一种酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制备方法，属于漆酶制备技术领域。本发明利用二氧化硅大孔材料制得的磁性二氧化硅微球载体，由于磁性二氧化硅微粒表面富有羧基基团，可以与三氯化磷反应，将羧基基团转变为酰氯基团，反应后磁铁分离、清洗、干燥，得到酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球，将其加入缓冲液配制的漆酶溶液中，振荡过滤，缓冲液冲洗滤渣后即可得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶。实例证明，本发明制得的固定化载体材料在保持漆酶催化活性、稳定性的同时易于分离，且价格低廉、制备方便，最终制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶活力高达280U/mL，总产量提升至89％以上，具有广阔的市场前景。
【专利说明】
一种酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明公开了一种酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制备方法，属于漆酶制备技术领域。
【背景技术】
[0002]漆酶是一种含铜多酚氧化酶，不仅存在于高等植物中，而且一些多孔菌和腐生菌以及昆虫和细菌等也能产漆酶，且大多数由真菌分泌，在大多数真菌中，白腐菌是目前公认的最强、最主要的木质素降解者，能使木质素最终矿化为C02和H20。漆酶能催化氧化多种有机物，包括苯酚、甲氧基酚、氨基酚等难以降解的芳香族化合物，同时分子氧被还原成水，最近研究表明，漆酶在造纸工业中有着重要的作用，可以降解木浆中的木质素，并能够脱除造纸工业污水中的大量污染物，由于漆酶在催化木质素、木质素前体物质分子及其结构相似物等许多环境污染物的降解中具有特殊的作用，近年来，有关漆酶的研究受到国内外的广泛关注，显示出较大的研究价值和应用潜力。
[0003]但由于漆酶易溶于水，在水中游离的漆酶不可回收也不能长期保存，且在高温或其他极端环境下漆酶的稳定性不易保持，因而限制了漆酶的实际应用。固定化技术在保持游离漆酶的专一、高效的催化活性的同时，更是提高漆酶重复利用性、操控性和稳定性的有效手段，常用的固定化载体包括活性炭、壳聚糖、多孔硅胶以及微滤膜等多种材料，但现有的固定化材料存在固定化效率低、加工工艺复杂、分离困难以及操作性不高等缺陷。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题:针对目前游离的漆酶不能长期保存，高温下稳定性差，因此限制了其实际应用，而常用的固定化技术虽能保持漆酶的催化活性，提高利用性和稳定性，但使用的固定化载体材料固定化效率低，分离困难以及工艺复杂的现状，提供了一种利用二氧化硅大孔材料制得的磁性二氧化硅微球载体，由于磁性二氧化硅微粒表面富有羧基基团，可以与三氯化磷反应后，将羧基基团转变为酰氯基团，反应后用磁铁分离，清洗分离物并冷冻干燥，得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球，并加入用缓冲液配制的漆酶溶液，振荡过滤，并用缓冲液冲洗滤渣，即可得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶。本发明制得的固定化载体材料在保持漆酶催化活性、稳定性的同时易于分离，且价格低廉、制备方便，最终制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶活力高达280U/mL，总产量也提升至89 %以上，具有广阔的市场前景。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(I)称取30?50g块状二氧化硅大孔材料，将其放入质量分数5%盐酸中浸泡I?2h，浸泡后过滤取出，将酸处理后的块状二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯内衬反应釜中，按固液比I: 5加入混合有机溶剂，设置温度为80?120 0C，保温搅拌反应10?12h，反应结束后冷却至室温，过滤得二氧化硅大孔材料分别用丙酮和去离子水清洗3?5次;所述的混合有机溶剂是由γ-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按体积比1:2混合； (2)将上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3与去离子水混合，并加入0.5?
