rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用图
【专利摘要】本发明公开了rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途。本发明发明人首次发现A20基因SNP rs77191406与RA和SLE并发恶性肿瘤相关，rs77191406可作为RA和SLE继发恶性肿瘤的预测指标。因此，提供了rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途以及提供了一种预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒。本发明的rs77191406对预测RA和SLE继发恶性肿瘤有重要的意义，有很大的临床应用价值和很好的应用前景。
【专利说明】
rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒 中的用途
技术领域
[00011 本发明涉及一种SNP的用途，特别涉及rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶 性肿瘤的试剂盒中的用途。
【背景技术】
[0002] 类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA)和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE)是两种最典型的系统性自身免疫性疾病。RA以累及周围对称性 多关节为主要表现，以滑膜炎症和关节进行性破坏为主要特征，导致关节畸形和功能受限。 SLE是一种多发于青年女性的累及多脏器的慢性系统性自身免疫病，B细胞和T细胞异常活 化在RA和SLE发病过程中占有重要地位。临床研究证明，与普通人群相比，RA或SLE患者继发 恶性肿瘤的风险增加。目前尚没有有效预测RA和SLE继发恶性肿瘤的标志物。
【发明内容】
[0003] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供rs77191406位点在制备 预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途。
[0004] 本发明的另一目的在于提供一种预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现:rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发 恶性肿瘤的试剂盒中的用途。
[0006] 所述的rs77191406为CT基因型时，表明RA和SLE患者患恶性肿瘤的可能性较大。 [0007]所述的试剂盒包括检测rs77191406位点基因型的试剂。
[0008]所述的试剂包括用于扩增所述rs77191406位点的引物。
[0009]所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物优选为扩增出来的序列能用于限制 性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)的引物。
[0010]所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物包括F1和R1:
[0011] FI:5 '-CAACGGCTACTGCAACGAAT-3 '；
[0012] R1:5 '-GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3 '。
[0013] 所述的试剂盒还包括限制性内切酶。
[0014]所述的限制性内切酶优选为BstuI。
[0015] 一种预测RA和SLE继发恶性肿瘤试剂盒，包括检测rs77191406位点基因型的试剂。 [0016]所述的试剂包括用于扩增所述rs77191406位点的引物。
[0017]所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物优选为扩增出来的序列能用于RFLP 的引物。
[0018] 所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物包括F1和R1:
[0019] FI:5 '-CAACGGCTACTGCAACGAAT-3 '；
[0020] R1:5，-GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3，。
[0021 ]所述的试剂盒还包括限制性内切酶。
[0022]所述的限制性内切酶优选为BstuI。
[0023] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0024] l、rs77191406(19261C>T)位于A20基因3'端非编码区（3'UTR)，在6号染色体 137881704位点发生C突变为T改变。本发明发明人首次发现A20基因 SNP rs77191406与RA和 SLE并发恶性肿瘤相关，rs77191406可作为RA和SLE继发恶性肿瘤的预测指标。如图1和表3 所示。
[0025] 2、本发明的rs77191406对预测RA和SLE继发恶性肿瘤有重要的意义，有很大的临 床应用价值和很好的应用前景。
【附图说明】
[0026]图1是A20基因 rs77191406核苷酸序列分析结果图。
[0027]图2是用PCR-BstuI-RFLP琼脂糖凝胶法分析rs77191406的结果图；其中，泳道Μ为 100bp DNA Marker、泳道1~4为纯合子(CC)基因型；泳道5~7为杂合子(CT)基因型；泳道8 为PCR产物。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0029] 实施例1
[0030] (1)利用PCR-RFLP检测A20基因 SNP rs77191406位点多态性。
[0031] (2)收集99例RA和37例SLE患者以及99例健康人外周血样本(表1)，将患者分为RA、 SLE患者伴发肿瘤组和RA、SLE患者无肿瘤组，提取单个核细胞，提取DNA。
