一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法
【专利摘要】本发明提供了一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，本发明的原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法获得细胞总量大，分离度高，活率高，而且细菌、真菌和其他细胞的污染概率低，同时还能够进行传代培养，为血管疾病相关研究提供了良好的细胞培养基础。
【专利说明】
一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离 培养方法。
【背景技术】
[0002] 血管疾病发生和发展的一个主要因素是由于血管平滑肌细胞转变成为了具有繁 殖能力的表型。近期的研究表明，平滑肌细胞能表达钙离子通道，ICAM-1和VCAM-1。其中 ICAM-1和VCAM-1的表达可能是造成血管壁炎症反应，并进一步造成血管疾病的原因。因此， 对血管平滑肌细胞的体外培养和研究可用来发现和确定新的血管疾病的靶向治疗方法。
[0003] 目前，国内外已经有大量的研究者进行了小鼠/大鼠主动脉平滑肌细胞的培养和 药理学特性方面的研究，原代细胞培养的核心是，越年轻的个体，细胞存活率越高，有特殊 年龄要求的除外。尤其是肌细胞，如：心肌、骨髂肌和平滑肌，对细胞外环境的要求比较高， 同时又比较脆弱。这就更强调了选择新生小鼠或大鼠在培养主动脉平滑肌细胞时分离过程 的重要性。既往的研究多采用组织块培养法培养。其缺点在于，首先，组织块培养方法的原 代细胞培养时间长，且并非每一块都有细胞萌出，故细胞传代次数和最终获取的细胞数较 少;其次，细胞种类不纯，简单地使用组织块消化分离培养，导致了非主动脉平滑肌细胞的 很多其他细胞的混入;再次，使用单一的胶原酶消化细胞，导致分离过程吹打较多，细胞分 离度差且活性降低;最后，分离细胞和培养细胞的过程中容易污染，导致细胞活率和活性不 尚。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低 污染的原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供了一种新的大鼠主动脉平滑肌采集、分离和培养 方法，主要分为采集、分离和培养三大部分。
[0006] 采集操作时，首先处死新生大鼠（冰冻10分钟或者颈椎脱白），酒精浸泡5分钟，在 解剖显微镜下，打开胸腔，剪除肺组织，充分暴露胸腔的后壁。从心脏的升主动脉开始剥离 主动脉。用一只镊子夹紧升主动脉，另一只镊子沿胸腔后壁，逐步剥离胸主动脉，直至胸主 动脉的尾端，即入腹腔之前，剪断主动脉。
[0007] 采集操作结束后，即行分离的培养步骤具体包括以下步骤：
[0008] 步骤1:清洗和预灌流
[0009] 将离体的大鼠主动脉使用含有2 %双抗的37 °C预热的D-Hanks溶液冲洗后，剥离血 管内膜，灌注37 °C预热的预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl， 3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H2〇,0.6mM/L的EGTA，2%双抗和 1%两性霉素；
[0010] 步骤2:冲洗灌流
[0011] 将步骤1处理后的大鼠主动脉使用37°C预热的冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌 流液的配方为 15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,3mM/L CaCl2，2 %双抗和1 %两性霉素；
[0012] 上述步骤1和步骤2的灌流操作均可以利用留置针软管和小型注射器进行；
[0013] 步骤3:复合酶消化
[0014] 将步骤2处理后的大鼠主动脉置于37°C预热的复合酶消化液中消化，其中复合酶 消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶;复合 酶消化液为同等重量的四种酶溶于PBS、D-hanks溶液或一般的贴壁细胞培养基配制而成；
[0015] 步骤4:分离培养平滑肌细胞
[0016]将步骤3消化完毕的主动脉使用37 °C预热的D-Hanks溶液吹打洗脱，过70um筛网， 进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠主 动脉平滑肌细胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %双抗的培养基在37 °C 5 % C02的培养箱中 进行培养。
[0017]为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
[0018] 上述步骤1中预灌流的速度为2-8mL/min，预灌流时间为5-8分钟。
[0019] 上述步骤2中冲洗灌流的速度为5-10mL/min，冲洗灌流时间为3-5分钟。
[0020] 上述步骤2和步骤3之间还包括剥离血管外膜的步骤；
[0021] 上述步骤3中复合酶消化时间为4_6h;在经过复合酶的消化后，由于血管外膜和内 膜均已剥离，故很多平滑肌细胞已经分散分离开来。
[0022] 上述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Williams'medium E培养基或DMEM/F12培养 基，优选DMEM培养基。
[0023]上述双抗为青霉素和链霉素。
