一株降解苯酚类化合物的菌株及其应用
【专利摘要】本发明涉及一株降解苯酚类化合物的菌株及其应用，所述的菌株分类命名为Sphingomonas paucimobilis DL?10，已于2014年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO：M 2014058。其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。菌株DL?10为好氧型微生物，最适生长温度为30℃，最适生长pH为6.0，NaCl浓度高于3%时其生长即受到明显的抑制。菌株DL?10在12 h内可以完全降解100 mg/L的苯酚，并利用其作为唯一碳源生长，可以完全降解邻苯二酚、对苯二酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚、2,6?二甲基苯酚、3,5?二甲基苯酚、2,6?二甲基对苯二酚等苯酚类化合物降解。本发明对于工业废水中苯酚类化合物的生物治理上具有重要的应用价值。CCTCC NO：M201405820140303
【专利说明】
一株降解苯酚类化合物的菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解苯酚类化合物的菌株及其 应用。
【背景技术】
[0002] 含酚废水的来源广泛、成分复杂，如医药废水、焦化废水、化工及印染废水等，废水 中含有的高浓度酚类化合物会对微生物的生长产生抑制作用，从而增加生物处理的难度， 成为现阶段国内外含酚废水处理技术领域亟待解决的一个难题。
[0003] 生物降解是农药在环境中的一类重要转化过程。微生物由于大量存在于自然界、 并且具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，在农药的生物降解过程中起到了 重要作用。当前国内研究者已分离到一些能降解酚类化合物微生物，但主要集中在苯酚的 降解，其衍生物的微生物降解情况较少。聂玉冰等分离到两株微生物Alcaligenes faecalis TF1 和Acinetobacte calcoaceticus TF2在20h内可以降解 110mg/L的苯酸。许甜 甜等分离到两株微生物〇61代丨3 8口31'1'-1和5口11；[1^01]10的8 8。]1'1'-3在共代谢的情况下 48h内可以降解500mg/L的苯酚。因此，筛选高效广谱降解苯酚衍生物的菌株，在工业废水的 生物治理上具有潜在的应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对工业含酚废水对生物会产生高毒性，而现有微生物对苯酚衍 生物降解量较少的问题，提供一种高效广谱降解苯酚及其衍生物的微生物。
[0005] 为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -株降解苯酚类化合物的菌株，所述微生物为少动鞘氨醇单胞菌，其分类命名为 Sphingomonas paucimobilis DL-10,已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号 为:CCTCC Ν0:Μ 2014058,保藏日期为:2014年3月3日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0007] 本发明所述的菌株DL-10,其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所 不。
[0008] 本发明所述的Sphingomonas paucimobilis DL-10筛选方法:在以苯酸为唯一碳 源的无机盐养基(pH 7.0)中，对含酚工业废水中的苯酚降解菌株进行分离筛选。
[0009] 具体地，以含酚工业废水菌群作为筛选目标，利用含l〇〇mg/L苯酚的无机盐培养基 作为介质，连续富集驯化具有苯酚利用能力的菌株，将无机盐培养基稀释涂布至含有 100mg/L苯酚的无机盐固体培养基，30°C培养2-3d，挑取形态不同的苯酚类化合物降解菌株 进行划线分离获得纯培养，命名为菌株DL-10,再次验证纯种微生物菌株DL-10对苯酚降解 能力，利用液相色谱检测苯酚残余含量。
[0010] 具体地，所述的无机盐培养基是由硝酸铵1. 〇g，氯化钠1. 〇g，磷酸二氢钾〇. 5g，磷 酸氢二钾1.5g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121°C灭菌 20min，使用前添加终浓度100mg/L的苯酸作为碳源。
