牛樟芝管家基因序列、qRT-PCR扩增引物、扩增方法和筛选方法

牛樟芝管家基因序列、qRT-PCR扩增引物、扩增方法和筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种牛樟芝管家基因序列，所述管家基因序列为c4163或c10657的序列，所述c4163的序列如SEQ ID NO:1，所述c10657的序列如SEQ ID NO:2。本发明还涉一种牛樟芝管家基因序列的筛选方法、牛樟芝管家基因序列的qRT?PCR扩增引物以及牛樟芝管家基因序列的qRT?PCR扩增方法。本发明的牛樟芝管家基因序列能在不同形态和不同培养时间的牛樟芝样品中稳定表达，且条带单一，为研究牛樟芝中功能基因表达提供校正序列。
【专利说明】
牛樟芝管家基因序列、qRT-PCR扩増引物、扩増方法和筛选 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因技术，特别涉及牛樟芝管家基因序列、qRT-PCR扩增引物、扩增方 法和筛选方法。
【背景技术】
[0002] 牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是我国台湾地区特有的一种药用菌，被发现生长 于空心、腐烂的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)内壁，由于其宿主在自然界中极少量且牛 樟芝的生长速度缓慢，牛樟芝被人们誉为"森林中的红宝石"。三萜作为牛樟芝子实体和菌 丝体中的主要活性成分，具有保肝、解毒、抗炎症、抗氧化等多种显著功效，因此牛樟芝子实 体价格昂贵，供不应求。利用分子生物学的方法提高牛樟芝菌丝体中的三萜含量成为菌丝 体替代子实体成为提供产品原料的新途径。牛樟芝中三萜合成途径复杂，众多基因在途径 中起到关键作用，为了更好的研究关键基因在不同样品间的表达量，通常需要引入表达较 为稳定的管家基因或内参基因 （housekeeping gene)，从而对目的基因表达量进行校正，保 证获得更可靠的基因表达量结果，而与此相关的结果在牛樟芝已报道的研究中尚未发现。
[0003] 例如，专利号为201410770593.X的中国方面专利公开了一种牛樟芝FPPS蛋白基因 及其克隆和测序方法。上述专利参考其它物种FPPS基因序列，克隆测序获得牛樟芝FPPS基 因的cDNA序列，并对不同物种FPPS基因的⑶S序列进行同源性比较，旨在了解和验证FPPS基 因的结构特点，为研究FPPS基因与菇类萜类合成代谢途径提供基础资料。
[0004] 上述专利仍未发现牛樟芝的一个表达较为稳定的管家基因或内参基因。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是:提供一种牛樟芝管家基因序列，能在不同形态和 不同培养时间的牛樟芝样品中稳定表达，且条带单一;进一步提供一种上述牛樟芝管家基 因序列进行qRT-PCR扩增所用的引物；进一步还提供一种上述牛樟芝管家基因序列进行 qRT-PCR扩增的扩增方法;此外，还提供一种上述牛樟芝管家基因序列的筛选方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种牛樟芝管家基因序列，所述管家基因序列为c4163或C10657的序列，所述 c4163的序列如SEQ ID N0:1，所述C10657的序列如SEQ ID N0:2。
[0008] -种上述的牛樟芝管家基因序列的qRT-PCR扩增引物，所述c4163的序列的正向引 物的序列如SEQ ID N0:9,所述c4163的序列的反向引物的序列如SEQ ID N0:10;
[0009] 所述C10657的序列的正向引物的序列如SEQ ID勵：11，所述〇4163的序列的反向 引物的序列如SEQ ID NO: 12。
[0010] -种牛樟芝管家基因序列的qRT-PCR扩增方法，包括上述的牛樟芝管家基因序列 和上述的qRT-PCR扩增引物，所述qRT-PCR扩增的反应条件为:93-97 °C预变性3_7min，38-42 个循环进行93-97 °C变性3-7s，54-58 °C退火20s，溶解曲线分析63-67 °C 3-7s和93-97 °C 3- 7s〇
[0011] -种上述的牛樟芝管家基因序列的筛选方法，取牛樟芝实体和牛樟芝菌丝体作为 样品，然后分别提取牛樟芝实体和牛樟芝菌丝体样品的RNA，混合后进行RNA seq测序，将测 序结果进彳丁初步筛选，获得待筛选的牛棒芝管家基因序列，将初步筛选后获得的基因序列 进行qRT-PCR扩增，根据扩增结果进行再次筛选，获得上述的牛樟芝管家基因序列。
