均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法
【专利摘要】本发明涉及利用均匀磁场提高超顺磁性基因载体细胞转染率的方法，在均匀磁场下，可以使携带基因的超顺磁性载体，加入到培养细胞液中，经过轻微振动，均匀地分散在培养液中，将此培养容器置于均匀磁场下，在均匀磁场力的作用下，便能够将携带基因的超顺磁性载体，均匀驱使到培养容器中的细胞表面(包括贴壁培养的或悬浮培养的细胞)，使体系中的所有的细胞均有同等的机会，接触到携带基因的超顺磁性载体，这样便能够最小量地使用基因的载体浓度，获得最大的基因转染效率，同时降低了高浓度超顺磁性基因载体对细胞的毒性。本发明具有简便、安全、可重复使用等优点，应用前景广阔。
【专利说明】
均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法
技术领域
[0001]本发明属于超顺磁性纳米基因载体优化细胞转染技术领域，涉及一种均匀磁场提高超顺磁性载药基因载体细胞转染率的方法。
【背景技术】
[0002]目前超顺磁性纳米基因载体转染过程中所应用的磁场的因均匀度差，致使超顺磁性纳米基因载体转染效率不高，是因为非均匀磁场提供的磁场力使携带目的基因的超顺磁性纳米，偏向磁场较强的区域，致使1.局部区域的细胞接受了高浓度的基因载体，增加了局部载体对细胞的毒性，大量细胞死亡;2.同一培养体系内其他细胞不能接触到携带基因的载体而不能获得目的基因的转染;3.同时增加培养体系中磁性基因载体总浓度，也不能均勾地提尚体系内细胞接触磁性载体的绝对数量;4.应用均勾磁场提尚超顺磁性载药基因载体细胞转染率的方法及装置，便能解决了现有技术中存在的问题。目前尚未见应用均匀磁场提高超顺磁性基因载体细胞转染率的报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，解决了现有技术中存在的因磁场的均匀度教差，致使超顺磁性纳米基因载体转染效率不高的问题。
[0004]本发明所采用的技术方案是，均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法在培养细胞基因行磁性转染过程中，将超顺磁性载基因载体与基因复合，将细胞转染体系置于均匀磁场内，完成超顺磁性载体基因复合物向培养细胞的基因转染。
[0005]超顺磁性载药基因载体复合物与待转染的目的基因复合后，通过滴入、喷雾方法加入到细胞培养液中，混匀后，置于均匀磁场中，观察I小时到一周，通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察记数或流式细胞仪测定细胞报告基因荧光蛋白表达的数据，确定细胞基因转染的效率，完成超顺磁性载体基因复合物的细胞转染。
[000?] 均勾磁场，是借助Halbach磁体结构采用多个矩形磁块构成的半环或环形Halbach磁体阵列结构，调节各磁体模块中心点所在椭圆曲线的长轴长度，计算YOZ平面内不同高度上磁场的平坦程度，使用Gram-Schmidt数据拟合方法，得到一种平坦程度最优的磁体结构获得的均匀磁场;可将单元磁体或单元圆柱磁体均匀分为2等分、3等分、4等分、6等分及无数等分，并使相邻磁体的极性相反，通过测量磁体改变极性后的磁场分布获得均匀磁场。
[0007]均匀磁场，是通过通电流的长直螺旋管或螺绕环获得的均匀磁场；或是通过通电流的亥姆霍兹线圈及共轴多线圈获得的均匀磁场;或是通过无限大均匀通电的导电金属体平面附近获得的均匀磁场;或是通有反向等大电流密度的两平行的金属导体交叠区域内的均匀磁场;或是部分挖空的通电圆柱形导体内的均匀磁场;上述导体通电的电流是直流电、交流电、振荡电流、正弦波、方波、三角波、陡脉冲电流或陡脉冲电压电流。
[0008]均勾磁场的面积为Imm X Imm?Im X Im，均勾度为10000ppm?1ppm，磁场强度为0.ΟΟΙΑ/m ?ΙΟΟΟΑ/m，磁感应强度为 1Gauss ?3T。
[0009]采用超顺磁性微粒作为基本载药基因载体，超顺磁性材料包括超顺磁性材料和软磁材料；
[0010]超顺磁性材料为粒径小于30nm的磁性材料，包括由元素铁、氧化铁、钴、镍及其合金能够直接或间接产生磁性的物质；如高碳钢，招镍钴合金，钛钴合金，钡铁氧体，r一Fe203或Cr02细粉;
[0011]软磁材料是加磁场既容易磁化，又容易退磁，即矫顽力很低的磁性材料，如软铁，硅钢，铁镍合金等。