[0032] (3)在NCBI上确定rs77191406位点的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件分 析内切酶识别情况，确定限制性内切酶(BstuI)可以特异性识别该位点。PCR-RFLP的引物设 计也采用Primer Premier 5.0软件对包含SNP位点在内的DNA片段设计引物(上游引物:5'_ CAACGGCTACTGCAACGAAT-3 ' ；下游引物:5 ' -GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3 '），保证扩增产物被 酶切后的片段长度尽量相差l〇〇bp以上，以便琼脂糖凝胶电泳能进行分辨。
[0033] (4)酶切反应体系为30yL，PCR产物14yL、10倍缓冲液3yL、BstuI限制性内切酶lyL 以及超纯水12yL，将混合物充分混匀后置于37 °C lh。
[0034] (5)酶切产物用3% (w/v)琼脂糖凝胶进行电泳，25min后于凝胶成像仪观察成像。 根据成像结果，判断rs77191406位点基因型，同时RCR产物随机送核苷酸序列分析鉴定，证 实酶切分析结果与序列分析结果完全一致(图1和图2)，图2的酶切结果表明，泳道1~4为纯 合子(CC)基因型为460bp和500bp两种产物，泳道5~7为杂合子(CT)基因型为460bp、500bp、 960bp 3种产物。将RA、SLE患者和健康对照组rs77191406的基因型和等位基因频率进行比 较，结果如表2所不。
[0035] (6)rs77191406位点多态性与RA/SLE患者临床疾病特点之间的关联性分析:收集 rs77191406(CT基因型）的RA和SLE患者的临床资料，分析rs77191406(CT基因型）与RA/SLE 继发恶性肿瘤的相关性。在99例RA患者中有1例检测到rs77191406(CT基因型），37例SLE患 者中有2例检测到rs77191406(CT基因型）。结合临床分析发现，携带rs77191406(CT基因型） 的1例RA患者关节肿痛数、炎症指标明显升高，疾病反复发作，改变病情抗风湿药(DMARDs) 治疗反应差。该患者在RA诊断10年后被诊断出结肠癌，1年后发生全身多发转移。而2例携带 rs77191406(CT基因型）的SLE患者中，1例患者病情反复发作，环磷酰胺、羟氯喹疗效差，5年 后被确诊为膀胱癌，9个月后发生肝转移，肝转移3月后死亡；另1例是严重的神经精神狼疮 (NP-SLE)患者，男性，19岁，伴有脊髓萎缩、狼疮性肾炎、严重的全血细胞减少，目前高位截 瘫。3例rs77191406(CT基因型）患者的具体临床信息见表3。为进一步明确rs77191406(CT基 因型)是否与原发肿瘤相关，我们检测了 6例不伴有自身免疫性疾病的结肠癌样本，6例结肠 癌患者均为rs77191406(CC基因型）。进一步证实rs77191406(CT基因型）与RA/SLE继发恶性 肿瘤具有相关性。
[0036] 表1 RA and SLE患者和健康对照组临床资料 [0037]
[0038] 表2 RA、SLE患者和健康对照组rs77191406的基因型和等位基因频率比较 [0039]
[0040] 表3检出rs77191406(CT基因型）的RA和SLE患者的临床资料
[0041]
[0042] 上述实验结果说明了本发明提供的A20基因 SNP rs77191406与RA和SLE伴发恶性 肿瘤相关。
[0043]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述的试剂盒包括检测rs77191406位点基 因型的试剂。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于:所述的试剂包括用于扩增所述rs77191406 位点的引物，或是包括用于扩增所述rs77191406位点的引物和限制性内切酶。4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于:所述的用于扩增所述rs77191406位点的引 物为扩增出来的序列能用于RFLP的引物。5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于:所述的用于扩增所述rs77191406位点的引 物包括Fl和Rl: Fl:5 '-CAACGGCTACTGCAACGAAT-3 '； Rl:5，-GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3，。6. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于:所述的限制性内切酶为BstuI。7. -种预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒，其特征在于:包括检测rs77191406位点基 因型的试剂。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂包括用于扩增所述 rs77191406位点的引物，或是包括用于扩增所述rs77191406位点的引物和限制性内切酶。9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于:所述的用于扩增所述rs77191406位点的 弓丨物为扩增出来的序列能用于RFLP的引物。10. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于:所述的用于扩增所述rs77191406位点 的引物包括Fl和Rl: Fl:5 '-CAACGGCTACTGCAACGAAT-3 '； Rl:5，-GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3，； 所述的限制性内切酶为BstuI。
【文档编号】C12Q1/68GK105907851SQ201610269771
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】朱丽花, 李扬秋, 周玲玲, 王亮, 陈少华, 杨力建, 李萡, 吴秀丽
【申请人】暨南大学