单细胞水平检测mmp酶活性的方法
【专利摘要】本发明提供了一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，包括以下步骤：(a)采用微流控装置，使得细胞溶液和多肽溶液经由两个通道相汇聚后进一步形成微液滴，微液滴中封装有单细胞和多肽，微液滴在连续相的带动下流出，其中多肽溶液中含有可诱导增强酶分泌的分子，多肽的序列包括特异性酶切片段，且首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团；(b)收集微液滴，用荧光显微镜检测信号；(c)根据荧光信号，判断MMP酶活性。本发明的方法能够高效、灵敏、低成本且在单细胞水平上检测与肿瘤恶性程度、侵入性以及癌转移能力相关的酶活性，从而应用于肿瘤的诊断和治疗，因而具有良好的应用前景。
【专利说明】
单细胞水平检测MMP酶活性的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，该方法可进一步用于判断肿瘤细胞的扩散程度。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤细胞是指在人体新陈代谢过程中伴随着从原发肿瘤扩散进入人体某些循环系统中的肿瘤细胞，它们的出现标志着肿瘤细胞已经开始从病灶组织向四周扩散，从而导致更多器官组织产生病变。研究表明，约90%的癌症死亡案例与肿瘤细胞扩散有关。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞必须打破它们迀移过程中的生理障碍，而肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)能使细胞外基质(ECM)蛋白水解，这一特点在肿瘤扩散转移过程中起着至关重要的作用。MMPs是靠Zn离子等金属离子作为辅助因子的肽链内切酶家族中的一种，它们在组织重构，降解细胞外矩阵蛋白和基底膜及诱导血管生成等过程发挥作用。MMP，基质金属蛋白酶中的一种白明胶酶，分子量92kDa，它在肿瘤细胞中的高表达和活性将协助肿瘤细胞入侵转移。
[0003]因此检测MMP酶活性将给评估肿瘤细胞入侵提供重要帮助，传统的检测细胞入侵实验，譬如使用基质膜(matrigel)的方法，模仿细胞外基质，在细胞培养小室中，用基质膜将高营养液的培养基和低营养液的培养基隔开，于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液中，最后通过检测高营养液的细胞来探究细胞入侵能力。此夕卜，还有常用的酶联免疫吸附实验，一种抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记检测方法。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检测物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
[0004]上述传统方法至少具有如下缺陷:1、实验往往重现性差，过程冗长、繁琐。2、多数实验往往以群体细胞为实验对象，得到大量细胞表达的平均结果。然而这样的群体细胞检测结果往往会忽略个体细胞间表达的差异。因此急需开发一种高效、灵敏、低成本，且能够在单细胞层次上敏感检测MMP酶活性的微流控方法
【发明内容】
[0005]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，该方法简便，可重复性好，成本低，可在单细胞水平高灵敏测量与肿瘤恶性程度、侵入性以及癌转移能力相关的MMP酶的活性，进而实现肿瘤的早期诊断和治疗。
[0006]本发明采用了以下技术方案:
[0007]—种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，包括以下步骤:
[0008](a)采用微流控装置，使得细胞溶液和多肽溶液经由两个通道相汇聚后进一步形成微液滴，微液滴中封装有单细胞和多肽，且微液滴在连续相的带动下流出，其中多肽溶液中含有可诱导增强酶分泌的分子，该分子用于刺激肿瘤细胞产生MMP酶，多肽的序列包括特异性酶切片段且其序列的首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团；