[0012]所述超顺磁性载基因载体在复合微粒中的位置，可以是在微粒的内层、外层(壳-核结构)、中层(三层以上结构)或与其它材料相互混合而行成复合材料(外形有:固体、半固体颗粒及各种平面或立体外形)；
[00?3 ]所述的超顺磁性载药基因载体的粒径范围是Inm—200nm。
[0014]超顺磁性载药(基因)载体与药物及包裹材料之间的结合，可以是物理结合:如通过吸附(如:静电、磁性、弱作用力等)、混合、嵌入、填入、包覆、包埋、相嵌、粘附等;也可以是化学结合:如配位、键合等及生物性结合如抗原与抗体、配体与受体、单链DNA或单链RNA或SiRNA结合而形成的微粒)。超顺磁性载药基因载体复合物与待转染的目的基因复合是按一定的比例的复合;其比例包括N/P比，N是指超顺磁性基因载体复合物中的氮含量，P是指超顺磁性基因载体复合物中基因物质磷的含量，其N/P比范围为200:1?1: 200;超顺磁性微粒为通过各种方法制备而成的超顺磁性的脂质体、微球、微囊、微泡、或混合而成的颗粒。
[0015]超顺磁性载药基因载体的材料是指天然的或人工的聚合物;天然类可生物降解的聚合物是葡聚糖、壳聚糖及其衍生物，氨基酸类聚合物是精氨酸，寡聚精氨酸、聚赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、白蛋白、胶原蛋白、明胶、酪蛋白、蚕丝蛋白以及它们的混合体及卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、硬脂酰及其衍生物;人工合成聚合物是聚乙二醇、聚乳酸、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙醇酸及其混合物、共聚物和同聚物，如:聚乳酸-聚乙二醇共聚物、乳酸/羟基乙酸共聚物。
[0016]应用磁性纳米粒作为基本基因载体，将磁性纳米粒与高分子材料复合后形成纳米级磁性微粒，即为超顺磁性材料。
[0017]纳米级磁性微粒为纳米级Fe、Fe304、Fe203、Co203、Ni0中的任意一种，
[0018]混匀方法包括振动、搅拌、超声或均质机的均匀方法。
[0019]本发明的有益效果是，在均匀磁场下，可以使携带基因的超顺磁性载体，在添加到培养细胞液中后，经过轻微振动，均匀地分散在培养容器的培养液中，将此培养容器置于均匀磁场中，在均匀磁场力的作用下，便能够将携带基因的超顺磁性载体，均匀分散地驱使到培养容器中的细胞表面(包括贴壁培养的或悬浮培养的细胞)，使体系中的所有的细胞均有同等的机会，接触到携带基因的超顺磁性载体，这样便能够最小量地使用携带基因的超顺磁性载体浓度，获得最大的基因转染效率，同时降低了高浓度超顺磁性基因载体对细胞的毒性。本发明具有简便、安全、可重复使用等优点，应用前景广阔。
【附图说明】
[0020]图1是本发明的均匀磁场装置结构图；
[0021]图2是图1磁场装置的黑色面板表面磁场分布图；
[0022]图3是本发明的磁转染流程图；
[0023]图4是本发明的磁性PEI的饱和磁化强度图；
[0024]图5是本发明的磁性PEI在均匀磁场中的分布图；
[0025]图6是本发明的磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜图；
[0026]图7是本发明的磁性PEI/pDNA保护质粒实验图；
[0027]图8是本发明的均匀磁场促进MPEI20000转染MG63细胞流式结果图；
[0028]图9是本发明的普通磁场促进MPEI20000转染MG63细胞流式结果图；
[0029]图10是本发明的均匀磁场促进MPEI20000转染MG63细胞荧光图；
[0030]图11是本发明的普通磁场促进10^120000转染1^63细胞荧光图。
【具体实施方式】
[0031 ]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0032]本发明均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，均匀磁场提高超顺磁性载药基因载体细胞转染率的方法将超顺磁性载药基因载体与基因复合，置于均匀磁场内，完成超顺磁性载体基因复合物的细胞转染。