0.8g纳米四氧化三铁磁性颗粒、15?20mL质量分数8%十二烷基苯磺酸钠溶液，混合后超声分散20?30min，超声后向分散液中加入50?70mL玉米油和玉米油质量2?5%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在12000?150001'/111；[11转速下乳化5?10111；[11;
(3)上述乳化结束后向乳化混合液中加入30?40mL戊二醛，在200?400r/min转速下搅拌固定反应5?6h，固定反应后在8000?8500r/min转速下离心分离得沉淀物，并用质量分数3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2?3次，将清洗后沉淀物放入烘箱中在50?60°C下干燥6?8h，得磁性二氧化硅微球载体；
(4)将上述磁性二氧化硅微球载体按固液比1:2加入质量分数5%三氯化磷溶液中，在室温下搅拌反应15?20min，反应结束后用磁铁进行分离，将分离物用去离子水清洗4?6次，清洗后再用磁铁分离并冷冻干燥，即可得到酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球；
(5)将上述酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球按固液比1:3加入用缓冲液配置的漆酶溶液中，在15?35°C下振荡反应6?Sh，反应结束后过滤，将滤渣用pH4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗3?5次，即可得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的缓冲液配置的漆酶溶液是有pH为4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和浓度为lmg/mL的漆酶液按体积比1:2混合。
[0006]本发明的应用方法是:按固液比1:1000?3000，将本发明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶倒入废水中，充分混合均匀，曝气处理2?3h，之后检测水源，可测得废水中的COD从原来的3000?5000mg/L降低到了400?550mg/L，去除率高达90%以上，效果极其显著。
[0007]本发明的有益效果是:
(1)本发明操作简便，方法独特，在保持漆酶催化活性、稳定性的条件下使得工艺简便，固定化载体材料易于分离；
(2)本发明使得制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶活力高达280U/mL，总产量也提升至89%以上；
(3)本发明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶应用广泛，可用于纺织印染、造纸、能源再生、饲料、废水处理等方面。
【具体实施方式】
[0008]首先称取30?50g块状二氧化硅大孔材料，将其放入质量分数5%盐酸中浸泡I?2h，浸泡后过滤取出，将酸处理后的块状二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯内衬反应釜中，按固液比1: 5加入混合有机溶剂，设置温度为80?120 °C，保温搅拌反应10?12h，反应结束后冷却至室温，过滤得二氧化硅大孔材料分别用丙酮和去离子水清洗3?5次;所述的混合有机溶剂是由γ-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按体积比1:2混合;然后将上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3与去离子水混合，并加入0.5?0.8g纳米四氧化三铁磁性颗粒、15?20mL质量分数8%十二烷基苯磺酸钠溶液，混合后超声分散20?30min，超声后向分散液中加入50?70mL玉米油和玉米油质量2?5%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在12000?15000r/min转速下乳化5?1min;随后上述乳化结束后向乳化混合液中加入30?40mL戊二醛，在200?400r/min转速下搅拌固定反应5?6h，固定反应后在8000?8500r/min转速下离心分离得沉淀物，并用质量分数3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2?3次，将清洗后沉淀物放入烘箱中在50?60 0C下干燥6?Sh，得磁性二氧化硅微球载体;接下来将上述磁性二氧化硅微球载体按固液比1:2加入质量分数5%三氯化磷溶液中，在室温下搅拌反应15?20min，反应结束后用磁铁进行分离，将分离物用去离子水清洗4?6次，清洗后再用磁铁分离并冷冻干燥，即可得到酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球;最后将上述酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球按固液比I: 3加入用缓冲液配置的漆酶溶液中，在15?35°C下振荡反应6?Sh，反应结束后过滤，将滤渣用pH4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗3?5次，即可得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的缓冲液配置的漆酶溶液是有PH为4.5磷酸氢二钠-梓檬酸缓冲液和浓度为lmg/mL的漆酶液按体积比1:2混合。
[0009]实例I
