辣椒抗炭疽病分子标记及应用

文档序号:10548487阅读:570来源:国知局
辣椒抗炭疽病分子标记及应用
【专利摘要】本发明涉及分子标记领域,具体涉及辣椒抗炭疽病分子标记及应用。其与侧翼SNP标记UN02856_633的遗传距离为3.468cM。本发明提供的分子标记实现了在苗期对辣椒植株绿果期抗炭疽病鉴定,大大缩短了育种时间,节约了人力物力。
【专利说明】
辣椒抗炭疽病分子标记及应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子标记领域,具体涉及辣椒抗炭疽病分子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 辣椒(Capsicum spp)又名海椒、番椒、辣子、辣前等,属前科(solanaceae)辣椒属 (Capsicum),我国是世界辣椒种植面积最大的国家,辣椒炭疽病在辣椒上发生较为普遍,是 危害辣椒果实的一种主要病害,辣椒炭疽病危害时间长、经济损失大,在高温多雨的气候条 件下尤为严重。在我国,引起辣椒炭疽病的病原菌主要有4个种:尖孢炭疽菌 Colletotrichum acutatum(Simmonds)、红色炭疽菌C. gloeosporioides(Penz · )Penz .and Sacc.、黑点炭疽菌C.capsici(Syd. )Butler and Bisby和黑色炭疽菌C.coccodes(Wallr.) S.Hughes。
[0003] 辣椒炭疽病防治中化学防治容易污染环境、物理防治高耗能且效果不明显,因此 培育抗病品种是防治炭疽病的一种有效方法,利用传统的育种方法一般易受环境影响且时 间长、效率低,开发与抗病基因连锁的分子标记,利用分子标记辅助选择育种是近年发展起 来的高效育种手段。有研究表明,辣椒对炭疽病的抗性在绿果期和红果期不同,可能受到多 个基因的影响。Lin等(2007)研究了辣椒"0038-9155"(由PBC932衍生)对尖孢炭疽菌的抗性 遗传,结果表明,在绿熟果期的抗性由两个互补的显性基因共同控制,在红熟果期的抗性由 两个重叠的隐性基因控制,且这两个时期的抗性基因是相互独立的。PBC80 (C. baccatum)在 绿熟果期对尖孢炭疽菌抗性由一对隐性基因 c〇4控制,而红熟果期的抗性则由一对显性基 因 Co5控制(Mahasuk et al.,2009b)。利用中国辣椒'PBC932 '对尖孢炭疽菌(菌株Co 11-153)的抗性进行了初步遗传定位,进一步明确了其遗传规律。研究表明,PBC932对炭疽病的 抗性呈现显性遗传,控制绿熟果期和红熟果期抗性的主效QTL都初步定位到了 5号染色体接 近末端的InDel和HpmsE116两个分子标记之间,相距9.4cM,且绿果期和红果期的抗性主效 基因连锁但不位于同一基因座。通过初步定位与抗病性连锁的主效QTL,可为进一步精细定 位从而开发出用于分子标记辅助选择的紧密连锁标记奠定重要基础。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种与辣椒绿果期抗炭疽病基因 AnRGQ5紧密连锁的分子标 记。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种利用分子标记鉴定辣椒炭疽病抗感的方法。
[0006] 根据本发明的可用于辅助抗炭疽病AnRGQ5基因选择的分子标记通过以下步骤获 得。
[0007] 本发明以辣椒抗病品种TOC932和感病品种77013及其构建的BC4S1群体为试验材 料,研究辅助选择辣椒绿果期抗炭疽病主效基因 AnRGQ5的分子标记。利用SNP标记筛选与 AnRGQ5基因连锁的分子标记,利用初定位到5号染色体末端与其连锁的两侧SSR和InDe 1标 记,将其标记序列对比到辣椒CM334和ZunLa基因组数据库5号染色体上(http:// passport. pepper.snu.ac.kr/?t = PGEN0ME/;http://peppersequence . Genomics .cn/ page/species/index. jsp),获取两标记的物理位置,筛选出在两标记之间在亲本中有多态 性的KasPar标记,共筛选出64个KasPar引物,经过初筛,其中8个在双亲及群体中表现多态 性。通过与BC4S1群体抗炭疽病果实表面病斑大小的表型对应,发现该位点与侧翼SNP标记 UN02856_633的距离最近,遗传距离为3.468cM,物理位置约为221.3Mb。利用该分子标记在 新的群体中进行抗炭疽病鉴定,可以有效地用来辅助育种工作。
[0008] KasPar标记UN02856_633在抗病材料PBC932中分型为Y型,发出HEX荧光,在感病材 料77013中分型为X型,发出FAM荧光,在F1中同时发出两种荧光。