[0033]超顺磁性载药基因载体复合物与待转染的目的基因复合后，通过滴入、喷雾方法加入到细胞培养液中，混匀后，置于均匀磁场中，观察I小时到一周，通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察记数或流式细胞仪测定细胞报告基因荧光蛋白表达的数据，确定细胞基因转染的效率，完成超顺磁性载体基因复合物的细胞转染。
[0034]均勾磁场，是借助Halbach磁体结构采用多个矩形磁块构成的半环或环形Halbach磁体阵列结构，调节各磁体模块中心点所在椭圆曲线的长轴长度，计算YOZ平面内不同高度上磁场的平坦程度，使用Gram-Schmidt数据拟合方法，得到一种平坦程度最优的磁体结构获得的均匀磁场;可将单元磁体或单元圆柱磁体均匀分为2等分、3等分、4等分、6等分及无数等分，并使相邻磁体的极性相反，通过测量磁体改变极性后的磁场分布获得均匀磁场。
[0035]均匀磁场，是通过通电流的长直螺旋管或螺绕环获得的均匀磁场；或是通过通电流的亥姆霍兹线圈及共轴多线圈获得的均匀磁场;或是通过无限大均匀通电的导电金属体平面附近获得的均匀磁场;或是通有反向等大电流密度的两平行的金属导体交叠区域内的均匀磁场;或是部分挖空的通电圆柱形导体内的均匀磁场;上述导体通电的电流是直流电、交流电、振荡电流、正弦波、方波、三角波、陡脉冲电流或陡脉冲电压电流。
[0036]均勾磁场的面积为Imm X Imm?Im X Im，均勾度为10000ppm?1ppm，磁场强度为0.001A/m ?1000A/m，磁感应强度为 1Gauss ?3T。
[0037]采用超顺磁性微粒作为基本载药基因载体，超顺磁性材料包括超顺磁性材料和软磁材料；
[0038]超顺磁性材料为粒径小于30nm的磁性材料，包括由元素铁、氧化铁、钴、镍及其合金能够直接或间接产生磁性的物质；如高碳钢，招镍钴合金，钛钴合金，钡铁氧体，r一Fe203或Cr02细粉;
[0039]软磁材料是加磁场既容易磁化，又容易退磁，即矫顽力很低的磁性材料，如软铁，硅钢，铁镍合金等。
[0040]所述超顺磁性载基因载体在复合微粒中的位置，可以是在微粒的内层、外层(壳-核结构)、中层(三层以上结构)或与其它材料相互混合而行成复合材料(外形有:固体、半固体颗粒及各种平面或立体外形)；
[0041 ]所述的超顺磁性载药基因载体的粒径范围是Inm — 200nm;最好的粒径范围是lnm—30nmo
[0042]超顺磁性载药基因载体是指超顺磁性微粒与药物及包裹材料之间的结合，可以是物理结合:如通过吸附(如:静电、磁性、弱作用力等)、混合、嵌入、填入、包覆、包埋、相嵌、粘附等；也可以是化学结合:如配位、键合等及生物性结合如抗原与抗体、配体与受体、单链DNA或单链RNA或SiRNA结合而形成的微粒。超顺磁性载药基因载体复合物与待转染的目的基因复合是按一定的比例复合;其比例包括N/P比，N是指超顺磁性基因载体复合物中的氮含量，P是指超顺磁性基因载体复合物中基因物质磷的含量，其N/P比范围为200:1?1:200;超顺磁性微粒为通过各种方法制备而成的超顺磁性的脂质体、微球、微囊、微泡、或混合而成的颗粒。
[0043]超顺磁性载药基因载体的材料是指天然的或人工的聚合物;天然类可生物降解的聚合物是葡聚糖、壳聚糖及其衍生物，氨基酸类聚合物是精氨酸，寡聚精氨酸、聚赖氨酸、组氨酸，白蛋白、胶原蛋白、明胶、酪蛋白、蚕丝蛋白以及它们的混合体及卵磷脂、脑磷脂、胆固醇；人工合成聚合物是聚乙二醇、聚乳酸、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙醇酸及其混合物、共聚物和同聚物，如:聚乳酸-聚乙二醇共聚物、乳酸/羟基乙酸共聚物。
[0044]应用磁性纳米粒作为基本基因载体，将磁性纳米粒与高分子材料复合后形成纳米级磁性微粒，即为超顺磁性材料。
[0045]纳米级磁性微粒为纳米级Fe、Fe304、Fe203、Co203、Ni0中的任意一种，
[0046]混匀方法包括振动、搅拌、超声或均质机的均匀方法。
[0047]实施例一:
[0048]均匀磁场装置的结构如图1所示，借助Halbach磁体结构，采用9个矩形磁块构成的半环Ha I bach磁体结构，磁体整体尺寸为380mm* 100mm* 150mm，载物平板尺寸为180mm*I OOmm，磁体整体重量为18kg。
[0049]从图2可以看出，图中红色区域为磁场相对均匀区域，其均匀度大约为千分之五，磁场在目标区域内的梯度为大约为I.3T/m。