[0009](b)收集微液滴，用荧光分析法检测微液滴，得到荧光信号；
[0010](C)根据荧光信号，判断MMP酶活性。
[0011]进一步地，微流控装置包括具有两个支通道和主通道的Y型套管和与Y型套管的主通道相流体连通的毛细管，毛细管的远离Y型套管的端部呈锥形，细胞溶液和多肽溶液经由Y型套管的两个支通道相汇聚，经过主通道进入毛细管中并在毛细管的锥形端部形成微液滴。
[0012]微液滴的尺寸为150_250μπι，微液滴尺寸可以用进样液体流速调节。
[0013]在一具体实施例中，微流控装置包括分别具有相流体连通的竖直通道和水平通道的第一 T型三通和第二 T型三通，且第一 T型三通和第二 T型三通的水平通道通过连接毛细管相流体连通。第一 T型三通的水平通道内设有第一毛细管，第二 T型三通的水平通道内设有第二毛细管，第一毛细管和第二毛细管的外径均小于水平通道的内径，且在第一、第二 T形三通的水平通道的两端部处，第一、第二毛细管的外表面与水平通道内表面之间的空隙被密封，第一毛细管和第二毛细管相对的端部间隔一定距离且均呈锥形，第一毛细管的远离第二毛细管的端部与Y型套管的主通道相连接且流体连通。
[0014]优选地，第一毛细管的锥形端部的开口小于第二毛细管的锥形端部的开口。细胞溶液与多肽溶液从Y型套管的两个支通道汇聚后，经由主通道进入第一毛细管，并在第一毛细管的锥形端部利用表面活性剂的作用和流动剪切力形成微液滴。
[0015]具体地，第一T型三通和第二 T型三通的竖直通道中分别输入连续相，连续相在水平通道与第一、第二毛细管之间的间隙内分别向第一毛细管与第二毛细管之间的微小间隔处流动，并伴随着第一毛细管的锥形端部处微液滴的产生，带动微液滴从第二毛细管流出。
[0016]在本发明的微流控装置中，T型三通和毛细管可以通过商业途径购买，也可以为自制。比如，毛细管可以为自备的烧灼的玻璃毛细管。
[0017]在一具体实施例中，分散相(细胞溶液和多肽溶液)分别通过注射栗输入Y型套管中。
[0018]在一具体实施例中，连续相(矿物油溶液)通过注射栗输入T型三通的竖直通道中，并在第一毛细管和第二毛细管之间的空隙处相汇合，用于带动微液滴流出。
[0019]进一步地，在步骤(a)中，可诱导增强酶分泌的分子选自12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)、血管紧张素、白介素1、白介素2、白介素4、干扰素INF、肿瘤坏死因子-α中的一种或几种。
[0020]进一步地，在步骤(a)中，特异性酶切片段为-Gly-Met-序列片段。
[0021]进一步地，在步骤(a)中，细胞溶液由细胞溶于聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)母液制成。PEGDA母液有利于细胞悬浮。
[0022]优选地，聚乙二醇二丙烯酸酯母液为含有硫酸铵、D-山梨醇和聚乙二醇二丙烯酸酯单体的磷酸盐(PBS)缓冲液。
[0023]优选地，在步骤(a)中，细胞溶液中细胞的浓度为6X 104_6 X 16个/mL。
[0024]在一优选实施例中，细胞浓度为6 X 14个/mL、6 X 15个/mL、6 X 16个/mL。
[0025]在步骤(a)中，还包括对不同细胞浓度的细胞溶液进行试验，以在微液滴中实现单细胞和多肽进行封装的步骤，使得在选定的细胞浓度下，利用本发明的微流控装置能够生成封装单细胞和多肽的微液滴。
[0026]优选地，在步骤(a)中，连续相为矿物油溶液，矿物油溶液中含有表面活性剂。即，细胞溶液和多肽溶液作为分散相，矿物油作为连续相。
[0027]更优选地，矿物油溶液中的表面活性剂为ABIL EM90，其中ABILEM90的质量分数优选为2%。
[0028]进一步地，微液滴收集在载玻片或玻璃器皿中。
[0029]进一步地，在步骤(b)中，使用荧光显微镜检测微液滴，荧光显微镜检测的激发波长为488nm，发射波长为525nm。
