、12mg/L)中COD、NH3?N和TP的去除率分别为52％、41％和18％，可用于低温生物处理污水中COD、NH3?N和TP之用。CGMCC No.839820131018
【专利说明】
一株耐低温的假单胞菌及其用途
技术领域
[0001 ]本发明属于环境微生物技术领域。它具体涉及一株假单胞菌Pseudomonas fragiYB菌株，及其在低温环境下对污水中有机污染物和营养盐去除的应用。
【背景技术】
[0002]随着我国经济的快速发展和城市化进程的不断加快，城镇污水量不断增加，水资源短缺和水污染已经成为制约我国经济可持续发展的重要因素。城市污水处理是防止水污染、改善城市水环境质量的重要手段，对改善城市水环境、保障城市经济发展起着关键的作用。生物处理法是城市污水处理中应用最广泛的处理方法，它利用自然界中微生物的新陈代谢作用，将污水中的污染物进行分解和转化，达到净化的目的。中温微生物是污水生物处理方法的主体，它们的最适生长温度在20°C?37°C之间。但是，在我国北方地区冬季寒冷漫长、污水温度偏低，污水温度一般在10°C左右甚至更低。在这种低温环境中，中温微生物的生长和代谢活动减慢，新陈代谢处于抑制状态，降解污染物质的能力受阻。低温很大程度地削弱了对有机污染物的降解能力，影响北方冬季污水生物处理的效率，导致出水很难达标排放。目前，在水处理工程中常用的解决方法是降低污泥负荷，增加污水停留时间等方法，但这些方法使污水厂的占地面积增大，运转费增加，处理效果也不尽如人意。因此，如何提高寒冷地区冬季低温污水处理效率是北方寒冷地区冬季污水处理中亟待解决的实际问题。
[0003]在自然界中，存在着一类能够在很多被认为是生命禁区的极端环境(如高温、低温、高酸、高碱等)中仍具有顽强生命力的微生物，被称为极端环境微生物。其中，能够适应低温环境的微生物就是重要的极端微生物类群。耐冷菌在长期低温环境中，形成了一系列特殊的生理机制和低温催化活性，保证了它们在低温条件下细胞内物质的合成代谢和分解代谢的正常进行。目前，低温微生物在废水处理方面的作用已引起研究者们的兴趣，成为国内外关注的热点科学技术问题。据报道，假单胞菌属(Pseudomonas)细菌能够利用结构简单和复杂的有机化合物，具有较强的耐低温性能，是较常见的耐低微生物。已有研究报道，假单胞菌属细菌如Pseudomonas koreensis ,Pseudomonas fragi ,Pseudomonas Iundensis可以致低温冷藏食品发生腐败，表明这些假单胞菌属细菌具备良好的耐冷性能，可在低温环境下正常繁殖。但是，有关上述细菌去除污水中污染物的研究还鲜见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对低温条件下城市污水处理效率低的问题，提供一株适用于低温极端环境的假单胞菌(Pseudomonas fragi)YB菌株和该菌在污水中去除有机污染和营养盐的应用。
[0005]本发明所提供的假单胞菌(Pseudomonas fragi)YB菌株，于2013年10月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)”，保藏登记号为CGMCC N0.8398，建议分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。[000?]本发明所提供的假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株是从吉林省某冷水鱼塘(东经:129.03，北玮:42.77)的底泥中分离。以低温为选择压力，在LB培养基中反复驯化培养获得。菌株YB耐低温，在4 °C仍然可以正常生长，最适生长温度为10?16°C，可生长温度范围4Γ?28Γ。
[0007]假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株的菌落特征:在LB琼脂平板培养基上，15°C培养48h，为菌落直径为2.5mm左右。菌落为圆形凸起、表面光滑、质地粘稠、乳白色、半透明。
[0008]假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株的细胞特征:菌细胞为杆状、细胞大小为
0.53 X I?2.87ym0
[0009]假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株的生理生化特征:革兰氏阴性，过氧化氢酶、氧化酶、甲基红、明胶液化、生成硫化氢试验和精氨酸双水解酶反应结果为阳性，产吲哚试验、淀粉水解试验、V-P试验结果为阴性。
[0010]假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株的16S rRNA基因序列特征:菌株YB的16SrRNA基因序列长度为1419bp(序列如列表所示)，在GeneBank中的登录号为KJ496054。通过与GeneBank同源序列比对可知，菌株YB与假单胞菌Pseudomonas fragi ATCC4973同源性达99.79%。
[0011]参照《伯杰氏鉴定细菌学手册》(第8版)，根据菌株形态学特征、生理生化特征，结合该菌的16S rRNA基因序列在GeneBank中的比对结果，分离的菌株YB鉴定为假单胞菌Pseudomonas spD
[0012]本发明的另一个目的是提供采用耐低温菌在低温条件下去除污水中有机污染物和营养盐的方法。
[0013]以假单胞菌Pseudomonasfragi YB菌株为活性成分制备的生物制剂也属于本发明的保护范围。
[OOM]本发明的假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株，分离自吉林省某冷水鱼塘(东经:129.03，北玮:42.77)的底泥。假单胞菌Pseudomonas fragi YB在8°C低温条件下，可使初始C0D、NH3-N和TP分别为544mg/L、14mg/L、12mg/L的污水中3种污染物的去除率分别为52%、41%和18%。因此，本发明提供假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株在低温条件可同时去除污水中有机污染物和营养盐的作用，具备良好的应用前景。
[0015]下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。
【附图说明】
[0016]图1为假单胞菌Pseudomonasfragi YB菌株的扫描电镜图片(A)及其在LB平板下生长的菌落形态照片(B)
[0017]图2为假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株在不同低温条件下的生长情况(A)与生长曲线(B)。