[0011] 本发明所述的Sphingomonas paucimobilis DL-10在1/3LB固体培养基上生长较 快，30 °C，48h可形成直径为2mm的黄色菌落，菌落边缘整齐，有光泽，突出，粘稠，湿润，光滑， 不透明，菌体呈长杆状(0· 8 X 1 ·8μηι)。Sphingomonas paucimobilis DL-10的V-P试验、尿酶 试验、接触酶试验为阳性，甲基红试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、脂酶试验、吲哚 试验、精氨酸双水解试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、产硫化氢试验、苯丙氨酸脱氨酶 试验为阴性，菌株DL-10生理生化鉴定的结果与鞘氨醇单胞菌属的特征最为接近。
[0012] 具体地，所述的1/3LB培养基是由蛋白胨3.0g，酵母粉1.5g，氯化钠3.0g，加水至 1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121°C灭菌20min。
[0013] 本发明的另一目的是构建含有该苯酚类化合物降解菌株16S rDNA序列的克隆载 体以及含有该载体的工程菌株，在分子水平上对苯酚降解菌株进行鉴定。
[0014] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0015] 一种含有本发明所述的苯酸降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10 16S rDNA序列的克隆载体。
[0016] 所述的重组克隆载体，优选出发载体为pMD19T。
[0017] 含所述的苯酸降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10 16S rDNA序列的基 因工程菌Escherich coli DH5a(pMD19T-16S)〇
[0018] 所述的基因工程菌Escherich coli DH5a构建方法：利用引物27F:5'_ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'扩增菌株DL-10的 16S rDNA， 通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克 隆宿主菌Escherich coli DH5a获得重组微生物Escherich coli DH5a(pMD19T-16S)，将所 获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16SrDNA序列，在分子水平上将菌 株DL-10鉴定至鞘氨醇单胞菌属。
[0019] 本发明的又一目的是提供该苯酚降解菌株在苯酚类化合物降解中的应用。
[0020] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0021 ] 一株苯酸类化合物降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10在废水处理过程 中的应用，具体步骤如下：
[0022] (1)菌株DL-10种子液培养:从1/3LB平板上挑取菌株DL-10单菌落，分别接种于3mL 1/3LB液体培养基中于30°C，摇床180r · mirT1培养48h。然后将该菌株的培养液转接到20mL 新鲜的液体1/3LB培养基中，继续培养18Κ6000γ · mirT1离心10min，收集菌体，用灭菌的无 机盐培养基洗涤一次后，制成〇〇6(Χ)γ?= 1.0的菌悬液，即种子液。
[0023] (2)菌株DL-10降解苯酚的动力学:在苯酚终浓度为100mg/L的无机盐培养基中，按 5%接种量接入种子液，于30°(：，18(^.111^1震荡培养，每隔211取样一次，测定006()() 1?和苯酚 的残留浓度。
[0024] (3)温度和pH对菌株DL-10降解苯酚的影响：在苯酚终浓度为lOOmg/1的无机盐培 养基中，按5 %接种量接入种子液，分别于20 °C、25 °C、30 °C、37 °C、42 °C，pH 7 · 0，180r · min-1 震荡培养;分别于初始pH 4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，30°C、180r · mirT1震荡培养，测定温度和 pH对菌株DL-10降解苯酚的影响。
