一种枯草芽孢杆菌j-5及其生物菌剂和应用
【专利摘要】本发明提供了一种保藏号为CGMCCNo.11750的枯草芽孢杆菌(Busillus subtilis)，以及含有此枯草芽孢杆菌的微生物菌剂，还提供了所述枯草芽孢杆菌或微生物菌剂在防治番茄、黄瓜、草莓等果蔬灰霉病中的应用，本发明提供的保藏号为CGMCCNo.11750的枯草芽孢杆菌及含有该菌的微生物菌剂对灰霉病菌有很强的拮抗作用，且见效快，防效持续时间长。利用本发明筛选出的枯草芽孢杆菌菌株可以制成相应的微生物制剂，将制得的微生物菌剂施用到田间后，通过该枯草芽孢杆菌的作用能够防治番茄、黄瓜、草莓等蔬菜灰霉病的发生，从而降低果蔬生产过程中化学农药的施用。CGMCC No. 1175020151127
【专利说明】
一种枯草芽孢杆菌J-5及其生物菌剂和应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌J-5及其生物菌剂和应用。
【背景技术】
[0002] 灰霉菌(Botrytis cinerea)，又称灰葡萄孢菌，是一类世界性分布的真菌，它是一 种广寄主性的、能够引起200多种已知植物(如水果、蔬菜及花卉)灰霉病的坏死营养型病原 真菌。以菌核、分生孢子及菌丝体随病残组织在土壤中越冬，通过伤口、自然孔口及幼嫩组 织侵入寄主，发病后又可产生大量分生孢子，借风雨传播蔓延进行多次再侵染，引起灰霉 病，花、果、叶、茎均可发病，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重 要病害之一。
[0003] 在黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓等上，灰霉病病苗色浅，叶片、叶柄发病呈灰白色，水 渍状，组织软化至腐烂，高湿时表面生有灰霉。幼茎多在叶柄基部初生不规则水浸斑，很快 变软腐烂，缢缩或折倒，最后病苗腐烂枯萎病死。果实染病，青果受害重，残留的柱头或花瓣 多先被侵染，后向果实扩展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉层，呈水腐状，叶片发 病从叶尖开始，沿叶脉间成"V"形向内扩展，灰褐色，边有深浅相间的纹状线，病键交界分 明。染病地块轻则减产20%，严重的减产50%以上。
[0004] 目前灰霉病已成为黄瓜、番前、前、甜椒、草莓生产上的一种主要病害，对黄瓜、番 茄、茄、甜椒、草莓产量和品质构成了极为严重的威胁，该病目前主要通过杀菌剂类化学农 药进行防治，但是效果不佳且对环境污染较为严重，急需寻找低污染、高防效的灰霉病防治 方式。
[0005] 利用拮抗微生物防治农作物病害由于具有低污染、低残留、不引起病害抗性等优 点，近年来得到广泛的重视。该防治方式的关键是筛选出对病原微生物有拮抗作用且抑菌 谱广的拮抗微生物，并利用菌剂或者其代谢产物粗提取物形成生物制剂，在黄瓜、番茄、茄、 甜椒、草莓的灰霉病防治上进行应用。目前已有一些用于灰霉病生物防治的生防制剂，但大 多抑菌效果不够理想，抑菌谱窄，且作用持续时间短。因此，迫切需要筛选出一种能够高效、 持久拮抗灰霉病病源菌的微生物菌株及相关的微生物菌剂，从而通过生物防治降低灰霉病 给黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓生产带来的危害。
【发明内容】
[0006] 基于以上技术现状，本发明的目的在于提供一种能够有效、持久抑制灰霉菌生长， 尤其是能够高效拮抗黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌菌株，并且本发明还 提供了一种含有上述枯草芽孢杆菌菌株的用于防治灰霉菌感染所致的黄瓜、番茄、茄、甜 椒、草莓灰霉病的生物菌剂。
[0007] 为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下： 本发明所述的枯草芽孢杆菌J-5于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为:CGMCC No. 11750。