[0030]在Omin时，液滴具有微弱荧光，随着时间递增(比如，10min，20min后)，液滴的荧光强度逐渐增强。根据荧光强度，可以判断出MMP酶的活性，从而可进一步判断肿瘤细胞的转移程度，以用于诊断肿瘤相关疾病或判断疾病的治疗效果。
[0031]在一更具体的实施例中，选用的细胞溶液中细胞浓度为6X15个/mL，多肽溶液中含有质量体积分数为lOOng/mL的刺激物PMA，多肽为首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团的9个氨基酸序列的多肽。
[0032]优选地，在步骤(a)中，所述荧光基团为FITC、TET、HEX或VIC，淬灭基团为DABCYL、BHQ或TAMRA。
[0033]进一步地，在步骤(a)中，多肽的序列为FlTC-Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-Lys-Cys-DABCYL。
[0034]在一具体实施例中，在步骤(a)中，多肽溶液由PEGDA母液与多肽、刺激物12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)混合而成，其中多肽的浓度为160μΜ，刺激物PMA的浓度为10ng/mL。
[0035]在本发明中，利用T型三通和毛细管制成微流控装置实现了低成本、高通量地产生微液滴，细胞和多肽封装在微液滴中，在微液滴中肿瘤细胞被可诱导增强酶分泌的分子刺激后分泌MMP，MMP在多肽序列中的Gly与Met之间发生剪切水解反应，荧光基团与淬灭基团相分离，荧光基团发出荧光，液滴变成绿色，通过荧光显微镜检测信号，从而可以判断出MMP酶活性。
[0036]借由上述方案，与现有技术相比，本发明至少具有以下优点:本发明提供了一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其能够高效、灵敏、低成本且在单细胞水平上检测MMP酶活性。在本发明中，通过“T”型三通装置和毛细管搭建微流控装置，不仅能达到微流控芯片产生高通量微液滴的效果，而且成本低，搭建简单，快速，可重复使用。利用本发明的微流控装置，实现微液滴水凝胶体系在可控条件下进行组装，并且实现对细胞或细菌在单个细胞水平的有效隔离和封闭，生成的微液滴水凝胶大小均匀，稳定。在此装置的基础上，选定合适的细胞浓度，实现微液滴包裹肿瘤细胞或肿瘤干细胞，并在单细胞水平高灵敏测量与肿瘤恶性程度、侵入性、以及癌转移能力相关的酶活性。本发明得到的微液滴具有稳定、高通量，比芯片生成成本低廉的特点，从而提供了一种单细胞水平检测肿瘤细胞MMP酶活性的反应器。本发明的方法简单，成本低，重复性好且准确，为肿瘤的诊断和治疗提供了一种有效的方法，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0037]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
[0038]图1为本发明的微流控装置的结构示意图；
[0039]图2位本发明的微流控装置的局部放大图；
[0040]图3为根据本发明的肿瘤细胞入侵示意图；
[0041 ]图4为根据本发明封装的三种微液滴的示意图；
[0042]图5为根据本发明的U937细胞的封装示意图；
[0043]图6为根据本发明的U937细胞的不同浓度的封装示意图；
[0044]图7为根据本发明的两种肿瘤细胞和正常细胞的封装对比图。
[0045]图中:1、第一T型三通；11、第一毛细管；12、第一注射栗；2、第二T型三通;21、第二毛细管;22、第二注射栗;3、连接毛细管;4、Y型套管;41、第三注射栗;42、第四注射栗。
【具体实施方式】
[0046]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例仅用于说明本发明的目的，而非限制本发明的范围。
[0047]实施例1
[0048]1、培养肿瘤细胞U937。
[0049]U937细胞悬浮生长在含10%的胎牛血清的RPM1-1640培养基中，将它们置于5%CO2、37 0C的细胞培养箱中培养，备用。
