检测绿僵菌在植物根中内生性的特异性引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物保护领域，具体涉及检测绿僵菌在植物根中内生性的特异性引物。所述特异性引物的序列为：引物F1：5'?GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC；R1：5'?GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT。检测的灵敏度达到1:2500。
【专利说明】
检测绿僵菌在植物根中内生性的特异性引物
技术领域
[0001] 本发明涉及植物保护领域，具体涉及检测绿僵菌在植物根中内生性的特异性引 物。
【背景技术】
[0002] 昆虫病原真菌能够侵染寄生昆虫，使昆虫罹病死亡，其杀虫功能已被用于农、林、 草等植物害虫的防控治理中。近年研究发现，昆虫病原真菌除了能够侵染害虫减少植物虫 害以外，还能够进入植物宿存，促进植物的发育生长。至今证明至少有8属种杀虫真菌可在 植物体内定植，包括绿僵菌（Metarhizium anisopliae，M.robertsii)、白僵菌 (Beauveriabassiana)、拟青霉（Paecilomyces sp ·)、錯蚁轮枝抱 (Lecanicilliumlecanii)、虫草棒束抱（Isariafarinosa)、支顶抱(Acremoniumsp ·)、枝抱 菌（Cladosporiumsp ·)、食线虫真菌（Plectosphaerellacucumerina)，还有抑制植物土传病 害的粉红粘帚霉(Clonostachysrosea)等。研究发现内生的杀虫真菌与植物形成一定的互 惠共生关系，例如绿僵菌提高番茄的株高、根长和生物量，（Garcia et al.2011)，促进柳枝 稷和扁豆根生长发育（Sasan&Bidochka2012)，提高大豆的抗盐特性Khan et al. (2012);白 僵菌在小麦植株中定植，促进了小麦植株的生长(Sanchez et al. 2012)。这些控制植物虫 害或病害的生防真菌自身种群的大量繁殖并不在植物内，而是在相应的寄主虫体中。它们 在植物中宿存的生物学意义深受关注，已成为近年研究热点。
[0003] 不像植物病害菌侵入植物后会大量繁殖，杀虫真菌在植物中通常只有少量存在， 发现和检测植物内生的杀虫真菌需要一定的技术方法。目前检测植物内生菌主要采用选择 分离培养法，即用选择性培养基分离到植物内生菌群，在单菌落培养，通过鉴别菌落形态和 产孢结构的显微形态来鉴定类别（Wyrebeket et al.，2011;Garciaet al.，2011;Dober& Tribe，1980)。这种方法需要有选择性好的培养基，适用于可在培养基上正常生长的、在植 物中存活数量较大的类群，其检测的灵敏度较低，像杀虫真菌这些存活量较少的种类极易 在分离中被遗漏掉。为了确证杀虫真菌的内生性，研究者将供试杀虫菌株加上易于检测的 人工标记，如同位素或荧光蛋白等，然后通过人工接种植物共培养后，检测植物中是否存在 杀虫真菌的人工标记。应用同位素标记证明了绿僵菌的植物内生性，并且发现它通过侵染 地下害虫转而进入植株体内，将虫体有机氮源传递到植株根内，是氮营养素在昆虫与植株 之间的桥梁(Behieet al. 2012)。通过基因工程技术将绿色荧光蛋白基因 gfp转入杀虫真菌 绿僵菌中表达GFP蛋白，然后用带gfp标记的菌株接种柳枝稷和扁豆，共培养后在荧光显微 镜下观察到两种植物根中内生定植的绿僵菌菌丝，证明绿僵菌是一种内生菌并能促进植物 生的生长(Sasan&Bidochka2012)。然而，同位素或焚光蛋白标记方法需要特殊的检测仪器 和环境，检测过程也较为繁琐。先标记后检测的方法，显然不适用于对自然状况下植株的检 测，因为预期的内生杀虫真菌并没有可见的人工标记。对于目标菌株的检测，预先人工加入 DNA分子标记，在进行改菌株的各类生物学研究时，再通过PCR检测可确定目标菌株的存在。
[0004] 因此，建立绿僵菌特异性标记及其在植物内生性的检测方法，对推动绿僵菌功能 多样性研究和建立植保生物防治综合评价有重要意义。
【发明内容】
[0005] 为了检测确定绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的植物内生性，本发明的目的是 提供检测绿僵菌在植物根中内生性的特异性引物。
[0006] 根据本发明的技术方案，分别提取了绿僵菌DNA和其他种类真菌DNA，包括白僵菌 (Beauveria bas si ana )、构巢曲霉（Aspergillus nidulans) lSi(Fusarium oxysporum)、青霉（Penicillium sp·)、毛霉（Mucor sp ·)、单顶抱(Monacrosporium sp.)及 几种未鉴定的土壤分离真菌，引物FI ( 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC)，R1 ( 5 ' -GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT)能够独特地从绿僵菌DNA中扩增出清晰的目的片段，而其它 种类真菌DNA均没有扩增片段，因而确定引物F1/R1可作为鉴别绿僵菌、区分其他种类真菌 的特异性PCR扩增引物，扩增得到绿僵菌的特异性片段，（序列如SEQ ID No.1所示）。
[0007] GGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTGAATTATACCTTTAATTGTTGCTTCGGCG GGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAAAATGAA TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGC GTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGCGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCT TAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACGGGAGCCCGGCGCGGTCC ACTGCCGTAAAACCCCCAACTTTTTATAGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACT
