靶向沉默Gβ2的shRNA的制作方法

文档序号:10548491阅读:526来源:国知局
靶向沉默Gβ2的shRNA的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域,具体涉及特异性沉默靶标蛋白Gβ2的shRNA。本发明首先是根据鼠源的Gβ2序列设计出19bp的目的片段,合成的目的片段两端带有合适的酶切位点,将目的片段连接到pLL3.7载体上,连接,形成核心的沉默载体,转化,挑取阳性克隆进行PCR鉴定。鉴定正确后,进行DNA测序,随后通过免疫印记实验进行沉默效率的检测。设计合成了两个能够靶向鼠源Gβ2的19bp的shRNA,序列为 GGGATGTTCGGGATTCCAT和GGATCAGATGACGCCACTT。
【专利说明】
靶向沉默郎2的shRNA
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域,具体涉及特异性沉默靶标蛋白邱2的 shRNA〇
[0002]
【背景技术】 G蛋白β亚基2(G protein β subunit 2,G02 )是异源三聚体G蛋白的重要组成部分。能 够与Gy亚基组成二聚体,共同参与细胞内的信号转导过程。邱2由340个氨基酸残基组成, 主要结构是七个重复的WD domain,空间折叠后形成螺旋桨型结构。之前研究报道说明TO domain在进化上保守的功能性结构域,主要参与的参与组成RNA加工复合体,转录调节因 子;也在细胞骨架建成、有丝分裂纺锤体建成、小泡形成及运输,以及细胞分裂等方面发挥 作用。有文献报道证明邱2直接参与调节线粒体融合,调节神经靶标酯酶活性,并且与微管 与纺锤体形成,神经突发生,以及wnt通路都有直接关系。
[0003] 在传统观点认为,Gi32的作用仅仅是形成卯γ二聚体,作为Ga亚基的抑制因子,抑 制三聚体G蛋白的持续激活。越来越多的报道证明,Gi32所形成的邱γ亚基有自己独立的功 能,包括调节线粒体的裂变和融合,调苄基因转录等等。因此Gi32对细胞的多种生物学功能 有调控作用,所以特异性的沉默G02对细致精确的研究其功能至关重要。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是合成特定的能够靶向沉默邱2的shRNA,为更加深入的研究Gi32以 及其在细胞信号转导和细胞运动中的作用提供了有效的手段。
[0005] 本发明中所需要构建的主要是Gi32的沉默载体。核心沉默载体构建分为两个大的 步骤,首先是根据鼠源的邱2序列设计出19bp的目的片段,合成的目的片段两端带有合适的 酶切位点,将目的片段连接到PLL3.7载体上,连接,形成核心的沉默载体,转化,挑取阳性克 隆进行PCR鉴定。鉴定正确后,进行DNA测序,随后通过免疫印记实验进行沉默效率的检测。
[0006] 本发明中设计合成了两个能够靶向鼠源邱2的19bp的shRNA,序列为 GGGATGTTCGGGATTCCAT 和 GGATCAGATGACGCCACTT 能够特异性沉默邰2 的表达。
[0007] 载体的构建包括以下步骤: 第一步,序列设计 根据鼠源邱2基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别《32的 序列。
[0008] 第二步,双链人工合成DNA序列构建 将人工合成的两条Sense和Anti sense通过变性、退火形成双链DNA。
[0009] 第三步,沉默载体的构建 将沉默载体PLL3.7双酶切后,利用回收试剂盒回收线性化载体,将回收片段与退火所 得双链DNA片段进行链接、转化、鉴定阳性克隆、测序得到构建成功的沉默载体。
[0010] 第四步,沉默祀蛋白效率的检测 提取质粒,转染细胞后提取蛋白,利用免疫印迹检测沉默效率。
[0011]
【附图说明】: 图1 : PLL3.7载体双酶切凝胶电泳图; 图2 : Gi32 shRNA632菌液PCR结果凝胶电泳图,白色框中为阳性结果; 图3 : Gi32 shRNA730菌液PCR结果凝胶电泳图,白色框中为阳性结果; 图4 :Western Blot沉默效率检测结果。
[0012] 本发明中设计合成的19bp的目的片段,能够特异性的沉默Gi32, Gi32是三聚体G蛋 白的重要组成部分。经研究表明,Gi32在细胞信号转导和细胞运动过程中起到重要作用,构 建成功的载体,能够特异性的沉默邱2,降低细胞运动能力。因此,Gi32沉默载体的应用能够 更为精细的研究细胞信号转导和细胞运动,为解释相关机制提供理论基础。
【具体实施方式】: 实施例一:特异性沉默靶标蛋白邱2的表达载体构建 1、特异性沉默靶蛋白邱2的序列设计 (1)根据鼠源邰2基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计,设计的原则: 19bp的特异性结合《32的序列的GC含量为45%-55%,退火温度45°C-65°C,同时要求序列起始 的第一个碱基为G。将选取的片段进行BLAST人基因组比对,选择特异性序列。
[0013] (2)以Hpal- GN18-TT-loop- 81NC-XhoI形式合成一段55bp序列,81NC为N G18的 反向互补,5'端为Hpal酶切位点,3'端为Xhol酶切位点。设计合成的片段分别靶向Gi32的 cDNA序列632- 650 (G02 shRNA632)和730-748 (G02 shRNA730)。
[0014] 2、特异性沉默靶蛋白GK的序列的合成与储存 (1)将合成的两段oligo溶解至50 μΜ,各取100μΙ混合。
[0015] (2)95 °C变性5min,72 °C孵育 10min,关闭PCR仪。
[0016] (3)取出混匀,放在冰上备用,或者-20 °C长期保存。
[0017] 3、沉默载体pLL3.7- G02 shRNAs的构建 (1) 取pLL3.7载体,Hpal和Xhol双酶切,电泳,回收线性pLL3.7大片段【图1】 (2) 连接和转化。将线性pLL3.7浓度稀释至160ngAi,连接反应(Promege公司的T4 DNA 连接酶)
4 °C过夜连接,将连接产物转化DH5a感受态细胞,涂布在具有Amp抗性的LB平板 (3) 阳性克隆鉴定。在转化平板上挑取单克隆摇菌,试剂盒提取质粒,通过PCR鉴定阳性 克隆【图2-3】。鉴定引物为pLL3.7 test-F:5'-GCACAGACTTGTGGGAGAAG-3',pLL3.7 test-R: 5 ' CCTGCTGGAATCTCGTGAA-3 '。以U6启动子为测序引物,送长春库美基因测序。
[0018] 实施例二: 沉默靶蛋白效率的检测 (l)将control、Gβ2shRNA分别与Flag-Gβ2表达载体通过PEI共同转染进入293T细胞 (2)提取细胞总蛋白,利用Western blot免疫印迹分析,转入Gi32沉默载体后,Gi32表达 量显著降低,α-Tubulin为内参【图4】。
[0019] 序列表 〈110>东北师范大学 〈120>特异性沉默靶标蛋白《32的表达载体构建及作用 <141> 2015-01-15 〈160>19 <210> 2 <211> 19 <212> 〈213>人工序列 <220> <221> misc_RNA 〈222> (1).··(19) 〈223> <400> 1 GGGATGTTCGGGATTCCAT和GGATCAGATGACGCCACTT 〇
【主权项】
1.靶向沉默G02的shRNA,其特征是序列为GGGATGTTCGGGATTCCAT和 GGATCAGATGACGCCACTT 〇
【文档编号】C12N15/113GK105907759SQ201610361177
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】朱筱娟, 郭野, 何潇潇, 赵璐
【申请人】东北师范大学
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