[0008] 本发明还提供了含有所述枯草芽孢杆菌J-5的生物菌剂，其中枯草芽孢杆菌J-5的 含量为4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g菌剂。
[0009] 所述生物菌剂为枯草芽孢杆菌J-5的芽孢菌剂的混合菌剂。
[0010] 本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌J-5及其菌剂在防治黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓 等果蔬灰霉病中的应用。
[0011] 本发明的有益效果为： 本发明的枯草芽孢杆菌J-5可以有效抑制灰霉菌感染所致的黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓 灰霉病，具有高效的防治作用，有效率可以达到60%以上，且见效快，作用持续时间长。作为 生物介入手段，可以避免化学品如农药引起的残留和污染，是一种更经济、环保、绿色的植 物病害防治手段。
[0012] 本发明的枯草芽孢杆菌J-5可以制成多种生物菌剂，或作为有效成分添加到现有 生物菌剂中，当制成芽孢菌剂时，可适应多种保存环境，并具有较长的保质期，在常温常压 下，可保存1 -3年，利于仓储和运输。
[0013] 生物样品保藏信息 枯草芽孢杆菌J-5，分类命名为ifeciDus 已于2015年11月27日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No. 11750。
【附图说明】
[0014] 图1为枯草芽孢杆菌J-5在固体LB培养基上培养48小时的菌落形态。
[0015]图2为枯草芽孢杆菌J-5复红染色后的光学显微镜下的形态。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1对黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病具有拮抗作用的细菌的分离、筛选 米集灰霉病害发病严重黄瓜、番前、前、甜椒、草莓地块中的健康植株根际土壤作为试 验材料，在实验室内从该样品中进行细菌分离，在LB培养基上进行多次分离纯化，得到纯培 养菌落后，以番茄灰霉病菌为指示菌，采用对峙试验方法进行拮抗性能高的菌株的筛选。
[0017] 具体步骤:上述土壤样品来自河北省、宁夏、山东、山西等地的染有灰霉病害的黄 瓜、番茄、茄、甜椒、草莓种植田地中，将该土壤经梯度稀释后涂布于PB培养基中，于28°C恒 温培养箱培养。上述培养基根据"微生物培养基手册"的记载制备得到，培养基配方为:牛肉 膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，自来水100〇1111，？!17.2~7.4，121°(：灭菌2〇1^11后使用。 待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到 单菌落的纯培养物，纯化后的菌株保存于PB培养基斜面。
[0018] 以番茄灰霉菌为指示菌，采用十字交叉法测定不同菌株对灰霉菌生长的抑制率。 将筛选出的细菌菌株点接在距平板中央3cm处的4个角上，平板中央同时接种直径5mm的 活化的番茄灰霉病菌块，每个菌株重复三次，28 °C恒温培养5d，测量、记录抑菌圈直径的大 小并计算平均抑制率。筛选出了对番茄灰霉菌拮抗作用最强的菌株J-5。
[0019] 并对该菌株进行了保藏，保藏号为CGMCC No. 11750。
[0020] 实施例2拮抗菌株遗传稳定性的确定 将菌株J-5在PB培养基上采用划线法进行传代培养，培养20代后，采用平板对峙法测定 传代后的J-5菌株对番茄灰霉菌的拮抗效果，以原始J-5菌株为对照，该拮抗菌株经过20代 培养后与原始菌株具有相同的拮抗作用，说明该拮抗菌株具有良好的遗传稳定性，将抑菌 效果稳定的拮抗菌进行PB培养基液体培养，吸取菌液进行-80°C甘油保存。