[0050]2、配制PEOM母液、矿物油溶液(连续相)、细胞溶液(分散相A)和多肽溶液(分散相B)。
[0051 ] 称取9.5mg硫酸铵(引发剂)、30mg D-山梨醇(交联剂)和1.24g PE⑶A(单体)，将它们溶解在3.8mL PBS溶液中，制得PEGDA母液。
[0052]当细胞生长良好时，取出细胞用细胞计数器进行计数，然后将细胞离心后用PBS洗一次后重新悬浮在无血清、无酚红的1640培养基中。取一定体积的PE⑶A母液与计数的细胞溶液混合使细胞的终浓度为6 X 15个/mL，配制为分散相A。
[0053]取一定体积的PE⑶A母液与多肽、刺激物PMA混合，使二者的终浓度分别为160μΜ和I OOng/ mL，配置成分散相B。
[0054]连续相为混合有表面活性剂ABIL EM 90的矿物油，ABIL EM 90可以经由商业途径购得，矿物油中ABIL EM 90的质量分数为2%。
[0055]3、搭建微流控装置并制备微液滴。
[0056]本实施例的微流控装置是由两个商业途径购买的T型连通器和玻璃毛细管构成，玻璃毛细管为自制，微流控装置如图1-2所示。连接毛细管(内径1.5mm，长8cm)用来连接第一T型三通I和第二T型三通2。用来注入分散相(细胞溶液、多肽溶液)的第一毛细管11 (内径0.9mm，外径1.1mm)位于第一 T型三通I的水平通道内，且出口尾端用酒精灯烧灼形成内径600μπι的锥形尖端。玻璃毛细管分别从T型连通器左、右两端插入，在一些小的特氟龙套管和小螺母配件的作用下使两端密封，并且使插入的第一、第二毛细管尖端正对齐。
[0057]具体地，本实施例的微流控装置包括分别具有相流体连通的竖直通道和水平通道的第一 T型三通I和第二 T型三通2，且第一 T型三通I和第二 T型三通2的水平通道通过连接毛细管3相连接并流体连通，第一T型三通I的水平通道内设有第一毛细管11，第二T型三通2的水平通道内设有第二毛细管21，第一毛细管11和第二毛细管21的外径均小于水平通道的内径。第一毛细管11和第二毛细管21相对的端部间隔一定距离且均呈锥形。第一毛细管11的远离第二毛细管21的端部与Y型套管4的主通道相连接且流体连通。
[0058]分散相包括细胞溶液(分散相A)和多肽溶液(分散相B)两个组分，玻璃毛细管的入口连接着一个Y型套管4，分散相A和分散相B通过两个支通道在注射栗的作用下同时注入Y型套管4，到达Y型套管交联处汇聚并混合流入玻璃毛细管，而连续相直接从第一、第二 T型连通器的上端(竖直通道)输入，并从水平通道与第一、第二毛细管之间的空隙处流动到第一、第二毛细管的锥形端部相间隔处，以用于带动微液滴流出。细胞溶液和多肽溶液在Y型套管的交联处混合，并从Y型套管的主通道流入第一毛细管，在第一毛细管的锥形端部(出口处)利用表面活性剂的作用和流动剪切力，形成封装有单细胞和多肽的微液滴，微液滴在连续相的带动下流出，完成细胞的封装。在本实施例中，连续相矿物油的流速为50yL/min，细胞溶液和多肽溶液的流速为50yL/min，且矿物油和细胞溶液、多肽溶液分别通过注射栗输入。更具体地，第一 T型三通I中的矿物油通过第一注射栗12输入其竖直通道，第二 T型三通2中的矿物油通过第二注射栗22输入其竖直通道。细胞溶液通过第三注射栗41输入Y型套管4的一个支通道，多肽溶液通过第四注射栗42输入Y型套管4的另一通道，细胞溶液和多肽溶液分别流入Y型套管4的主通道中再进一步混合。利用该装置可生成油包水、水包油、油包水凝胶三种不同的微液滴，图4为封装的三种不同微液滴的示意图，其中a为水包油，b为油包水，c为油包水凝胶。图5显示封装的U937细胞的示意图，图6显示封装的不同浓度U937细胞的曲线示意图。
[0059]4、收集微液滴，在焚光显微镜下检测信号。
[0060]利用载玻片或玻璃器皿收集微液滴。