[0025] (4)底物初始浓度和接种量对菌株DL-10降解苯酚的影响：在苯酚终浓度为100mg/ L的无机盐培养基中，分别按1%、3%、5%、10%的接种量接入种子液于30°C，180r · mirT1震 荡培养;分别在苯酸终浓度为5011^凡、10011^凡、20011^凡、30011^凡、40011^凡、50011^凡的无机 盐培养基中，按5%接种量接入种子液，于30°(：，18(^*1^1^震荡培养，测定底物初始浓度和 接种量对菌株DL-10降解苯酚的影响。
[0026] (5)菌株DL-10对苯酚类化合物的降解能力测定:分别在终浓度为lOOmg/1的含苯 酚，邻苯二酚，对苯二酚，邻甲基苯酚，间甲基苯酚，3,5_二甲基苯酚，3,4_二甲基苯酚，2,6_ 二甲基苯酚的无机盐培养基中，按5%接种量接入种子液，于30°C，180r · mirT1震荡培养，测 定菌株DL-10对苯酸类化合物的降解能力。
[0027] 将苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚、对甲基苯酚、2,6-二甲基 苯酚、3，5-二甲基苯酚等苯酚类化合物等浓度混合，终浓度达到500m g//L作为菌株DL-10降 解底物，接种量10 %，于30°C，180r · min-1震荡培养48h后，测定菌株DL-10对苯酚类化合物 混合物的降解能力。
[0028] 本发明以化工废水为分离材料，分离纯化到一株可以高效广谱的降解酚类衍生物 的微生物，对降解基因资源的开发利用和工业废水修复非常具有现实意义。
[0029]与现有技术相比，该菌株对苯酸类的降解是高效，对500mg/L苯酸类混合物在48h 降解率达到80%以上，降解明显高于现在国内的苯酚降解菌。此外，该菌株对苯酚类的降解 是广谱的，它可以降解邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚等苯二酚，也可以降解邻甲基苯酚、间 甲基苯酚等单甲基苯酚类化合物，还可以降解3，5-二甲基苯酚、2，6-二甲基苯酚、2，6-二甲 基对苯二酚等二甲基苯酚类化合物，降解谱有丰富的多样性，适合应用在工业废水的生物 治理上。
【附图说明】
[0030]图1是菌株DL-10降解苯酚效果图。
[0031]图2是菌株DL-10的电镜图片。
[0032]图3a是温度对菌株DL-10生长的影响示意图。
[0033]图3b是pH值对菌株DL-10生长的影响示意图。
[0034]图3c是装液量对菌株DL-10生长的影响示意图。
[0035]图3d是盐浓度对菌株DL-10生长的影响示意图。
[0036]图4是苯酚降解曲线及菌株DL-10生长曲线。
[0037]图5a是温度对菌株DL-10降解苯酚的影响示意图。
[0038]图5b是pH值对菌株DL-10降解苯酚的影响示意图。
[0039]图5c是底物初始浓度对菌株DL-10降解苯酚的影响示意图。
[0040]图5d是接种量对菌株DL-10降解苯酚的影响示意图。
[0041 ]图5e是金属离子对菌株DL-10降解苯酚的影响示意图。
[0042] 本发明所述的生物材料，其分类命名为Sphingomonas paucimobilis DL-10,已保 藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:M2014058，保藏日期 为:2014年3月3日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合【附图说明】和具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但不应视为 对本发明保护范围的限制。下述的实施例中所使用的实验方法无特殊说明均为常规方法。 下述的实施例中所使用的实验试剂耗材等无特殊说明均可从商业用途购买。
[0044] 实施例1
[0045] 苯酸降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10的分离筛选：
[0046] 取5mL含酸工业废水样品置于100mL含50mg/L苯酸的无机盐培养基中，于30°C、 180r · mirT1培养2-3d。用紫外扫描仪测定富集液对苯酸的降解情况，确定苯酸被降解后，以 10%的接种量接入到含75mg/L苯酚无机盐培养基中，继续富集并测定降解情况，按此方法 直至苯酚浓度提高至200mg/L，并传代3次。