[0050]实施例二:
[0051]步骤I，获得均匀磁场
[0052]将单元磁体或单元圆柱磁体均匀分为2等分、3等分、4等分、6等分及无数等分，并使相邻磁体的极性相反，通过测量磁体改变极性后的磁场分布获得均匀磁场。
[0053]此均勾磁场借助Halbach磁体结构，采用多个矩形磁块构成的半环或环形Halbach磁体阵列结构，调节各磁体模块中心点所在椭圆曲线的长轴长度，计算YOZ平面内不同高度上磁场的平坦程度，使用Gram-Schmidt数据拟合方法，得到一种平坦程度最优的均匀磁场。
[0054]均匀磁场可通过通电流的长直螺旋管或螺绕环获得、通过通电流的亥姆霍兹线圈及共轴多线圈获得、通过无限大均匀通电的导电金属体平面附近获得、通过通有反向等大电流密度的两平行的金属导体交叠区域获得、通过部分挖空的通电圆柱形导体获得。
[0055]上述导体通电的电流可以是直流电、交流电、振荡电流、正弦波、方波、三角波、陡脉冲电压电流或陡脉冲电流。
[0056]均匀磁场在一个方向可以是均匀梯度变化的磁场，梯度值范围为0.2mT/mm?3T/mm η
[0057]均勾磁场的面积为Imm X Imm?Im X Im，均勾度为10000ppm?1ppm，磁场强度为
0.001A/m ?1000A/m，磁感应强度为 1Gauss ?3Τ。
[0058]步骤2，获得超顺磁性基因载体
[0059]1.制备磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒
[0000]分别配制浓度为5mg/mL-50mg/mL的超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒溶液和浓度为101^/1^-10011^/1^的聚乙烯亚胺溶液，调节四氧化三铁纳米颗粒溶液?!1值为4.5-7，搅拌条件下加入0.1g-0.5g和0.5g-2.5gNHS活化四氧化三铁纳米颗粒表面的羧基，然后加入与超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒溶液等体积的聚乙烯亚胺溶液，室温条件下持续搅拌3-6h，然后经截留分子量为2000的透析袋持续透析2-4d收集磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒，冷冻干燥备用。
[0061 ] 2.制备磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液
[OO62 ] 将I制备的磁性聚乙稀亚胺纳米颗粒，加入灭菌的双蒸水，配制5mg/mL-5 0mg/mL的磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液，将此溶液摇匀，于3?4°C保存备用。
[0063]3.磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液的DNA结合实验
[0064]取2制备的磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液100-200uL与pDNA按N/P分别为1/5、1、5、10、15、20、25及30的比例混匀，于37°(:、0)2浓度为5%的条件下混合孵育10-301^11，配$1」1%的琼脂糖凝胶于90mv条件下电泳30min，然后将凝胶于紫外光谱仪下观察磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒与DNA的结合情况，若点样孔以下观察到白色的pDNA条带，说明此N/P条件下的磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒与PDNA未完全结合，反之则说明聚乙烯亚胺纳米颗粒与pDNA已完全
?士么云口口 ο
[0065]4.磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液的脱氧核糖核酸酶I保护实验