首先称取30g块状二氧化硅大孔材料，将其放入质量分数5%盐酸中浸泡Ih，浸泡后过滤取出，将酸处理后的块状二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯内衬反应釜中，按固液比1:5加入混合有机溶剂，设置温度为80 °C，保温搅拌反应1h，反应结束后冷却至室温，过滤得二氧化硅大孔材料分别用丙酮和去离子水清洗3次;所述的混合有机溶剂是由γ-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按体积比I: 2混合;然后将上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3与去离子水混合，并加入0.5g纳米四氧化三铁磁性颗粒、15mL质量分数8%十二烷基苯磺酸钠溶液，混合后超声分散20min，超声后向分散液中加入50mL玉米油和玉米油质量2%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在12000r/min转速下乳化5min;随后上述乳化结束后向乳化混合液中加入301111^戊二醛，在2001'/1]1；[11转速下搅拌固定反应511，固定反应后在8000r/min转速下离心分离得沉淀物，并用质量分数3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2次，将清洗后沉淀物放入烘箱中在50 °C下干燥6h，得磁性二氧化硅微球载体;接下来将上述磁性二氧化硅微球载体按固液比1: 2加入质量分数5%三氯化磷溶液中，在室温下搅拌反应15min，反应结束后用磁铁进行分离，将分离物用去离子水清洗4次，清洗后再用磁铁分离并冷冻干燥，即可得到酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球;最后将上述酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球按固液比1:3加入用缓冲液配置的漆酶溶液中，在15°C下振荡反应6h，反应结束后过滤，将滤渣用PH4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗3次，即可得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的缓冲液配置的漆酶溶液是有pH为4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和浓度为lmg/mL的漆酶液按体积比1:2混合。
[0010]本实例操作简单易行，使用时，按固液比1:1000，将本发明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶倒入废水中，充分混合均匀，曝气处理2h，之后检测水源，可测得废水中的COD从原来的3000mg/L降低到了300mg/L，去除率高达90%，效果极其显著。
[0011]实例2
首先称取40g块状二氧化硅大孔材料，将其放入质量分数5%盐酸中浸泡1.5h，浸泡后过滤取出，将酸处理后的块状二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯内衬反应釜中，按固液比1:5加入混合有机溶剂，设置温度为100°C，保温搅拌反应llh，反应结束后冷却至室温，过滤得二氧化硅大孔材料分别用丙酮和去离子水清洗4次;所述的混合有机溶剂是由γ-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按体积比1:2混合;然后将上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3与去离子水混合，并加入0.65g纳米四氧化三铁磁性颗粒、ISmL质量分数8%十二烧基苯磺酸钠溶液，混合后超声分散25min，超声后向分散液中加入60mL玉米油和玉米油质量4%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在13500r/min转速下乳化8min;随后上述乳化结束后向乳化混合液中加入35mL戊二醛，在300r/min转速下搅拌固定反应5.5h，固定反应后在8300r/min转速下离心分离得沉淀物，并用质量分数3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2次，将清洗后沉淀物放入烘箱中在55 0C下干燥7h，得磁性二氧化硅微球载体;接下来将上述磁性二氧化硅微球载体按固液比1:2加入质量分数5%三氯化磷溶液中，在室温下搅拌反应18min，反应结束后用磁铁进行分离，将分离物用去离子水清洗5次，清洗后再用磁铁分离并冷冻干燥，即可得到酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球;最后将上述酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球按固液比1:3加入用缓冲液配置的漆酶溶液中，在25°C下振荡反应7h，反应结束后过滤，将滤渣用PH4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗4次，即可得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的缓冲液配置的漆酶溶液是有pH为4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和浓度为lmg/mL的漆酶液按体积比1:2混合。
[0012]使用时，按固液比1:2000，将本发明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶倒入废水中，充分混合均匀，曝气处理2.5h，之后检测水源，可测得废水中的COD从原来的4000mg/L降低到了 350mg/L，去除率高达91.2%,效果极其显著。