[0021]实施例3拮抗菌株的鉴定 根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的保藏号为 CGMCC No. 11750的菌株J-5进行鉴定，菌落形态观测是在1?培养基上进行的，将菌株划线接 种后，于28°C恒温培养24小时观察菌落形态。保藏号为CGMCC No. 11750的菌株的菌落近圆 形，边缘啮蚀状，脐突状突起，表面皱褶，颜色为乳白色，无光泽不透明，与培养基结合不紧 密。挑取培养24小时菌苔革兰氏染色后在光学显微镜的100倍油镜下观察。在显微镜下可 以看到，保藏号为CGMCC No. 11750的菌株为芽孢杆菌，革兰氏阳性菌，芽孢位置中生或近中 生，芽孢膨大，无伴孢晶体，单个出现。初步确定为芽孢杆菌。
[0022] 16SrDNA鉴定：将保藏号为CGMCC No. 11750的菌株接种到1?培养液，28°C摇床培 养24 h，采用天根生化科技（北京）有限公司基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组 0嫩，然后以提取的总0祖作为模板，以上游引物小27(5/^6461'11^^〇^6(：1^6-3 /)和下 游引物R1492 (5。TACGGCTA CCTTGTTA CGAC TT -3 〇引物对进行PCR扩增。PCR反应体系 为25 μL，反应体系为:基因组DNA lyL，10XPCR buffer 2.5yL，F27引物0.5yL，Ri492引物0.5 yL，dNTPs 2yL，Taq 酶（5U/yL) 0.25yL，ddH20 18.25yL。反应条件为：95°C 预变性5 min; 95°C变性30s，50°C退火lmin，72°C延伸2min，循环30次;72°C 10 miruPCR产物用1%琼脂糖 凝胶进行电泳检测，将PCR条带大小约为1500bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测 序后，将获得的DNA序列(见序列1)，输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行 比较分析。利用MEGA4.1进行系统发育树的构建。经过序列分析显示，保藏号为CGMCC No. 11750的菌株属于枯草芽孢杆菌。
[0023]实施例4-7枯草芽孢杆菌J-5的番茄种植田间应用 将保藏号为CGMCC No. 11750枯草芽孢杆菌菌株接种到装有15L 1?液体培养基的30L发 酵罐中，于28°C、180r/min的恒温条件下培养36小时，离心获得枯草芽孢杆菌的芽孢，然后 喷雾干燥，用可溶性淀粉混匀该菌的芽孢干粉，形成终浓度为4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g的 芽孢制剂。
[0024]在河北省青县和泊头市两地区的番茄连作田对番茄灰霉病进行芽孢杆菌剂的田 间试验。将芽孢制剂和水1:300的重量比悬溶后分别喷施在番茄定植10天后、开花期和初果 期，每次使用剂量为每亩300g芽孢制剂;常规对照使用常规剂量的化学农药高巧作为防治 药物，空白对照不施用防治药物但施加与实施例组相同重量的水;每个处理3次重复，调查 番前灰霉病的发病情况。
[0025]调查方法： 在成熟期采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查株发病率与病情 指数，记录总调查株数、总发病株数。
[0026]番茄灰霉病病情指数分级标准： 0级:全株无害病斑；1级：少数叶片发病至全株下部1/4以下的叶片有病斑;2级:全株 中下部1/2以下的叶片有病斑或者茎杆分枝上有病斑;3级:全株3/4以下部位的叶片有病斑 或者单个分支茎杆枯死和单株有1~2个果实发病腐烂;4级:全株3/4以上的叶片发病枯黄或 者茎杆枯死，单株有2个以上的果实发病腐烂。
[0027]防效计算方法： 番前株发病率=总发病株数/总调查株数X 100 病情指数=Σ (发病株数X该发病株级值)/(总调查株数X最高级值）X 100 防治效果(％)=(对照区病情指数一处理区病情指数)/对照区病情指数X100 防治效果如表1所示，J-5芽孢菌剂对番茄灰霉病具有良好的防效，在施用J-5芽孢菌剂 的情况下番茄灰霉病发病率和病情指数均降低，不同实施例的防病效果均在80%以上。 表1不同菌剂施用对番茄灰霉病的防治效果