[0009] 本发明的用于特异性筛选辣椒绿果期抗炭疽病的KasPar引物,其信息如下所示。
[0010]
[0011] 本发明的优点是不通过抗病性鉴定,只是在苗期对辣椒植株的DNA检测,就可以判 断辣椒对于炭疽病的抗性,可以广泛应用到分子标记辅助育种。
[0012] 本发明提供了分子标记UN02856_633在辣椒炭疽病抗性鉴定中的应用。
[0013]本发明提供了分子标记UN02856_633在辣椒分子标记辅助育种中的应用。
[0014] 本发明提供的分子标记实现了在苗期对辣椒植株绿果期抗炭疽病鉴定,大大缩短 了育种时间,节约了人力物力。通过利用本发明提供的特异性引物采用KasPar系统检测待 测辣椒基因组DNA:KasPar标记UN02856_633,在辣椒感病亲本中分型结果是X型,发出蓝色 荧光,在抗病亲本中分型为Y型,发出绿色荧光;F1中分型结果为杂合型,发出两种荧光。通 过这个KasPar分子标记可对辣椒绿果期炭疽病抗性进行鉴定,提高了育种效率。相比较国 内外已发现的其它分子标记,本发明的SNP分子标记UN02856_633与辣椒绿果期抗炭疽病基 因 AnRGQ5更加紧密连锁,遗传距离分别为3.468cM,在辣椒抗炭疽病育种中有重要意义。
【附图说明】
[0015] 图1显示初定位的SSR标记和InDel标记在BC4S1群体部分单株扩增结果。(a)InDel 标记,(b)SSR标记。注:M:50bp marker;a:与抗病亲本条带相同;b:与感病亲本条带相同;h: 含有感病和抗病亲本条带。
[0016] 图2显示SSR标记、InDel标记和KasPar标记与主效基因 AnRG〇5的连锁关系。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明 的范围。
[0018] 若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0019] 本发明以辣椒抗病品种PBC932为父本、感病品种77013为母本及其以77013作为回 交亲本回交四代再自交一代构建的BC4S1群体为试验材料。
[0020]实施例1辣椒绿果期抗炭疽病品种鉴定以及与AnRGQ5基因紧密连锁的分子标记 UN02856_633 的获得
[0021] 1、辣椒抗性鉴定遗传群体构建
[0022]以含有尖孢炭疽病抗性主效基因 AnRGQ5的辣椒品系PBC932(C.chinenSe)及感病自 交系材料77013(Capsicum annuum L.)为双亲,杂交获得F1后与父本77013连续回交四代, 再自交一代获得的BC4S1作为作图群体,共528个单株。
[0023] 2、基因组DNA的提取
[0024] 取嫩叶,用CTAB法提取BC4S1所有单株、亲本及F1的基因组DNA,用Biospec-nano微 量分光光度计测定浓度和质量,将浓度稀释至5ngAU。
[0025] 3、BC4S1群体抗性鉴定
[0026] 植株果实绿熟期时对果实进行抗尖孢炭疽菌(菌株Coll-153)接种鉴定,接种方法 采用针刺法,将采收的绿熟期果实洗净消毒后晾干,用微量注射器刺破果皮并注入lyL浓度 为5X105/ml的孢子悬浮液,每个果实根据果实大小接种2-3个点,将接种后的果实置于铺 有灭菌的湿润滤纸上并将接种点朝上,用保温膜密封于26°C培养箱中暗培养2d,后揭开保 温膜盖上盖子保湿5d,湿度要持续保持在90%以上,然后测量病斑直径、调查发病率。抗性 鉴定指标为总体病斑直径(〇),总体病斑直径(〇)=所有病斑直径总和/接种点数。病斑直径 的测量标准为没有发病的接种点病斑直径记为〇_,发病的接种点病斑直径为病斑横、纵径 的平均值。通过将群体的病斑数据与两个亲本的病斑数据进行方差分析等比较,抗病性划 分标准:免疫(I) :G0(绿熟果总体病斑直径)=0;高抗(HR):0〈G0<5;抗病(R):5〈G0< 10;中 抗(]\?):10〈60彡15;感病(5):15〈60彡20 ;高感(批):60>20。?80932、77013、?1及队451最终 鉴定株数分别为:14、14、8、528株。根据抗感标准,抗病亲本TOC932及F1表现为抗病,77013 全部表现为感病。
[0027] 4、KasPar 标记开发
[0028] 利用初定位的SSR和InDel标记对BC4S1群体进行基因型分析。
[0029] 表2 SSR和InDel引物信息
[0030]
[0031]以这2对引物扩增BC4S1群体共528个样品(结果如图1),筛选出交换单株。两个标 记均为共显性的,感病个体为和抗病个体表现为长度不同的一条带。