[0013]实例3
首先称取50g块状二氧化硅大孔材料，将其放入质量分数5%盐酸中浸泡2h，浸泡后过滤取出，将酸处理后的块状二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯内衬反应釜中，按固液比1:5加入混合有机溶剂，设置温度为120°C，保温搅拌反应12h，反应结束后冷却至室温，过滤得二氧化硅大孔材料分别用丙酮和去离子水清洗5次;所述的混合有机溶剂是由γ-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按体积比1: 2混合;然后将上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3与去离子水混合，并加入0.8g纳米四氧化三铁磁性颗粒、20mL质量分数8%十二烧基苯磺酸钠溶液，混合后超声分散30min，超声后向分散液中加入7 OmL玉米油和玉米油质量5%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在15000r/min转速下乳化I Omin;随后上述乳化结束后向乳化混合液中加入40mL戊二醛，在400r/min转速下搅拌固定反应6h，固定反应后在8500r/min转速下离心分离得沉淀物，并用质量分数3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗3次，将清洗后沉淀物放入烘箱中在60 0C下干燥Sh，得磁性二氧化硅微球载体;接下来将上述磁性二氧化硅微球载体按固液比1: 2加入质量分数5%三氯化磷溶液中，在室温下搅拌反应20min，反应结束后用磁铁进行分离，将分离物用去离子水清洗6次，清洗后再用磁铁分离并冷冻干燥，即可得到酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球;最后将上述酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球按固液比I: 3加入用缓冲液配置的漆酶溶液中，在35°C下振荡反应Sh，反应结束后过滤，将滤渣用PH4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗5次，即可得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶;所述的缓冲液配置的漆酶溶液是有pH为4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和浓度为lmg/mL的漆酶液按体积比1:2混合。
[0014]使用时，按固液比1:3000，将本发明制得的磁性二氧化硅微球固定化漆酶倒入废水中，充分混合均匀，曝气处理3h，之后检测水源，可测得废水中的COD从原来的5000mg/L降低到了550mg/L，去除率高达89%，效果极其显著。
【主权项】
1.一种酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶的制备方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)称取30?50g块状二氧化硅大孔材料，将其放入质量分数5%盐酸中浸泡1?2h，浸泡后O过滤取出，将酸处理后的块状二氧化硅大孔材料放入聚四氟乙烯内衬反应釜中，按固液比1: 5加入混合有机溶剂，设置温度为80?120 0C，保温搅拌反应10?12h，反应结束后冷却至室温，过滤得二氧化硅大孔材料分别用丙酮和去离子水清洗3?5次;所述的混合有机溶剂是由γ-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷和正己烷按体积比1:2混合； (2)将上述清洗后的二氧化硅大孔材料按固液比1:3与去离子水混合，并加入0.5?.0.8g纳米四氧化三铁磁性颗粒、15?20mL质量分数8%十二烷基苯磺酸钠溶液，混合后超声分散20?30min，超声后向分散液中加入50?70mL玉米油和玉米油质量2?5%失水山梨醇脂肪酸酯，混合后在12000?150001'/111；[11转速下乳化5?10111；[11; (3 )上述乳化结束后向乳化混合液中加入30?40mL戊二醛，在200?400r/min转速下搅拌固定反应5?6h，固定反应后在8000?8500r/min转速下离心分离得沉淀物，并用质量分数3%失水山梨醇脂肪酸酯溶液清洗2?3次，将清洗后沉淀物放入烘箱中在50?60°C下干燥.6?8h，得磁性二氧化硅微球载体； (4)将上述磁性二氧化硅微球载体按固液比1:2加入质量分数5%三氯化磷溶液中，在室温下搅拌反应15?20min，反应结束后用磁铁进行分离，将分离物用去离子水清洗4?6次，清洗后再用磁铁分离并冷冻干燥，即可得到酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球； (5)将上述酰氯化修饰后磁性二氧化硅微球按固液比1:3加入用缓冲液配置的漆酶溶液中，在15?35°C下振荡反应6?Sh，反应结束后过滤，将滤渣用pH4.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液冲洗3?5次，即可得到酰氯化修饰磁性二氧化硅微球固定化漆酶;缓冲液配置的漆酶溶液是有pH为4.5磷酸氢二钠-梓檬酸缓冲液和浓度为lmg/mL的漆酶液按体积比1: 2混入口。
【文档编号】C12N11/14GK105907744SQ201610469755
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月26日
【发明人】周荣, 张明, 王统军
【申请人】周荣