[0028]实施例8-11枯草芽孢杆菌J-5的黄瓜种植田间应用 将保藏号为061〇：如.11750枯草芽孢杆菌菌株接种到装有151^1^液体培养基的3(^发 酵罐中，于28°C、180r/min的恒温条件下培养36小时，离心获得枯草芽孢杆菌的芽孢，然后 喷雾干燥，用可溶性淀粉混匀该菌的芽孢干粉，形成终浓度为4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g的 芽孢制剂。
[0029]在河北省衡水市和泊头市两地区的黄瓜田地对灰霉病进行芽孢杆菌剂的田间试 验。将芽孢制剂和水1:300的重量比悬溶后分别喷施在黄瓜定植10天后和开花期，每次使用 剂量为每亩300g芽孢制剂;常规对照使用常规剂量的化学农药高巧作为防治药物，空白对 照不施用防治药物但施加与实施例组相同重量的水;每个处理3次重复，调查黄瓜灰霉病的 发病情况。
[0030] 调查方法： 在成熟期采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查株发病率与病情 指数，记录总调查株数、总发病株数。
[0031] 黄瓜灰霉病病情指数分级标准： 0级:无病症； 1级:接种叶出现少量病斑； 2级:病斑面积占叶面积的1/3; 3级:病斑面积占叶面积的1/3-1/2; 4级:病斑面积占叶面积的1/2-2/3; 5级:病斑面积占叶面积的2/3以上 防效计算方法： 黄瓜株发病率=总发病株数/总调查株数X 100 病情指数=Σ (发病株数X该发病株级值)/(总调查株数X最高级值）X 100 防治效果(％)=(对照区病情指数一处理区病情指数)/对照区病情指数X100 利用J-5芽孢菌剂在河北省衡水市和泊头市两地区进行黄瓜灰霉病的防治试验，结果 见表2,使用该芽孢菌剂可降低黄瓜灰霉病发病率、降低病情指数，防病效果在80%以上。
[0032]表2不同菌剂施用对黄瓜灰霉病的防治效果
[0033]实施例12-15枯草芽孢杆菌J-5的草莓种植田间应用 将保藏号为061〇：如.11750枯草芽孢杆菌菌株接种到装有151^1^液体培养基的3(^发 酵罐中，于28°C、180r/min的恒温条件下培养36小时，离心获得枯草芽孢杆菌的芽孢，然后 喷雾干燥，用可溶性淀粉混匀该菌的芽孢干粉，形成终浓度为4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g的 芽孢制剂。
[0034]在河北省栾城和邯郸两地区的草莓连作大棚对灰霉病进行芽孢杆菌剂的田间试 验。将芽孢制剂和水1:300的重量比悬溶后喷施在草莓初果和植株叶片上，过七天进行调查 灰霉病情况，使用剂量为每亩1〇〇克芽孢制剂;常规对照使用常规剂量的化学农药高巧作为 防治药物，空白对照不施用防治药物但施加与实施例组相同重量的水;每个处理3次重复， 调查草莓灰霉病的发病情况和产量。
[0035]调查方法： 在成熟期采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查株发病率与病情 指数，记录总调查株数、总发病株数。
[0036]草莓灰霉病病情指数分级标准： 〇级:无病症； 1级:病斑面积占整个果面的5%以下； 3级:病斑面积占整个果面的6%~10%以下； 5级:病斑面积占整个果面的11%~25%以下； 7级:病斑面积占整个果面的26%~50%以下； 9级:病斑面积占整个果面的50%以上。
[0037] 防效计算方法： 番前株发病率=总发病株数/总调查株数X 100 病情指数=Σ (发病株数X该发病株级值)/(总调查株数X最高级值）X 100 防治效果(％)=(对照区病情指数一处理区病情指数)/对照区病情指数X100 防治效果如表3所示，使用该芽孢菌剂可降低草莓灰霉病发病率、降低病情指数，7天防 病效果即可达90%以上。
[0038]表3不同菌剂施用对草莓灰霉病的防治效果