[0047]将苯酚富集液经梯度稀释后涂布以100mg/L苯酚为唯一碳源的无机盐培养基平板 上，于30°C培养箱中分别培养2-3d。将平板上长出的菌落形态不同的单菌落分别划线于1/ 3LB平板纯化，并接种于以50mg/L苯酸为唯一碳源的无机盐培养基中，于30°C、180r · mirT1 摇床培养2d后，取2mL样品离心收集上清，在波长200-350nm范围内进行紫外扫描，苯酚最大 吸收峰为240nm和280nm，根据特征吸收峰的变化情况来确定富集液和菌株对苯酚的降解能 力。如图1所示，通过紫外扫描发现，编号为DL-10的菌株可以使苯酚的紫外吸收图谱消失。 [0048]上述无机盐培养基是由硝酸铵1.0g，氯化钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾 1.5g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121°C灭菌20min，使用 前添加苯酚作为碳源。
[0049] 上述1/3LB培养基是由蛋白胨3.0g，酵母粉1.5g，氯化钠3.0g，加水至1.0L配制，调 节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121°C灭菌20min。
[0050]将DL-10降解苯酚前后的培养液冷冻干燥后用2mL的甲醇溶解，过0.22um有机滤 膜，样品用于高效液相色谱检测（HPLC)。未接菌的对照培养液中苯酚的保留时间为 3.97min，而接种菌株DL-10并培养24h后，培养液中苯酚的含量明显下降，但是苯酚开环后 的产物极容易降解，不会形成累积，所以没有检测到中间代谢产物。
[0051 ] 实施例2
[0052] 苯酸降解菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10的鉴定及其生长特性：
[0053] DL-10 的鉴定：
[0054] 对DL-10进行 16S rDNA鉴定：利用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R: 5' -TACCTTGTTACGACTT-3'扩增菌株DL-10的16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克 隆载体PMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coli DH5a获得重组微生物Escherich coli DH5a(pMD19T_16S)，将所获得的重组微生物外源片 段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上将菌株DL-10鉴定至鞘氨醇单 胞菌属，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0055] DL-10的生长特性：
[0056] Sphingomonas paucimobilis DL-10在LB平板上生长较慢，30°C，96h可形成直径 为2_的黄色菌落，菌落边缘整齐，有光泽，突出，粘稠，湿润，光滑，不透明。其电镜图片中菌 体呈长杆状，大小为〇.8X 1.8μπι，如图2所示，基于其16S rDNA序列以及生理生化特征，菌株 DL-10 被鉴定为 Sphingomonas 属。
[0057] 菌株DL-10的最适生长温度为30°C，在37°C也可以很好的生长，但在较低温度（20 °(：和25°〇和较高温度(42°C)时，其生长则受到明显抑制。菌株DL-10在pH为6和7时，生长良 好，其最适生长pH为6;当pH为5和8时，其生长就受到明显抑制，菌株DL-10生长时随着摇瓶 装液量的增加其生长量下降，表明菌株DL-10也是好氧型微生物。菌株DL-10在NaCl浓度为 2%时生长良好;当NaCl浓度为3%时其生长即受到明显的抑制，如图3a-3d所示。
[0058] 实施例3
[0059] 苯酸降解菌Sphingomonas paucimobilis DL-10的降解特性：
[0060]从1/3LB平板上挑取菌株DL-10单菌落，分别接种于3mL 1/3LB液体培养基中于30 °C，摇床180r · mirT1培养48h。然后将该菌株的培养液转接到20mL新鲜的液体1/3LB培养基 中，继续培养1811。600〇1· · mirT1离心10min，收集菌体，用灭菌的无机盐培养基洗涤一次后， 制成0D_· = 1 · 0的菌悬液，即种子液。