[0018]图3为假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株在8°C低温条件下对污水中化学需氧量COD、氨氮NH3-N和总磷TP的去除率
【具体实施方式】
[0019]下述实施在实例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径购买获得。
[0020]下述实验方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。每个实验均为3个平行，并设置空白对照实验。
[0021]下述实验方法中菌株YB的生物量采用OD6qq表征，即采用分光光度法测定菌株YB培养液在波长为600nm的吸光度值。
[0022]下述实验中采用的污水为人工配制。污水的初始⑶D、NH3-N和TP分别为544mg/L、14mg/L、12mg/L。
[0023]本发明中有机污染物采用化学需氧量(COD)和营养盐(氨氮NH3-N和总磷TP)均采用国家标准方法测定。其中COD采用重铬酸钾滴定法测定，NH3-N采用纳氏试剂分光光度法测定，TP采用钼酸铵分光光度法测定。
[0024]实施例1.假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株的分离、纯化和鉴定。
[0025]耐冷菌分离过程中使用的LB液体培养基的组成为:蛋白胨2g，酵母粉Ig，NaCl2g，琼脂4g，水200mL，pH 7.0?7.5。
[0026]LB固体培养基的组成为:在上述液体培养基中加入琼脂16g。
[0027]假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株分离自林省某冷水鱼塘的底泥(东经:129.03，北玮:42.77)，具体富集、分离、纯化过程如下:
[0028]将Ig采集的底泥样品接种到生理盐水中(装液量为20ml/100ml三角瓶)，15°C，180rpm下振荡24h。取Iml悬液于离心管中，5000r/min离心lOmin，弃去上清液，再加入相同体积的生理盐水进行洗涤，重复以上洗涤过程3次。将所得沉淀进行一系列梯度稀释，涂布于LB固体培养基上，将涂布后的平板置于10°C条件下静置培养直至长出明显可见的菌落。将初筛分离纯化后得到的耐冷细菌，分别制备菌悬液，在8 °C和5 °C条件进行进一步的复筛，最终获得一株优势耐低温菌株，命名为YB。
[0029]采用形态观察、生理生化鉴定和16S rRNA基因测序对菌株YB进行鉴定
[0030]在LB培养基上的可见乳白色、表面光滑、质地粘稠、乳白色、半透明的菌落。电镜下观察，菌株YB的乳细胞为杆状、细胞大小为0.53 X I?2.87μπι。
[0031]生理生化鉴定结果为:革兰氏染色为阳性；过氧化氢酶、氧化酶、甲基红、明胶液化、生成硫化氢试验和精氨酸双水解酶反应结果为阳性，产吲哚试验、淀粉水解试验、V-P试结果为阴性。
[0032]菌株的16SrRNA基因序列测定和系统发育分析。将经纯化保存后的菌株接种到LB液体培养基180r/min中培养12h，离心收集菌体，重新悬浮，采用酸-氯仿法提取菌株的DNA，0.8%琼脂糖电泳进行检测。采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增。其中，正向引物为27f(5，-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)，反向引物为 1492r(5’_GGC TAC CTT GTT ACGACT T-3 ’)’。PCR反应条件为:先94°C6min;然后94°C45s，54°C45s，72°C90s，共30个循环；最后72°C延伸1min JCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。菌株YB的16RNA基因序列长度为1419bp，在GeneBank中的登录号为KJ496054。通过与GeneBank同源序列比对可知，菌株YB与假单胞菌Pseudomonas fragi ATCC4973同源性达99.79%。菌株YB的16SrRNA基因序列如下:
[0033]0001 AAGCTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGAC
[0034]0061 GGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCT
[0035]0121 AATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATG
[0036]0181 AGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAAC
[0037]0241 TGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG
[0038]0301 GCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTG
[0039]0361 AAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACG
[0040]0421 TTAGTGTCTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGG[0041 ] 0481 TAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTT
[0042]0541 TGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAG
[0043]0601 CTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGG
[0044]0661 AAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGC
[0045]0721 GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGC
[0046]0781 CGTTGGGAACCTTGAGTTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAG
[0047]0841 TACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT
