一种发酵法提取鱿鱼眼中透明质酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵法提取鱿鱼眼中透明质酸的方法，属于透明质酸领域。本发明先活化兽疫链球菌得菌液，再从鱿鱼眼加入兽疫链球菌液进行发酵培养得发酵液，对发酵液醇沉得粗透明质酸钠沉淀物，加入氯化钠溶液溶解后加入胰蛋白酶酶解得酶解液，将酶解液中的透明质酸钠络合反应得络合物，分离后解离，调节解离液pH后用超滤膜过滤，得透明质酸钠水溶液，通过阳离子交换树脂，得透明质酸水溶液，蒸发浓缩后真空干燥得透明质酸粉末，本发明利用微生物发酵法从鱿鱼眼制得透明质酸，不仅制备方法简单，成本低廉，而且提取率为45～60%、纯度为95.9～99.9％、生物活性高、保湿性强，在化妆品中具有广泛的应用。
【专利说明】
一种发酵法提取鱿鱼眼中透明质酸的方法
技术领域
[0001]本发明公开了一种发酵法提取鱿鱼眼中透明质酸的方法，属于透明质酸领域。
【背景技术】
[0002]透明质酸是一种糖胺聚糖，在人体内广泛分布，大于50%的HA分布在人体的皮肤、肺、肠道中，在血液、关节滑液、脐带中也有分布。其为人体的正常生理活动发挥着重要作用，如影响细胞的增殖和分化、调节蛋白质、润滑关节、调节血管壁的通透性、创伤修复等。由于其特殊的生理功能，近年来透明质酸在医药、保健品行业得到广泛的应用。
[0003]鱿鱼眼睛玻璃体含有丰富的透明质酸，由于透明质酸具有保湿、抗氧化等多种活性而备受关注，而鱿鱼眼睛又是沿海地区一类数量较大的废弃物，可以作为提取透明质酸的资源。
[0004]透明质酸的生产方法有以动物组织为原料的提取法和微生物发酵法。从动物组织中提取HA常用的原料有鸡冠、脐带、眼玻璃体和猪皮等，生产工艺过程主要包括原料脱水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分级分离等。提取法由于原料有限，且原料中HA含量较低，因而生产成本较高，限制了它的应用。微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜而生产透明质酸的方法，与动物组织提取法相比，发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、保湿性强、品质稳定、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产、且无动物来源致病病毒污染的危险等优点。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对传统采用动物组织为原料提取透明质酸的生产过程中，会导致分离过程复杂、透明质酸价格昂贵、无法在化妆品中大量使用，以及提取率极低的问题，提供了一种发酵法提取鱿鱼眼中透明质酸的方法，本发明先活化兽疫链球菌得菌液，再从鱿鱼眼加入兽疫链球菌液进行发酵培养得发酵液，从发酵液中进行醇沉得沉淀物，加入氯化钠溶液溶解后加入胰蛋白酶酶解得酶解液，将酶解液中的透明质酸进行络合反应得络合物，分离后解离液，调节PH后截留用超滤膜过滤，即可得透明质酸钠水溶液，通过阳离子交换树脂，得透明质酸水溶液，蒸发浓缩后真空干燥得透明质酸粉末，本发明利用微生物发酵法从鱿鱼眼制得透明质酸，不仅制备方法简单，成本低廉，而且提取率高、纯度好、生物活性高、保湿性强，在化妆品中具有广泛的应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)将冷冻保存的兽疫链球菌ATCC39920接种到液体培养基中，在35?37°C温度下培养20?24h，培养后得活化的兽疫链球菌菌液，备用；所述的液体培养基为15?20g蛋白胨、12?16g葡萄糖、0.5?0.8g磷酸氢二钠、3?4g氯化钠，加水定容到I?2L，并调节pH值为7.0，调节后在120?125°C下高温灭菌处理10?20min;
(2)称取200?250g鱿鱼眼放入丙酮中浸泡I?2h后取出，在通风处放置5?7h后放入绞碎机中绞碎，将绞碎后的鱿鱼眼按质量比I: I和水混合，并研磨成糊状物，再将糊状物按质量比1:10与质量分数I?3%氯化钠溶液混合，放入锅中，在70?800C下蒸煮15?20min，蒸煮后冷却至37?40°C，用质量分数10%氢氧化钠溶液调节pH值为7.5?8.0;