[0066]取3制备的磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液100-200uL与pDNA按Ν/Ρ分别为1/5、1、5、10、15、20、25及30的比例混匀，于37°(:、0)2浓度为5%的条件下孵育10-301^11，在磁性聚乙烯亚胺和PDNA复合物中加入1/10体积的反应缓冲液，然后加入2ul浓度为2U/ul的脱氧核糖核酸酶I于37 0C、C02浓度为5 %的条件下孵育10-30min消化pDNA，向上述复合物中加入乙二胺四乙酸溶液至最终浓度为l-4mM/L后，65°C加热10分钟使脱氧核糖核酸酶I失活，最后，向复合物中加入4ul浓度为lmg/ml的肝素钠室温放置l-3h促使pDNA从磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒中释放，配制I %的琼脂糖凝胶于90mv条件下电泳30min，然后将凝胶于紫外光谱仪下观察PDNA的完整性，若点样孔以下观察到白色的pDNA条带，说明此N/P条件下的磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒具有保护PDNA不受核酸酶降解的作用，反之则说明此N/P条件下的磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒未完全浓缩保护pDNA。
[0067]步骤3，完成超顺磁性基因载体细胞的转染。
[0068]选取可结合pDNA及保护pDNA不被核酸酶降解的N/P制备聚乙烯亚胺纳米颗粒和pDNA的复合物，将MG-63、293等细胞以IxlO5/孔的比例数接种于细胞培养板中，于37°C、C02浓度为5%的条件下培养直至细胞融合度达到80%-90%，转染前l-3h将培养基吸走，磷酸盐缓冲液清洗2遍，每孔加入800ul-1000uL无添加培养基，按12孔板中每孔加入3-6ug的pDNA，24孔板中加入l-3ug的pDNA的比例，将pDNA加入磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液中，加入无血清培养基使体系总量达到200uL，振荡混匀后于370C、⑶2浓度为5%的条件下混合孵育10-30min，将磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒溶液和pDNA复合物加入细胞中，轻轻摇晃细胞培养板，然后将培养板置于步骤I所获得的均匀磁场中作用20-40min，作用时间完毕后移走培养板，继续培养4_6h后用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤细胞2遍，加入含血清培养基继续培养细胞直至24h，通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察记数或流式细胞仪测定细胞报告基因荧光蛋白表达的数据，确定细胞基因转染的效率。
[0069]本发明均匀磁场提高超顺磁性载药基因载体细胞转染率的方法，细胞在磁场中的转染流程如图3所示，在一个结构单元内，支链PEI较直链PEI具有更多的氨基，NHS可活化超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒表面的羧基而使支链及直链PEI上的伯胺通过酰胺键与羧基牢固的结合，磁性PEI的饱和磁化强度如图4所示。磁性聚乙烯亚胺的磁滞回线通过EV-1lVibrating Same Magnetometer来检测，聚乙稀亚胺磁化后的饱和磁化强度为+21.5( 土1.6)emu/g，虽较磁性四氧化三铁纳米粒有所降低，然而，在集中磁场作用下，磁性聚乙烯亚胺仍可进行快速有效的浓聚，在均匀磁场作用下，磁性聚乙烯亚胺可均匀一致地分布，磁性PEI在均勾磁场中的分布如图5所不。
[0070]磁化聚乙烯亚胺MPEI20000/pDNA在透射电镜下的结构如图6所示，呈球形。当N/P比值为2.5/1时，其粒径为200(±2.7)11111。然而，当~?比值为5/1，聚乙烯亚胺纳米颗粒/pDNA的粒径有所下降，为+175(±2.4)nm。