[0048]0901 GTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTC
[0049]0961 CAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCT
[0050]1021 CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCA[0051 ] 1081 GCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT
[0052]1141 GACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTAC
[0053]1201 AAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCG
[0054]1261 CAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCAC
[0055]1321 GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAC
[0056]1381 CAGAAGTAGCTAGTCTAACCCTCGGGAGGACGGTACCAT
[0057]基于菌落特征、菌株的形态、生理生化特征与16SrRNA测定结果，将筛选到的菌株鉴定并命名为假单胞菌Pseudomonas fragi YB。该菌株YB已于2013年10月18日保藏于“中国微生物菌种保藏中心管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)”，保藏登记号为CGMCC N0.8398ο
[°°58] 实施例2.为假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株在不同低温条件下的生长情况与生长曲线。
[0059]为研究假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株对在不同温度下的生长情况，按10%的接种量将菌悬液接种到不同温度条件下的LB液体培养基中，转速180r/min培养，48h后测定培养液的OD6qq。实验中设定的温度分别为4 °C、7 °C、1 °C、16 °C、20 °C、28 °C和37 °C。
[0060]为研究假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株在5°C、8°C、10°C和15°C下的生长规律，按10%的接种量将菌悬液接种到相应温度条件下的LB液体培养基中，转速180r/min培养，实验周期为96h，每隔6h取培养液，测定其OD6qq。根据实验结果绘制假单胞菌Pseudomonas fragi YB在低温条件下的生长曲线。
[0061]假单胞菌Pseudomonasfragi YB菌株在4°C、7°C、10°C、16°C、20°C、28°C和37°C条件下生长情况如图2(A)。实验结果表明，菌株YB可以耐受低温条件，4°C仍然可以正常生长，但是生物量相对较低。随着温度逐渐升高到7°C，生物量开始增加。当温度为10°C?16°C时，菌株YB的生物量达到最大值。当温度高于20°C时，菌株生物量随着温度升高，反而下降，当温度为37°C时，菌株几乎不生长。因此，菌株YB的最适生长温度是10°C?16°C，为典型的耐低温细菌。
[0062]假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株在5°C、8°C、10°C和15°C的生长曲线见图2(A)。菌株YB的生长周期一般为78h。其中，适应期约为O?18h;18?54h为对数生长期;54h后进入稳定期。
[0063]实施例3.假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株在低温条件下对⑶D、NH3-N和TP的去除
[0064]北方冬季处理厂污水温度一般为8°C?15 °C之间。在下述所有应用假单胞菌Pseudomonas fragi YB去除污水C0D、NH3_N和TP的实验中均选择8°C为低温实验条件，污水的初始C0D、NH3-N和TP分别为544mg/L、14mg/L、12mg/L。以10%的接种量将其菌株加入装有1001^人工配制污水的25011^三角瓶中，在8°(:、18(^/1^11条件下培养，分别在0、24、48、72、96、120、144、168、19211后取出样品及空白样，培养液经800(^/1^11离心去除菌体，然后取上清液分别测其COD、NH3-N, TP，计算出每种菌株对污水中污染物质的去除效果。每个实验3个平行。
[0065]假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株在低温条件下，对人工配制污水中C0D、NH3_N和TP的去除效果分别见图3-1、3-2和3-3。如图所示，经过192h的作用后，菌株YB可同时去除污水中COD、NH3-N和TP，去除率分别为52 %、41 %和18 %。由此可见，本发明提供的假单胞菌Pseudomonas fragi YB菌株可在低温条件同时去除污水中C0D、NH3_N和TP，具备良好的应用前景。
【主权项】
1.一株耐低温的假单胞菌，该菌株为假单胞菌(Pseudomonasfragi)，编号为YB已于2013年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC N0.8398ο2.保藏号为CGMCCN0.8398的假单胞菌(Pseudomonas fragi)具有良好的耐低温特性，生长温度范围为4°C?28°C，最适生长温度是10°C?16°C，当温度为37°C时，菌株YB几乎不生长，属于典型的耐低温细菌。3.如权利要求2中所述的利用保藏号为CGMCCN0.8398的假单胞菌(Pseudomonasfragi)，在8°C的低温实验条件下，对从工配制污水中的C0D、NH3-N和TP进行去除。污水初始C0D、NH3-N和TP分别为54411^/1、1411^/1、1211^/1，经过19211的反应后，菌株￥8可同时去除污水中C0D、NH3-N和TP，去除率分别为52%、41 %和18%。
【文档编号】C02F3/34GK105907678SQ201610304708
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】王小雨, 周丹丹, 范伟, 毛娟
【申请人】东北师范大学