(3)向上述调节后pH的混合液中加入总质量I?2%酵母粉和混合液体积3?5%步骤(I)备用的兽疫链球菌菌液，保持在37?40 °C温度下发酵培养18?20h，发酵培养后用纱布过滤，得发酵液；
(4)将上述发酵液用质量分数15%盐酸调节pH值为5.5?6.0，调节后加入总体积2?4倍质量分数90%乙醇溶液，机械搅拌20?30min后离心分离，得沉淀物，并用无水乙醇清洗2?3次，放入真空干燥箱中在50?60 °C下干燥3?5h;
(5)将上述干燥后的固体按固液比1:10与质量分数5%氯化钠溶液混合，搅拌至固体溶解，溶解后用质量分数15%盐酸调节pH值为7.0，并向其中加入7000?8000U/g胰蛋白酶，在180?250?下超声处理15?20111；[11，处理后在50?55 °C下酶解2?3h后在100°C下灭菌5?1min，离心分离得上清液；
(6 )将上述上清液放入浓缩罐中减压浓缩至原体积15?20%，向浓缩液中加入浓缩液体积2?3%浓度60?80g/L十六烷基三甲基溴化铵溶液，络合反应30?40min后离心分离得络合物，将络合物溶于质量分数15%氯化钠溶液中解离2?3h，得解离液，并调节pH值为3.0?4.0，调节后用截留分子量4X 14?9X 14的超滤膜过滤，得透明质酸钠水溶液，通过阳离子交换树脂，得透明质酸水溶液，蒸发浓缩后真空干燥得透明质酸粉末。
[0007]本发明的应用方法:本发明制备得到的透明质酸分子量为4X14?9X104，透明质酸保湿性好，应用在化妆品中可以提高化妆品的保湿性，使用后20?24h后的保湿率仍可高达91?94%。
[0008]本发明的有益效果是:
(1)本发明利用微生物发酵法从鱿鱼眼制得透明质酸，制备方法简单，成本低廉；
(2)本发明制备得的透明质酸产品提取率为45?60%、纯度为95.9?99.9%、生物活性高，在化妆品中具有广泛的应用。
【具体实施方式】
[0009]首先将冷冻保存的兽疫链球菌ATCC39920接种到液体培养基中，在35?37°C温度下培养20?24h，培养后得活化的兽疫链球菌菌液，备用;所述的液体培养基为15?20g蛋白胨、12?16g葡萄糖、0.5?0.8g磷酸氢二钠、3?4g氯化钠，加水定容到I?2L，并调节pH值为7.0，调节后在120?125°(:下高温灭菌处理10?201^11;称取200?2508鱿鱼眼放入丙酮中浸泡I?2h后取出，在通风处放置5?7h后放入绞碎机中绞碎，将绞碎后的鱿鱼眼按质量比1:1和水混合，并研磨成糊状物，再将糊状物按质量比I: 10与质量分数I?3%氯化钠溶液混合，放入锅中，在70?80°C下蒸煮15?20min，蒸煮后冷却至37?40°C，用质量分数10%氢氧化钠溶液调节pH值为7.5?8.0;向上述调节后pH的混合液中加入总质量I?2%酵母粉和混合液体积3?5%备用的兽疫链球菌菌液，保持在37?40 °C温度下发酵培养18?20h，发酵培养后用纱布过滤，得发酵液;将上述发酵液用质量分数15%盐酸调节pH值为5.5?6.0，调节后加入总体积2?4倍质量分数90%乙醇溶液，机械搅拌20?30min后离心分离，得沉淀物，并用无水乙醇清洗2?3次，放入真空干燥箱中在50?60 °C下干燥3?5h;将上述干燥后的固体按固液比1:10与质量分数5%氯化钠溶液混合，搅拌至固体溶解，溶解后用质量分数15%盐酸调节pH值为7.0，并向其中加入7000?8000U/g胰蛋白酶，在180?250rf超声处理15?20min，处理后在50?55°C下酶解2?3h后在100°C下灭菌5?lOmin，离心分离得上清液;将上述上清液放入浓缩罐中减压浓缩至原体积15?20%，向浓缩液中加入浓缩液体积2?3%浓度60?80g/L十六烷基三甲基溴化铵溶液，络合反应30?40min后离心分离得络合物，将络合物溶于质量分数15%氯化钠溶液中解离2?3h，得解离液，并调节pH值为3.0?4.0，调节后用截留分子量4X 14?9X 14的超滤膜过滤，得透明质酸钠水溶液，通过阳离子交换树脂，得透明质酸水溶液，蒸发浓缩后真空干燥得透明质酸粉末。
[0010]实例I