[0012] 具体的，例如，一种上述的牛樟芝管家基因序列的筛选方法，取牛樟芝实体和牛樟 芝菌丝体作为样品，每组样品三个重复，分别提取样品RNA，将三个重复混合后进行RNA seq 测序，对测序结果的FPKM>20进行筛选，得到8个稳定表达的候选管家基因；进而对候选管家 基因进行qRT-PCR扩增，以表1中qRT-PCR扩增引物，反应条件为:93-97 °C预变性3_7min，38-42个循环进行93-97°C变性3-7s，54-58°C退火20s，溶解曲线分析63-67°C3-7s和93-97°C3-7s。根据扩增结果的Ct值、溶解曲线和geNorm分析结果进行再次筛选，获得稳定表达的牛樟 芝管家基因序列2条。
[0013] 本发明的有益效果在于：
[0014] (1)牛樟芝管家基因在目前已有文献中并无报道。本发明首次公开牛樟芝管家基 因序列，能在不同形态和不同培养时间的牛樟芝样品中稳定表达，且条带单一，为研究牛樟 芝中功能基因表达提供校正序列，保证实验结果的准确性，借助检测每个样品管家基因表 达量就可以用于校正上样误差，使相对定量(2^ Aet)的结果更为可信；
[0015] ⑵在获得上述牛樟芝管家基因序列的基础上，还设计出牛樟芝管家基因 qRT-PCR 扩增特异引物序列，对牛樟芝管家基因序列进行特异性扩增；
[0016] (3)此外，还对牛樟芝管家基因序列的筛选方法进行优化设计，提供一种针对牛樟 芝管家基因序列的筛选方法。
[0017] (4)最后，对牛樟芝管家基因序列的扩增条件进行优化，提供一种高效、科学的扩 增反应条件。
【附图说明】
[0018] 图1为待筛选牛樟芝管家基因扩增条带电泳图；
[0019] 图2为待筛选牛樟芝管家基因溶解曲线特异图；
[0020] 图3为待筛选牛樟芝管家基因扩增效率图；
[0021 ]图4为待筛选牛樟芝管家基因 Ct值图；
[0022]图5为不同样品中待筛选牛樟芝管家基因的表达稳定值(M)图；
[0023]图6为c4163和C10657作为管家基因与三组样品中的基因的Ct值对比图。
【具体实施方式】
[0024] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 并配合附图详予说明。
[0025] 本发明最关键的构思在于：首次筛选出表达稳定且条带单一的牛樟芝管家基因， 可用于qRT-PCR反应中对目的功能基因的校正。
[0026] 请参照图1以及图2, 一种牛樟芝管家基因序列，所述管家基因序列为C4163或 C10657的序列，所述c4163的序列如SEQ ID N0:1，所述C10657的序列如SEQ ID N0:2。
[0027] 一种上述的牛樟芝管家基因序列的qRT-PCR扩增引物，所述c4163的序列的正向引 物的序列如SEQ ID N0:9,所述c4163的序列的反向引物的序列如SEQ ID N0:10;
[0028] 所述C10657的序列的正向引物的序列如SEQ ID勵：11，所述(：4163的序列的反向 引物的序列如SEQ ID NO: 12。
[0029] 一种牛樟芝管家基因序列的qRT-PCR扩增方法，包括上述的牛樟芝管家基因序列 和上述的qRT-PCR扩增引物，所述qRT-PCR扩增的反应条件为:93-97 °C预变性3_7min，38-42 个循环进行93-97 °C变性3-7s，54-58 °C退火20s，溶解曲线分析63-67 °C 3-7s和93-97 °C 3- 7s〇
[0030] 进一步的，所述qRT-PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，40个循环进行95°C 变性5s，56 °C退火20s，溶解曲线分析65 °C 5s和95 °C 5s。
[0031] -种上述的牛樟芝管家基因序列的筛选方法，取牛樟芝实体和牛樟芝菌丝体作为 样品，然后分别提取牛樟芝实体和牛樟芝菌丝体样品的RNA，混合后进行RNA seq测序，将测 序结果进彳丁初步筛选，获得待筛选的牛棒芝管家基因序列，将初步筛选后获得的基因序列 进行qRT-PCR扩增，根据扩增结果进行再次筛选，获得上述的牛樟芝管家基因序列。
[0032] 进一步的，所述初步筛选的指标为:FPKM值彡20。
[0033]进一步的，所述再次筛选的指标为:基因表达量差异彡4.5,geNorm软件分析_直< 0 · 5〇
[0034] 进一步的，所述qRT-PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，40个循环进行95°C 变性5s，56 °C退火20s，溶解曲线分析65 °C 5s和95 °C 5s。
[0035] 从上述描述可知，本发明的有益效果在于：
[0036] (1)牛樟芝管家基因在目前已有文献中并无报道。本发明首次公开牛樟芝管家基 因序列，能在不同形态和不同培养时间的牛樟芝样品中稳定表达，且条带单一，为研究牛樟 芝中功能基因表达提供校正序列，保证实验结果的准确性，借助检测每个样品管家基因表 达量就可以用于校正上样误差，使相对定量(2^ Aet)的结果更为可信；