[0032]利用SNP标记筛选与AnRGQ5基因连锁的分子标记,利用初定位到5号染色体末端与 其连锁的两侧SSR和InDel标记,将其标记序列对比到辣椒CM334和ZunLa基因组数据库5号 染色体上(http://passport.pepper.snu.ac.kr/?t = PGENOME / ;http:// peppersequence .Genomics · cn/page/species/index. jsp),获取两标记的物理位置。筛选 在两标记之间在亲本中有多态性的KasPar标记,共筛选出64个KasPar引物,经过初筛,其中 8个在双亲及群体中表现多态性。通过与BC4S1群体抗炭疽病果实表面病斑大小的表型对 应,发现该位点与侧翼SNP标记UN02856_633的距离最近,遗传距离为3.468cM,物理位置约 为221.3Mb。利用该分子标记在新的群体中进行抗炭疽病鉴定,可以有效地用来辅助育种工 作。
[0033]每对KasPar标记含有3条引物序列:六1、六2、(:。其中六1^2仅仅是末端的5即位点存 在差异,在A1、A2的5 '端分别加有共同的接头序列:5 ' GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3 '、5 ' GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3'。此两段接头序列与Master Mix里带有荧光的序列互补,配对后 会激发荧光,C为反向互补序列,所用引物均在生工合成。
[0034] 5、多态性KasPar连锁标记筛选
[0035]以亲本DNA为模板,对KasPar引物进行多态性筛选,共筛选到8个具有多态性的标 记,再以筛选到的多态性标记对BC4S1群体进行分析,这8个引物均与绿果期主效基因 AnRG05 连锁。其中标记UN02856_633是与辣椒抗炭疽病AnRGQ5基因连锁最紧密的位于基因侧翼的分 子标记。
[0036] KasPar引物预混体系(lOOyL):位点特异引物A1 12yL,位点特意引物A2 12yL,共 用引物C 30yL,ddH20 46yL。
[0037] PCR扩增体系(4yL):DNA(5ngAiL)2yL,2XKASPar Mix 2yL,引物混合液0.055yL。
[0038] 反应程序在384孔ABI PCR仪及Roche 480 Π 荧光定量仪384模块下进行。
[0039] 实施例2分子标记UN02856_633的应用
[0040] 利用已开发的分子标记UN02856_633在以辣椒TOC932和77013为亲本,以77013为 回交父本构建的BC4S1群体中进行抗性鉴定,共鉴定317个单株,抗感表型比符合3:1分离 比,利用分子标记UN02856_633进行鉴定,分子数据与表型鉴定数据吻合。
[00411分子标记UN02856_633鉴定辣椒尖孢炭疽菌抗性的方法为:
[0042] (1)提取待检测BC4S1群体单株的DNA;
[0043] (2)对BC4S1群体接种尖孢炭疽菌;
[0044] (3)以提取的DNA为模板,利用标记UN02856_633以及KasPar系统对群体进行基因 型分型;
[0045] (4)KasPar系统检测分型结果;根据发出的不同荧光判断基因型。(荧光值的读取 在Roche 480Π 焚光定量仪,按照37°Clmin,Read fluorescence Is进行,再按照Endpt Geno分析读取焚光值)。
【主权项】
1. 与辣椒绿果期抗炭疽病基因 AnRGQ5紧密连锁的分子标记,其特征在于,与侧翼SNP标 记UN02856_633的遗传距离为3.468cM。2. 与辣椒绿果期抗炭疽病基因 AnRGQ5紧密连锁的分子标记的特异性检测引物,其特征 在于,所述引物包括: 前引物A1:5 ' AGAGAAGCCCAAAGAGCCCGAAAAA3 ' ; 前引物A2:5 ' AGAGAAGCCCAAAGAGCCCGAAAAG3 ' ; 后引物C: 5 ' TTTRGGCTTTGGAGGCTCCTTGGGC3 '。3. 权利要求1所述的与辣椒绿果期抗炭疽病基因 AnRGQ5紧密连锁的分子标记在鉴定辣 椒抗炭疽病方特性方面的应用。4. 权利要求1所述的与辣椒绿果期抗炭疽病基因 AnRGQ5紧密连锁的分子标记的特异性 检测引物在鉴定辣椒抗炭疽病方特性方面的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105907754SQ201610405982
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月10日
【发明人】王立浩, 张宝玺, 张正海, 曹亚从, 刘仪蔚
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
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