[0039]由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为CGMCC No. 11750的菌株对草莓灰 霉病有良好的拮抗作用，其芽孢菌剂能够有效防治草莓大棚灰霉病的发生。
[0040] 实施例16-19枯草芽孢杆菌J-5的甜椒种植田间应用 将保藏号为061〇：如.11750枯草芽孢杆菌菌株接种到装有151^1^液体培养基的3(^发 酵罐中，于28°C、180r/min的恒温条件下培养36小时，离心获得枯草芽孢杆菌的芽孢，然后 喷雾干燥，用可溶性淀粉混匀该菌的芽孢干粉，形成终浓度为4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g的 芽孢制剂。
[0041] 在河北省栾城和邯郸两地区甜椒连作大棚已感染灰霉病的甜椒幼苗(病情指数为 1.25%)进行芽孢杆菌剂的田间试验。将芽孢制剂和水1:300的重量比悬溶后喷施在甜椒叶 片上，亩用量l〇〇g，间隔期7天喷施第二次，分别在第二次喷施后7天、30天和45天进行调查 灰霉病情况。
[0042]调查方法： 采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查病情指数。
[0043]甜椒灰霉病病情指数分级标准： 〇级:无病症； 1级:接种叶出现少量病斑； 2级:病斑面积占叶面积的1/3; 3级:病斑面积占叶面积的1/3-1/2; 4级:病斑面积占叶面积的1/2-2/3; 5级:病斑面积占叶面积的2/3以上 防效计算方法： 病情指数=Σ (发病株数X该发病株级值)/(总调查株数X最高级值）X 100 防治效果(％)=(初始病情指数-调查时病情指数)/初始病情指数X 100 表4不同菌剂施用对甜椒灰霉病的防治效果
[0044」由表4结果显示，使用该芽孢菌剂可有效防治甜椒灰霉病，施用7天后，不同浓度J-5芽孢菌剂对甜椒灰霉病的防效均在80%以上，与化学农药的常规对照防治效果相当。与常 规对照相比，J-5芽孢菌剂更为持久，45天后防效均在60%以上。明显高于对照的28.56%。 [0045]由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为CGMCC No. 11750的菌株对甜椒灰 霉病有良好的拮抗作用，其芽孢菌剂能够有效防治甜椒大棚灰霉病。
[0046]本发明枯草芽孢杆菌对番茄、黄瓜、茄、甜椒和草莓具有相当的防治效果，以上仅 为本发明的较佳实施方式，而非对其保护范围的限制，本领域技术人员在不需要付出创造 性劳动的前提下对本发明做出的任何改进，均应认为在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种枯草芽孢杆菌J-5,该枯草芽孢杆菌于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为:CGMCC No. 11750。2. 含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌J-5的生物菌剂，其特征在于:其中每克菌剂中枯 草芽孢杆菌J-5的含量为4 X 109cfu/g~7 X IO9Cfu。3. 根据权利要求2所述的生物菌剂，其特征在于:所述菌剂为枯草芽孢杆菌J-5的芽孢 菌剂或芽孢与菌体的混合菌剂。4. 权利要求1所述的枯草芽孢杆菌J-5在防治作物灰霉病中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述作物为黄瓜、番茄、茄、甜椒或草莓。6. 权利要求2或3所述的生物菌剂在防治作物灰霉病中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述作物为黄瓜、番茄、茄、甜椒或草莓。
【文档编号】A01N63/02GK105907680SQ201610359661
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】贾振华, 金伟伟, 黄亚丽, 宋水山, 马宏, 宋聪, 张立文
【申请人】河北省科学院生物研究所