[0061 ] 在本实施例中，封装了两种不同的肿瘤细胞(U937和MCF7)和正常细胞(NIH 3T3)的微液滴，图7中显示了三种细胞的微液滴在荧光显微镜下的检测情况，其中选用的细胞浓度为6 X 15个/mL。肿瘤细胞高表达的MMP在微液滴反应器中通过与多肽序列特定位置发生剪切水解反应，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团发出荧光，液滴变成绿色，而正常细胞下MMP没有分泌，无法检测到相应的信号。其中，Omin时液滴具有微弱荧光，随着时间递增(10min，20min后)液滴的荧光强度逐渐增强，并达到饱和状态。另外，不同肿瘤细胞入侵性与MMP酶表达的差异在检测中也可以看到相关差异，图3显示了肿瘤细胞入侵示意图。
[0062]在本发明中，微液滴水凝胶体系在微流控技术下生成微液滴，这样，微液滴的微反应器实现对细胞或细菌在单个细胞水平的有效隔离和封闭。微液滴包裹肿瘤细胞或肿瘤干细胞，并在单细胞水平高灵敏测量与肿瘤恶性程度、侵入性、以及癌转移能力相关的酶活性。本发明的方法可用于肿瘤早期的诊断和治疗进程的监控，具有良好的应用前景。
[0063]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤: (a)采用微流控装置，使得细胞溶液和多肽溶液经由两个通道相汇聚后进一步形成微液滴，所述微液滴中封装有单细胞和多肽，所述微液滴在连续相的带动下流出，其中所述多肽溶液中含有可诱导增强酶分泌的分子，所述多肽的序列包括特异性酶切片段且其序列首、尾分别连接有荧光基团和淬灭基团； (b)收集微液滴，用荧光分析法检测微液滴，得到荧光信号； (c)根据荧光信号，判断MMP酶活性。2.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(a)中，所述微流控装置包括具有两个支通道和主通道的Y型套管和与所述Y型套管的主通道相流体连通的毛细管，所述毛细管的远离所述Y型套管的端部呈锥形，所述细胞溶液和所述多肽溶液经由所述Y型套管的两个支通道相汇聚，经过主通道进入毛细管中并在毛细管的锥形端部形成微液滴。3.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(a)中，可诱导增强酶分泌的分子选自12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、血管紧张素、白介素1、白介素2、白介素4、干扰素INF、肿瘤坏死因子-α中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(a)中，所述细胞溶液由细胞溶于聚乙二醇二丙烯酸酯母液制成，所述聚乙二醇二丙烯酸酯母液为含有硫酸铵、D-山梨醇和聚乙二醇二丙烯酸酯单体的磷酸盐缓冲液。5.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(a)中，所述细胞溶液中细胞的浓度为6 X 104-6 X 16个/mL。6.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(a)中，所述连续相为矿物油溶液，所述矿物油溶液中含有表面活性剂。7.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(b)中，所述微液滴收集在载玻片或玻璃器皿中。8.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(b)中，使用荧光显微镜检测微液滴，荧光显微镜检测的激发波长为488nm，发射波长为525nm。9.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(a)中，所述荧光基团为FITC、TET、HEX或VIC，淬灭基团为DABCYL、BHQ或TAMRA。10.根据权利要求1所述的单细胞水平检测MMP酶活性的方法，其特征在于:在步骤(a)中，所述多肽的序列为FlTC-Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-Lys-Cys-DABCYLο
【文档编号】C12Q1/37GK105907840SQ201610186024
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】刘坚, 余钊
【申请人】苏州大学