[0024] 优选地，还可以将获得的大鼠主动脉平滑肌细胞进行传代培养，将步骤3中制得主 动脉平滑肌细胞重悬液，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*10 6/瓶。置于37度， 5%C02的培养箱中进行培养。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况， 至细胞融合度达70 %~80 %，进行传代培养。每瓶细胞加0.25 %胰酶-EDTA lml，在37度培 养箱中孵育消化2分钟。显微镜下观察，当细胞变圆、间隙增大时，用含血清的培养基终止消 化，并将细胞吹打下来。400g离心5分钟，获得的细胞再加入含20 %胎牛血清、1 %青链霉素 的DMEM培养基，接种于T25培养瓶中，接种密度为0.5*106/瓶。置于37度，5 %C02的培养箱中 继续扩增培养。第2天更换培养基为含10%胎牛血清、1 %青链霉素的DMEM培养基，每3天更 换新的培养基。
[0025] 另一方面，本发明还提供根据上述的分离培养方法所培养的大鼠主动脉平滑肌细 胞。
[0026] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0027] 与现有的大鼠主动脉平滑肌分离培养方法(如组织块消化法)相比，本发明的原代 大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法进行了重大的改进，建立了成熟的高活率、低污染 的原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，同时使得获得的细胞培养时间长、分化好、 细胞活力高。
[0028] 本发明在分离细胞的操作中开创性的引入了灌流的方法。预灌流的预灌流液中添 加了 0.6mM/L的EGTA、双抗和两性霉素。EGTA-方面可以起到抗凝的作用（防止血凝块附 着），使灌流更充分，无灌流死角;另一方面，EGTA可以去除细胞间的Ca2+依赖性粘附因子，使 细胞间连接变松散，提高所得平滑肌细胞的分离度。添加2%的双抗和两性霉素，可以有效 地抑制组织或操作中存在的潜在的细菌和真菌污染。由于复合酶的包括多种胶原酶，而胶 原酶的在具有Ca 2+活化时可以达到最佳的消化效果，故本发明相应地引入了冲洗灌流的步 骤，冲洗灌流液中含有CaCl2，Ca 2+可以有效螯合预灌流液残存于的EGTA，同时提供足够的钙 离子增加胶原酶的活性。
[0029] 本发明使用复合酶消化液，复合酶消化液由I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶 和Dispase酶组成，相比传统单一的胶原酶，避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞 活性低、得率差的问题，尤其是对于平滑肌这样对缺血缺氧比较敏感的组织细胞。
[0030] 最后，本发明在培养细胞的过程中，采用原代、传代第1天和复苏第1天增加血清浓 度的方式，可以极大地提高细胞的贴壁率，进一步提高细胞活性和得率。
【附图说明】
[0031] 图1为普通显微镜视图下拍摄的本发明方法分离得到的大鼠主动脉平滑肌细胞； [0032]图2为使用荧光染色(DAPI)细胞的显微照片；
[0033]图3为使用荧光染色(a-SMA)细胞的显微照片；
[0034]图4为图2和图3合并的显微照片。
【具体实施方式】
[0035]本发明提供了一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤： [0036] 步骤1:清洗和预灌流
[0037]将离体的大鼠主动脉使用含有2%双抗的37°C预热的D-Hanks溶液冲洗后，剥离血 管内膜，灌注37 °C预热的预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl， 3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,0.6mM/L的EGTA，2%双抗和 1%两性霉素；
[0038] 步骤2:冲洗灌流
[0039]将步骤1处理后的大鼠主动脉使用37°C预热的冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌 流液的配方为 15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,3mM/L CaCl2，2 %双抗和1 %两性霉素；
[0040] 步骤3:复合酶消化
[0041] 将步骤2处理后的大鼠主动脉置于37°C预热的复合酶消化液中消化，其中复合酶 消化液中包括质量分数比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶； [0042]步骤4:分离培养平滑肌细胞
[0043]将步骤3消化完毕的主动脉使用37°C预热的D-Hanks溶液吹打洗脱，过70um筛网， 进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠主 动脉平滑肌细胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %双抗的培养基在37 °C 5 % C02的培养箱中 进行培养。
[0044] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0045] 实施例1
[0046]本实施例以新生SD大鼠为细胞来源，首先颈椎脱白处死，酒精浸泡5分钟，在解剖 显微镜下，打开胸腔，剪除肺组织，充分暴露胸腔的后壁。从心脏的升主动脉开始剥离主动 脉。用一只镊子夹紧升主动脉，另一只镊子沿胸腔后壁，逐步剥离胸主动脉，直至胸主动脉 的尾端，即入腹腔之前，剪断主动脉。将离体的大鼠主动脉使用含有2%双抗的37°C预热的 D-Hanks溶液冲洗后，小心地剥离血管内膜，使用小型注射器连接细的软管（留置针软管)灌 注37 °C预热的预灌流液，灌注速度为5mL/miη，时间为5分钟，预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12Η2〇,0·6ι?Μ/1 的EGTA，2%双抗和 1%两性霉素;处理后的大鼠主动脉使用37°C预热的冲洗灌流液灌流冲洗，灌注速度为8mL/ min，时间为5分钟，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KC1， 0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,3mM/L CaCl2,2%双抗和1%两性霉素。