[0071]基因载体的一个基本要求是能与核酸形成稳定的复合物，为评价核酸的结合性能，我们将磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒与PDNA按不同的N/P比混合，进行琼脂糖凝胶电泳观察pDNA的结合情况，裸质粒用作对照，pDNA的量固定为4ug，磁性聚乙稀亚胺与pDNA的N/P分别为1/5、1、5、10、15、20、25及30。当~?为5时，？0嫩的迀移被阻滞，我们可以推断当~?为5左右时，磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒足够完全浓缩质粒。DNA的保护功能是作为基因载体另一关键的要素，基因载体只有保护DNA不被核酸酶降解才能保证DNA进行有效的转染。磁性PEI/pDNA保护质粒结果如图7所示，脱氧核糖核酸酶I作为体内核酸酶的模拟酶，MPEI/pDNA与脱氧核糖核酸酶I在DNase/Mg2+消化缓冲液中孵育10-30min后，裸质粒与未被磁性聚乙烯亚胺浓缩的质粒几乎完全被降解。然而，被磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒完全浓缩的PDNA在肝素钠的作用下释放后行琼脂糖凝胶电泳仍可见基因的完整性，这说明磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒具有保护DNA不被核酸酶降解的作用，提示磁性聚乙烯亚胺纳米颗粒具有一定的体内应用前景。
[0072]为了进一步确定MPEI作为基因载体在磁场作用下携带基因转染的情况，为评价磁转染的效果，我们将MG-63骨肉瘤细胞系作为检测对象，用GFP-pDNA作为报告基因。N/P比值较低时，基因载体并不能浓缩保护质粒免受核酸酶的降解，也不利于复合物与带负电荷的细胞表面接触。N/P比值过高时，不仅会使细胞毒性增加，而且还可增加复合物的粒径，不利于基因载体的转运。当N/P比值为5时，MPEI/pDNA复合物粒径最小，具有一定的稳定性。当N/P比大于1:1时，磁性PEI的ζ电位不再显著性的升高，因此，为保证MPEI /pDNA复合物的稳定性，本发明将转染时的N/P比值固定为1:1。细胞提前I天接种于12孔板中，转染前Ih将培养孔中的培养基换成无添加培养基，将MPEI/pDNA复合物加入孔中，分别用均匀磁场和集中磁场(Nd-Fe-B永久磁板，chemicel I)于培养板下面作用细胞20min后移开，培养4_6h后用PBS冲洗未被吞噬的磁性复合物，加入10 %FBS培养基继续培养，继续培养24小时观察绿色荧光表达情况。聚乙烯亚胺的转染率随分子量的增加而增加，BPEI1800转染率较LPEI4000转染率高。
[0073]磁化后的PEI在磁场作用下均较未磁化PEI具有更高的转染率，转染率最高可达27.1%。根据我们前期的研究基础，均匀磁场作用下的磁性PEI纳米颗粒溶液与商业化的磁转染试剂PolyMag-200比较，转染率明显提高，且细胞毒性明显降低，商业化转染试剂Lipof ectamine-2000虽然细胞毒性较低，已经证实可转染大部分的贴壁细胞，然而，它并不能较好的转染MG-63细胞。转染48h后收集细胞行流式细胞检测，MPEI20000转染MG63在均匀磁场和普通磁场中的细胞流式结果分别如图8、图9、图10、图11所示，可见在均匀磁场中的转染率高于在普通磁场中的转染率。
[0074]本发明均匀磁场提高超顺磁性载药基因载体细胞转染率的方法，在均匀磁场下，可以使携带基因的超顺磁性载体，在添加到培养细胞液中后，经过轻微振动，均匀地分散在培养容器的培养液中，将此培养容器置于均匀磁场中，在均匀磁场力的作用下，便能够将携带基因的超顺磁性载体，均匀分散地驱使到培养容器中的细胞表面(包括贴壁培养的或悬浮培养的细胞)，使体系中的所有的细胞均有同等的机会，接触到携带基因的超顺磁性载体，这样便能够最小量地使用携带基因的超顺磁性载体浓度，获得最大的基因转染效率，同时降低了高浓度超顺磁性基因载体对细胞的毒性。本发明具有简便、安全、可重复使用等优点，应用前景广阔。
【主权项】
1.均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，其特征在于，在培养细胞基因行磁性转染过程中，将超顺磁性载基因载体与基因复合，将细胞转染体系置于均匀磁场内，完成超顺磁性载体基因复合物向培养细胞的基因转染。2.根据权利要求1所述的均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，其特征在于，超顺磁性载基因载体复合物与待转染的目的基因复合后，通过滴入、喷雾方法加入到细胞培养液中，混匀后，置于均匀磁场中，通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察记数或流式细胞仪测定细胞报告基因荧光蛋白表达的数据，确定细胞基因转染的效率，完成超顺磁性载体基因复合物的细胞转染。