[0061] 在苯酚终浓度为100mg/L的无机盐培养基中，按5%接种量接入0D6Q()nm=1.0菌株 DL-10种子液，于30°C、180r · min-1震荡培养，每隔2h取样一次，测定0D6mn4P苯酚的浓度。 [0062]由图4可以看出，菌株DL-10接种到培养基中2h，就开始降解苯酚，而没有明显的延 滞现象;之后降解速率逐渐增加，到12h就已将100mg/L的苯酚基本降解完全。另外，从图中 还可以看出，随着苯酚的降解，菌株DL-10的生长量经历了2h的停滞后，开始逐渐增加；当苯 酚完全降解以后，菌株DL-10的生长量也达到最大;并且在12-14h时，由于培养基中已无苯 酚可利用，这时菌株DL-10的生长量开始下降。该结果表明菌株DL-10可以利用苯酚进行生 长。
[0063] 菌株DL-10在25°C和30°C时，对苯酚的降解率基本相同；而在37°C时，苯酚的降解 率就受到明显抑制；当温度为42°C时，几乎不降解苯酸，如图5a所示。菌株DL-10在降解苯酚 时对pH的适应范围很宽，在pH 5-9之间均具有很好的效果；即使在pH为4时，苯酚的降解率 也可以达到57%。将此结果与菌株DL-10的生长pH相比，发现其降解pH范围比生长pH范围宽 的多，说明菌株DL-10产生的降解酶具有较强的pH适应性，如图5b所示。菌株DL-10对苯酚的 降解速率随着底物浓度的增加而降低。当苯酚初始浓度为50mg/L时，其在12h的降解率为 95.5% ;而当苯酚初始浓度为200mg/L时，其在12h的降解率仍然可以达到75.3%，说明该菌 株对苯酚具有高效的降解效率如图5c所示。随着接种量的增大，苯酚的降解速率明显增加。 当接种量为1 %时，苯酚在12h的降解率为67.3% ;而当接种量为5%和10%时，苯酚分别在 10h和6h时即基本降解完全如图5(1所示。Fe2+、Ca 2+、Mg2+和Ba2+对菌株DL-10的降解能力几乎 没有影响;Zn 2+对菌株DL-10的降解能力有轻微的抑制作用;而Cu2+、Cr3+、C 〇2+、Mn2+、Ni2H +则对菌株DL-10的降解能力有明显的抑制作用，在有Mn2+存在时苯酚的降解率仅为21%，如 图5e所示。
[0064] 实施例4
[0065] 苯酸降解菌Sphingomonas paucimobilis DL-10对其他苯酸类化合物的降解：
[0066] 菌株Sphingomonas paucimobilis DL-10可以将苯酸、邻苯二酸、对苯二酸、邻甲 基苯酚、间甲基苯酚、2，6-二甲基苯酚、3，5-二甲基苯酚、2，6-二甲基对苯二酚等苯酚类化 合物降解至HPLC检测不到物质，如表1所示，说明菌株DL-10可以完全矿化上述底物。
[0067] 将苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚、对甲基苯酚、2,6-二甲基 苯酚、3，5-二甲基苯酚等苯酚类化合物等浓度混合，终浓度达到500m g//L作为菌株DL-10降 解底物，接种量10 %，于30 °C，180r · mirT1震荡培养48h后，苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、邻甲 基苯酚的降解率在90 %以上，间甲基苯酚、对甲基苯酚、2，6-二甲基苯酚的降解率在75 %左 右，3,5-二甲基苯酚的降解率在60 %左右。 [0068]表1菌株DL-10的降解底物谱
[0069]
【主权项】
1. 一株降解苯酸类化合物的菌株，其特征在于，分类命名为OffiOfias pauciffioMhs DL-10,已于2014年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号 为：CCTCC NO:M 2014058。2. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。3. 权利要求1所述菌株的筛选方法，其特征在于，利用含苯酚的无机盐培养基作为介 质，从含酚工业废水中连续富集驯化具有苯酚利用能力的菌株;所述苯酚浓度为100 mg/L。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无机盐培养基是由硝酸铵1.0 g，氯化 钠1.0 g，磷酸二氢钾0.5 g，磷酸氢二钾1.5 g，加水至1.0 L配制，调节pH值至7.0,固体 培养基加入琼脂20.0 g、121°C灭菌20 min，使用前添加苯酚作为碳源。5. 权利要求1~2所述菌株在苯酚类化合物降解中的应用。
【文档编号】C02F3/34GK105907688SQ201610481724
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】董维亮, 马江锋, 章文明, 信丰学, 姜岷
【申请人】南京工业大学