上述灌流结束后，小心地 剥离血管外膜，将剩余组织移至复合酶消化液中消化4h。消化完毕的主动脉使用37°C预热 的D-Hanks溶液吹打洗脱，过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无 血清培养液再次重悬，分离得到大鼠主动脉平滑肌细胞，然后用0.2%台盼兰计数活细胞 数。制得主动脉平滑肌细胞重悬液，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*10 6/瓶。 置于37度，5%C02的培养箱中进行培养。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞 生长情况，记录并拍摄照片。如图1所示，可见培养的细胞饱满圆润，活性较好，且分离度较 高。图2-图4的荧光显微照片亦显示了培养的细胞的良好形态和活性。
[0047]对比实施例
[0048] 对比实施例采用传统的组织块消化法，获得主动脉组织后，冲洗组织，在无菌操作 下剪碎，并使用Π 胶原酶消化过夜，使用缓冲液吹打组织，分散细胞，过筛网，进行离心洗 涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠主动脉平滑肌 细胞，细胞计数后，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*10 6/瓶，置于37度，5 % C02 的培养箱中进行培养并观察。
[0049] 上述的实施例和对比例实验，
【申请人】进行了多次实验，并进行了相关指标的比较 和数据统计。如表1所示：
[0050] 表 1
[0051]
[0052] 由此可以看出，本发明的原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法获得细胞总 量大，分离度高，活率高，而且细菌、真菌和其他细胞的污染概率低，同时还能够进行传代培 养，为血管疾病相关研究提供了良好的细胞培养基础。
[0053] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1:清洗和预灌流 将离体的大鼠主动脉使用含有2 %双抗的37 °C预热的D-Hanks溶液冲洗后，剥离血管内 膜，灌注37 °C预热的预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0·7mM/LNa2HP04·12H20,0·6mM/L的EGTA，2%双抗和l%两性霉素 ； 步骤2:冲洗灌流 将步骤1处理后的大鼠主动脉使用37°C预热的冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液 的配方为 15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na2HP〇4· 12H20,3mM/L CaCl2，2 %双抗和I %两性霉素； 步骤3:复合酶消化 将步骤2处理后的大鼠主动脉置于37°C预热的复合酶消化液中消化，其中复合酶消化 液中包括质量比为1: 1: 1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶； 步骤4:分离培养平滑肌细胞 将步骤3消化完毕的主动脉使用37°C预热的D-Hanks溶液吹打洗脱，过70um筛网，进行 离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠主动脉 平滑肌细胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %双抗的培养基在37 °C 5 % CO2的培养箱中进行 培养。2. 根据权利要求1所述的一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在 于，所述步骤1中预灌流的速度为2_8mL/min，预灌流时间为5-8分钟。3. 根据权利要求1所述的一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在 于，所述步骤2中冲洗灌流的速度为5-10mL/min，冲洗灌流时间为3-5分钟。4. 根据权利要求1所述的一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在 于，所述步骤2和步骤3之间还包括剥离血管外膜的步骤。5. 根据权利要求1所述的一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在 于，所述步骤3中复合酶消化时间为4-6h。6. 根据权利要求1所述的一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在 于，所述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Wi 11 iams 'medium E培养基或DMEM/F12培养基。7. 根据权利要求6所述的一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在 于，所述步骤4的培养基为DMEM培养基。8. 根据权利要求1所述的一种原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在 于，所述双抗为青霉素和链霉素。9. 一种根据权利要求1-8任意一项所述的原代大鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养方法 所培养的大鼠主动脉平滑肌细胞。
【文档编号】C12N5/071GK105907698SQ201610218198
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】王晓冰, 杨国峰
【申请人】王晓冰, 杨国峰