首先将冷冻保存的兽疫链球菌ATCC39920接种到液体培养基中，在35°C温度下培养20h，培养后得活化的兽疫链球菌菌液，备用;所述的液体培养基为15g蛋白胨、12g葡萄糖、0.5g磷酸氢二钠、3g氯化钠，加水定容到IL，并调节pH值为7.0，调节后在120 °C下高温灭菌处理1min;称取200g鱿鱼眼放入丙酮中浸泡Ih后取出，在通风处放置5h后放入绞碎机中绞碎，将绞碎后的鱿鱼眼按质量比1:1和水混合，并研磨成糊状物，再将糊状物按质量比1:10与质量分数1%氯化钠溶液混合，放入锅中，在70°C下蒸煮15min，蒸煮后冷却至37°C，用质量分数10%氢氧化钠溶液调节pH值为7.5;向上述调节后pH的混合液中加入总质量1%酵母粉和混合液体积3%备用的兽疫链球菌菌液，保持在37°C温度下发酵培养18h，发酵培养后用纱布过滤，得发酵液;将上述发酵液用质量分数15%盐酸调节pH值为5.5，调节后加入总体积2倍质量分数90%乙醇溶液，机械搅拌20min后离心分离，得沉淀物，并用无水乙醇清洗2次，放入真空干燥箱中在50 °C下干燥3h;将上述干燥后的固体按固液比1:1O与质量分数5%氯化钠溶液混合，搅拌至固体溶解，溶解后用质量分数15%盐酸调节pH值为7.0，并向其中加入7000U/g胰蛋白酶，在180W下超声处理15min，处理后在50°C下酶解2h后在100°C下灭菌5min，离心分离得上清液;将上述上清液放入浓缩罐中减压浓缩至原体积15%，向浓缩液中加入浓缩液体积2%浓度60g/L十六烷基三甲基溴化铵溶液，络合反应30min后离心分离得络合物，将络合物溶于质量分数15%氯化钠溶液中解离2h，得解离液，并调节pH值为3.0，调节后用截留分子量4X 14的超滤膜过滤，得透明质酸钠水溶液，通过阳离子交换树脂，得透明质酸水溶液，蒸发浓缩后真空干燥得透明质酸粉末。
[0011]本发明制备得到的透明质酸产品提取率为45%、纯度为95.9%，透明质酸分子量为4X104，透明质酸保湿性好，应用在化妆品中可以提高化妆品的保湿性，使用后20h后的保湿率仍可高达91%。
[0012]
实例2
首先将冷冻保存的兽疫链球菌ATCC39920接种到液体培养基中，在36°C温度下培养22h，培养后得活化的兽疫链球菌菌液，备用;所述的液体培养基为17g蛋白胨、14g葡萄糖、0.6g磷酸氢二钠、3.5g氯化钠，加水定容到1.5L，并调节pH值为7.0，调节后在123°C下高温灭菌处理15min;称取200?250g鱿鱼眼放入丙酮中浸泡1.5h后取出，在通风处放置6h后放入绞碎机中绞碎，将绞碎后的鱿鱼眼按质量比1:1和水混合，并研磨成糊状物，再将糊状物按质量比1:10与质量分数2%氯化钠溶液混合，放入锅中，在75°C下蒸煮17min，蒸煮后冷却至39°C，用质量分数10%氢氧化钠溶液调节pH值为7.8;向上述调节后pH的混合液中加入总质量1.5%酵母粉和混合液体积4%备用的兽疫链球菌菌液，保持在38°C温度下发酵培养19h，发酵培养后用纱布过滤，得发酵液;将上述发酵液用质量分数15%盐酸调节pH值为5.7，调节后加入总体积3倍质量分数90%乙醇溶液，机械搅拌25min后离心分离，得沉淀物，并用无水乙醇清洗2次，放入真空干燥箱中在55°C下干燥4h;将上述干燥后的固体按固液比1:10与质量分数5%氯化钠溶液混合，搅拌至固体溶解，溶解后用质量分数15%盐酸调节pH值为7.0，并向其中加入7500U/g胰蛋白酶，在220W下超声处理17min，处理后在53°C下酶解2.5h后在100°C下灭菌8min，离心分离得上清液;将上述上清液放入浓缩罐中减压浓缩至原体积17%，向浓缩液中加入浓缩液体积2.5%浓度70g/L十六烷基三甲基溴化铵溶液，络合反应35min后离心分离得络合物，将络合物溶于质量分数15%氯化钠溶液中解离2.5h，得解离液，并调节pH值为3.5，调节后用截留分子量6X 14的超滤膜过滤，得透明质酸钠水溶液，通过阳离子交换树脂，得透明质酸水溶液，蒸发浓缩后真空干燥得透明质酸粉末。
[0013]本发明制备得到的透明质酸产品提取率为45%、纯度为95.9%，透明质酸分子量为4X104，透明质酸保湿性好，应用在化妆品中可以提高化妆品的保湿性，使用后22h后的保湿率仍可高达91%。
[0014]实例3
首先将冷冻保存的兽疫链球菌ATCC39920接种到液体培养基中，在37°C温度下培养24h，培养后得活化的兽疫链球菌菌液，备用;所述的液体培养基为20g蛋白胨、16g葡萄糖、