[0037] (2)在获得上述牛樟芝管家基因序列的基础上，还设计出牛樟芝管家基因 qRT-PCR 扩增特异引物序列，对牛樟芝管家基因序列进行特异性扩增；
[0038] (3)此外，还对牛樟芝管家基因序列的筛选方法进行优化设计，提供一种针对牛樟 芝管家基因序列的筛选方法。
[0039] (4)最后，对牛樟芝管家基因序列的扩增条件进行优化，提供一种高效、科学的扩 增反应条件。
[0040]为了筛选到合适的牛樟芝管家基因，可利用qRT-PCR Ct值及溶解曲线结果及 geNorm软件对结果进行分析，最后对筛选到的片段进行引物设计和不同样品间qRT-PCR验 证。具体如下。
[0041 ] 一、RNA seq对牛樟芝进行测序
[0042]将牛樟芝子实体作为样品1号;液体培养14d的牛樟芝菌丝体作为样品2号和培养 28d的牛樟芝菌丝体作为样品3号，每组样品做3个重复试验，分别按TRIzol法提取RNA，然 后，以等量混合样品后进行RNA seq测序。通过测序结果，参考同源物种管家基因研究结果， 在待筛选的牛樟芝管家基因序列中，初步筛选出同源性较高的序列、和三组样品中表达量 均一、且FPKM值多20的序列，作为筛选对象。表1是待筛选的牛樟芝管家基因序列在不同样 品中的FPKM值及其引物序列表。
[0043] 表 1
[0044]
[0045]
[0046] 表2为待筛选的牛樟芝管家基因序列表。
[0047] 表 2
[0048]
[0057]
[0058] 二、候选管家基因引物设计及扩增
[0059] 利用在线软件IDT在线软件(http: //www. idtdna. com/primerquest/Home/Index) 设计引物，具体引物序列见表1，分别对其进行qRT-PCR扩增，qRT-PCR扩增的反应条件为:95 °C预变性5min，40个循环进行95°C变性5s，56°C退火20s，溶解曲线分析65°C5s，95°C5s。
[0060] 图1为待筛选牛樟芝管家基因扩增条带电泳图；
[00611图2为待筛选牛樟芝管家基因溶解曲线特异图；图2a、2b、2c、2d、2f、2g和2h依次对 应。4163、。3670、(311435、。9680、(311385、(：11898、(310657、(311826的待筛选牛樟芝管家基因 序列，其横坐标为温度（°C)，纵坐标为荧光强度的变化值(RFU/dT);
[0062] 图3为待筛选牛樟芝管家基因扩增效率图；图3&、313、3〇、3(1、3匕38和311依次对应 。4163、。3670、(311435、。9680、(311385、(：11898、(310657、(311826的待筛选牛樟芝管家基因序 列，其横坐标为起始拷贝数(Log Starting Quantity)，纵坐标为Ct值；
[0063] 图4为待筛选牛樟芝管家基因 Ct值图；其纵坐标为Ct值，横坐标为待筛选牛樟芝管 家基因序列；横坐标从左到右依次对应c4163、c3670、cll435、c9680、cll385、cll898、 cl0657、cll826的待筛选牛樟芝管家基因序列。
[0064]由图1-4:根据上述8对待筛选管家基因 qRT-PCR中Ct值和溶解曲线检测引物特异 性，结果显示在三组样品中每对引物均能扩增出预期大小片段（图1)，未出现引物二聚体和 其他条带，溶解曲线单一，特异性良好，阴性对照未出现条带（图2)。8个候选管家基因的扩 增Ct值范围在22.68~30.71，扩增效率在100.2%~110.6% (图3)，除c3670和cl 1826编码 的基因外，其他基因表达量差异均<4.5(图4)。
[0065]三、待筛选管家基因的稳定性评价
[0066]图5为不同样品中待筛选牛樟芝管家基因的表达稳定值(M)图；其纵坐标为Μ值，横 坐标为待筛选牛樟芝管家基因序列；横坐标从左到右依次对应cll826、cll435、cll385、 〇9680、(311898、〇4163八10657的待筛选牛樟芝管家基因序列。
[0067]由图5:采用geNorm软件对各候选管家基因的表达稳定性进行统计学分析，结果显 示不同实验条件下的管家基因的表达稳定值(M值）中，C11826M值>1.5，c4161和C10657M值 最小（图5)，且在各组实验中表达稳定。通过标准化因子对差异分析得出两两比较的变异值 (V)，最终筛选出2个以上的管家基因，有利于校正系统偏差，得到更准确的基因表达结果。 对候选管家基因的配对差异值Vn/n+Ι进行分析，当Vn/n+l〈0.15时说明无需加入第n+1个基 因进行校正，最合适的基因内参数是n，按照Μ值排序选择前η个基因作为内参基因。
[0068] 当以样品1号、样品2号和样品3号的cDNA为模板时，c4163和C10657的Μ值最小且稳 定性最佳，可作为最优管家基因，即当利用qRT-PCR分析比较不同形态或培养条件下的牛樟 芝基因表达量时，可选择c4163和C10657作为校正管家基因，其完整序列见表2。