3.根据权利要求1所述的均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，其特征在于，所述均匀磁场，可以是借助Halbach磁体结构采用多个矩形磁块构成的半环或环形Halbach磁体阵列结构，调节各磁体模块中心点所在椭圆曲线的长轴长度，计算YOZ平面内不同高度上磁场的平坦程度，使用Gram-Schmidt数据拟合方法，得到一种平坦程度最优的磁体结构获得的均匀磁场;也可以是将单元磁体或单元圆柱磁体均匀分为2等分、3等分、4等分、6等分及无数等分，并使相邻磁体的极性相反，通过测量磁体改变极性后的磁场分布获得均勾磁场。4.根据权利要求1所述的均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，其特征在于，所述均匀磁场，是通过通电流的长直螺旋管或螺绕环获得的均匀磁场;或是通过通电流的亥姆霍兹线圈及共轴多线圈获得的均匀磁场;或是通过无限大均匀通电的导电金属体平面附近获得的均匀磁场;或是通有反向等大电流密度的两平行的金属导体交叠区域内的均匀磁场;或是部分挖空的通电圆柱形导体内的均匀磁场;上述导体通电的电流是直流电、交流电、振荡电流、正弦波、方波、三角波、陡脉冲电流或陡脉冲电压电流。5.根据权利要求1所述的均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，其特征在于，所述均勾磁场的面积为Imm X Imm?Im X Im，均勾度为10000ppm?1ppm，磁场强度为0.001A/m?1000A/m，磁感应强度为1Gauss?3T。6.根据权利要求1所述的均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，其特征在于，采用超顺磁性微粒作为基本载药基因载体，超顺磁性材料包括超顺磁性材料和软磁材料； 所述超顺磁性材料为粒径小于30nm的磁性材料，包括由元素铁、氧化铁、钴、镍及其合金能够直接或间接产生磁性的物质； 所述软磁材料是加磁场既容易磁化，又容易退磁，即矫顽力很低的磁性材料； 所述超顺磁性载基因载体在复合微粒中的位置，可以是在微粒的内层、外层、中层或与其它材料相互混合而行成复合材料； 所述的超顺磁性载药基因载体的粒径范围是Inm—200nm。7.根据权利要求1所述的均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，其特征在于，超顺磁性载基因载体与基因复合，其结合方式在于超顺磁性载药基因载体与药物及包裹材料之间的结合，可以是物理结合、化学结合或生物性结合;超顺磁性载药基因载体复合物与待转染的目的基因复合是按一定的比例复合;其比例包括N/P比，N是指超顺磁性基因载体复合物中的氮含量，P是指超顺磁性基因载体复合物中基因物质磷的含量，其N/P比范围为200:1?1:200;超顺磁性微粒为通过各种方法制备而成的超顺磁性的脂质体、微球、微囊、微泡、或混合而成的颗粒。8.根据权利要求1所述的均匀磁场提高超顺磁性载基因载体细胞转染率的方法，其特征在于，所述的超顺磁性载药基因载体的材料是指天然的或人工的聚合物;天然类可生物降解的聚合物是葡聚糖、壳聚糖及其衍生物，氨基酸类聚合物是精氨酸，寡聚精氨酸、聚赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸，白蛋白、胶原蛋白、明胶、酪蛋白、蚕丝蛋白以及它们的混合体及卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、硬脂酰及其衍生物;人工合成聚合物是聚乙二醇、聚乳酸、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚乙醇酸及其混合物、共聚物和同聚物，如:聚乳酸-聚乙二醇共聚物、乳酸/羟基乙酸共聚物。
【文档编号】C12N15/87GK105907791SQ201610296456
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】罗聪, 岑超德, 谢丽娜, 徐征
【申请人】重庆医科大学附属儿童医院