0.8g磷酸氢二钠、4g氯化钠，加水定容到2L，并调节pH值为7.0，调节后在125°C下高温灭菌处理20min;称取250g鱿鱼眼放入丙酮中浸泡2h后取出，在通风处放置7h后放入绞碎机中绞碎，将绞碎后的鱿鱼眼按质量比1:1和水混合，并研磨成糊状物，再将糊状物按质量比1:10与质量分数3%氯化钠溶液混合，放入锅中，在80°C下蒸煮20min，蒸煮后冷却至40°C，用质量分数10%氢氧化钠溶液调节pH值为8.0;向上述调节后pH的混合液中加入总质量2%酵母粉和混合液体积5%备用的兽疫链球菌菌液，保持在40°C温度下发酵培养20h，发酵培养后用纱布过滤，得发酵液;将上述发酵液用质量分数15%盐酸调节pH值为6.0，调节后加入总体积4倍质量分数90%乙醇溶液，机械搅拌30min后离心分离，得沉淀物，并用无水乙醇清洗3次，放入真空干燥箱中在60 °C下干燥5h;将上述干燥后的固体按固液比1:1O与质量分数5%氯化钠溶液混合，搅拌至固体溶解，溶解后用质量分数15%盐酸调节pH值为7.0，并向其中加入8000U/g胰蛋白酶，在250W下超声处理20min，处理后在55 °C下酶解3h后在100 °C下灭菌1min，离心分离得上清液;将上述上清液放入浓缩罐中减压浓缩至原体积20%，向浓缩液中加入浓缩液体积3%浓度80g/L十六烷基三甲基溴化铵溶液，络合反应40min后离心分离得络合物，将络合物溶于质量分数15%氯化钠溶液中解离3h，得解离液，并调节pH值为4.0，调节后用截留分子量9 X 14的超滤膜过滤，得透明质酸钠水溶液，通过阳离子交换树脂，得透明质酸水溶液，蒸发浓缩后真空干燥得透明质酸粉末。
[0015]本发明制备得到的透明质酸产品提取率为60%、纯度为99.9%，透明质酸分子量为9X 104，透明质酸保湿性好，应用在化妆品中可以提高化妆品的保湿性，使用后24h后的保湿率仍可高达94%。
【主权项】
1.一种发酵法提取鱿鱼眼中透明质酸的方法，其特征在于具体制备步骤为: 将冷冻保存的兽疫链球菌ATCC39920接种到液体培养基中，在35?37°C温度下培养20?24h，培养后得活化的兽疫链球菌菌液，备用;所述的液体培养基为15?20g蛋白胨、12?16g葡萄糖、0.5?0.8g磷酸氢二钠、3?4g氯化钠，加水定容到1?2L，并调节pH值为7.0，调节后在120?125°C下高温灭菌处理10?20min; 称取200?250g鱿鱼眼放入丙酮中浸泡1?2h后取出，在通风处放置5?7h后放入绞碎机中绞碎，将绞碎后的鱿鱼眼按质量比1: 1和水混合，并研磨成糊状物，再将糊状物按质量比1:1O与质量分数1?3%氯化钠溶液混合，放入锅中，在70?80°C下蒸煮15?20min，蒸煮后冷却至37?40°C，用质量分数10%氢氧化钠溶液调节pH值为7.5?8.0; 向上述调节后pH的混合液中加入总质量1?2%酵母粉和混合液体积3?5%步骤(1)备用的兽疫链球菌菌液，保持在37?40 0C温度下发酵培养18?20h，发酵培养后用纱布过滤，得发酵液； 将上述发酵液用质量分数15%盐酸调节pH值为5.5?6.0，调节后加入发酵液总体积2?4倍质量分数90%乙醇溶液，机械搅拌20?30min后离心分离，得沉淀物，并用无水乙醇清洗2?3次，放入真空干燥箱中在50?60°C下干燥3?5h ； 将上述干燥后的固体按固液比1:10与质量分数5%氯化钠溶液混合，搅拌至固体溶解，溶解后用质量分数15%盐酸调节pH值为7.0，并向其中加入7000?8000U/g胰蛋白酶，在180?250W下超声处理15?20min，处理后在50?55 °C下酶解2?3h后在100°C下灭菌5?10min，离心分离得上清液； 将上述上清液放入浓缩罐中减压浓缩至原体积15?20%，向浓缩液中加入浓缩液体积2?3%浓度60?80g//L十六烷基三甲基溴化铵溶液，络合反应30?40min后离心分离得络合物，将络合物溶于质量分数15%氯化钠溶液中解离2?3h，得解离液，并调节pH值为3.0?.4.0，调节后用截留分子量4X 14?9X 14的超滤膜过滤，得透明质酸钠水溶液，通过阳离子交换树脂，得透明质酸水溶液，蒸发浓缩后真空干燥得透明质酸粉末。
【文档编号】C08B37/08GK105907820SQ201610469792
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月26日
【发明人】吴迪, 王统军
【申请人】吴迪