【具体实施方式】 [0069]
[0070] 将c4163和C10657序列在三种不同样品中进行表达量的比较，总三次实验，每组实 验作3个重复，上述三次实验的具体反应条件如下表。表3为第一次实验时c4163的具体反应 条件表;表4为第一次实验时cl 0657的具体反应条件表。
[0071] 表3
[0072]
[0073]
[0074]
[0075] 表5为第二次实验时C4163的具体反应条件表;表6为第二次实验时C10657的具体 反应条件表。
[0076] 表 5
[0077]
[0078]
[0079]
[0080] 表7为第三次实验时c4163的具体反应条件表;表8为第三次实验时C10657的具体 反应条件表。
[0081] 表 7
[0082]
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]选取三组样品中的基因，利用c4163和C10657作为管家基因对结果进行分析，反应 条件为:95°C预变性5min，40个循环进行95°C变性5s，56°C退火20s，溶解曲线分析65°C5s， 95°C5s〇
[0087] 图6为c4163和C10657作为管家基因与三组样品中的基因的Ct值对比图；其纵坐标 为 Ct 值，横坐标从左到右依次对应 c4163、cl0657、cl5050、c8536、c9302、cl0883、cll651、 cl 1391的三组样品中的基因序列。
[0088] 由图6中可以看出，两对管家基因具有的稳定性好的性质，且和目的基因样品的差 异明显。
[0089] 综上所述，本发明提供的牛樟芝管家基因序列能在不同形态和不同培养时间的牛 樟芝样品中稳定表达，且条带单一，为研究牛樟芝中功能基因表达提供校正序列。
[0090]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技 术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种牛樟芝管家基因序列，其特征在于，所述管家基因序列为C4163或C10657的序 列，所述c4163的序列如SEQ ID N0:1，所述C10657的序列如SEQ ID N0:2。2. -种权利要求1所述的牛樟芝管家基因序列的qRT-PCR扩增引物，其特征在于，所述 c4163的序列的正向引物的序列如SEQ ID N0:9,所述c4163的序列的反向引物的序列如SEQ ID N0:10； 所述cl0657的序列的正向引物的序列如SEQ ID勵：11，所述(：10657的序列的反向引物 的序列如SEQ ID NO: 12。3. -种牛樟芝管家基因序列的qRT-PCR扩增方法，其特征在于，包括权利要求1所述的 牛樟芝管家基因序列和权利要求2所述的qRT-PCR扩增引物，所述qRT-PCR扩增的反应条件 为:93-97 °C预变性3-7min，38-42个循环进行93-97 °C变性3-7s，54-58 °C退火20s，溶解曲线 分析63-67 °C3-7s 和93-97 °C3-7s。4. 根据权利要求3所述的牛樟芝管家基因序列的qRT-PCR扩增方法，其特征在于，所述 qRT-PCR扩增的反应条件为:95 °C预变性5min，40个循环进行95 °C变性5s，56 °C退火20s，溶 解曲线分析65 °C 5s和95 °C 5s。5. -种权利要求1所述的牛樟芝管家基因序列的筛选方法，其特征在于，取牛樟芝实体 和牛樟芝菌丝体作为样品，然后分别提取牛樟芝实体和牛樟芝菌丝体样品的RNA，混合后进 行RNA seq测序，将测序结果进行初步筛选，获得待筛选的牛樟芝管家基因序列，将初步筛 选后获得的基因序列进行qRT-PCR扩增，根据扩增结果进行再次筛选，获得权利要求1所述 的牛棒芝管家基因序列。6. 根据权利要求5所述的牛樟芝管家基因序列的筛选方法，其特征在于，所述初步筛选 的指标为:FPKM值彡20。7. 根据权利要求5所述的牛樟芝管家基因序列的筛选方法，其特征在于，所述再次筛选 的指标为:基因表达量差异彡4.5，geNorm软件分析M值<0.5。8. 根据权利要求5所述的牛樟芝管家基因序列的筛选方法，其特征在于，所述qRT-PCR 扩增的反应条件为:95°C预变性5min，40个循环进行95°C变性5s，56°C退火20s，溶解曲线分 析 65°C5s 和 95°C5s。
【文档编号】C12N15/10GK105907768SQ201610292646
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】李晶, 林雄杰, 张双双, 林占熺, 刘朋虎
【申请人】福建农林大学