[0008] 引物F1/R1进行PCR检测的灵敏度，当绿僵菌在植物中内生宿存，通过PCR检测其 DNA是混合的，而且是小量绿僵菌DNA混合于大量植物DNA中。试验分别提取了绿僵菌DNA和 花生根DNA，将绿僵菌DNA与花生DNA按 1:500、1:1000、1:1500、1: 2000、1: 2500、1: 3000、1: 3500比例混合，以上述1中的引物F1/R1进行PCR扩增，扩增重复3次，结果显示在1:500-2500 比例下能够扩做到目的片段，即检测的灵敏度达到1:2500。
[0009] 根据本发明的【具体实施方式】，以引物F1/R1PCR检测绿僵菌的植物内生性。在花生 播种后的7d时，将绿僵菌孢子悬浮液浇淋在幼苗根茎周围，同时设浇淋清水为对照。分别在 花生生长15(1、30(1、45(1、60(1、75(1、90(1时取样。提取各个时间段的花生根样本0嫩，分别以上 述1中的引物F1/R1进行PCR扩增，重复样本3次，结果显示在60d、75d、90d的根样中检测到目 的片段，而之前的15d、30d、45d样本和对照样本均没有扩增出相应片段，从而证明了绿僵菌 在花生根的宿存内生，而且在60d后达到可监测的量级。
【附图说明】
[0010]图1用引物F1/R1进行PCR检测区分绿僵菌与其他真菌的电泳图谱，泳道顺序：1绿 僵菌防地下害虫菌株MBJQH2-2;2-12不同地理或寄主来源的绿僵菌菌株；13-15购买引进的 绿僵菌菌株；16空白对照；17-21的非绿僵菌其他种类真菌菌株;22-24:田间土壤分离后鉴 定的绿僵菌菌株;25-31田间土壤分离后鉴定的非绿僵菌其他种类真菌菌株;32空白对照;Μ marker；
[0011]图2用F1/R1引物PCR检测花生根中绿僵菌的内生性的电泳图谱，泳道顺序：1和2为 MBJQH2-2处理75d和90d根样；3和4位Ma9处理75d和90d根样；5位对照根样;Μ为marker;
[0012] 图3用F1/R1引物PCR检测玉米根中绿僵菌的内生性的电泳图谱，左图F1/R1PCR泳 道顺序：1为marker; 2为无模板清水对照;3为对照根样;4为MBJQH2-2处理根样;5为gpd-ben 标记的M2-2-44044菌株处理根样。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1用特异性引物F1/R1的PCR检测区分绿僵菌与其他真菌
[0014]实验菌株共30个，分别为不同地理、寄主来源的绿僵菌菌株12个、购买引进的绿僵 菌菌株3个、已知的其他种类真菌菌株5个、从花生试验地土壤分离纯化后鉴定为绿僵菌的 菌株3个和鉴定为其他种类真菌菌株7个(表1)。分别接种培养各菌株，收集菌丝体，按照 Fungi DNA Extraction Kit说明书操作提取DNA。以引物F1/R1进行PCR扩增，PCR条件为:反 应体系总体积50yL，含lOXEx Taq Buffer 5yL、5U/yL Ex Taq 0.25yL、2.5mmol/L dNTP Mixture 4yL、10ymol/L的FI和R1 各lyL、DNA模板lyL，超纯水37.75yL。反应程序为：94°C 3min-94°C15sec，59°C10sec，72°C10sec，45 个循环-72°C 延伸 lOmin。反应产物经1.5%琼 脂糖电泳，得到电泳图谱（图1)。结果显示，所有18个绿僵菌中均能够扩增到特异性片段，而 12个非绿僵菌的其他种类真菌菌株均没有该扩增片段。因此证明，本发明的F1/R1引物及 PCR条件具有区分绿僵菌与其他真菌的优良特异性。
[0015] 表1试验菌株名录
[0016]
[0017]
[0018] 实施例2用F1/R1引物PCR检测花生根中绿僵菌的内生性
[0019]设置2个绿僵菌菌株接种花生的实验。在PDA培养基上，分别接种绿僵菌菌株 MBJQH2-2和Ma9菌株，25°C培养15d，获得的分生孢子粉。配制孢子悬浮液，调整浓度为1 X 107孢子/ml。播种花生时，在种穴内浇淋100ml孢子液。以浇淋清水为不接种对照。按一致条 件下常规管理种植，于播种后第75d和90d收取花生根检测。方法步骤如下：
[0020] 1)清洗花生根，吸干表面水分，保存于-20°C备用。2) DNA提取。3) PCR检测。①合成 引物F1 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC和引物R1 5 ' -GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT;②配 制 PCR 反应体系；③运行程序 941€3111丨114941€2〇86(3,571€2〇86(3,72 1€2586(3,40个循环472 °C 1 Omin。④电泳分离鉴定:将PCR反应产物经1.5 %琼脂糖电泳，得到电泳图谱。
[0021] 结果见图2,可见接种了绿僵菌M2-2或Ma9菌株的花生根DNA可扩增出预期的绿僵 菌特征条带，而对照花生根没有扩增到相应的条带，证明了引物F1/R1-PCR是检测绿僵菌在 花生内生的有效方法。
[0022]实施例3用F1/R1引物PCR检测玉米根中绿僵菌的内生性
[0023] 设置gpd-ben标记的绿僵菌菌株M2-2-44044和原始菌株菌株MBJQH2-2接种玉米的 实验。在Η)Α培养基上，分别接种绿僵菌菌株M2-2-44044和MBJQH2-2，25°C培养15d，获得的 分生孢子粉。配制孢子悬浮液，调整浓度为IX 1〇7孢子/ml。在玉米播种后第4d，将100ml孢 子液浇淋到幼苗基部周围。以浇淋清水为不接种对照。按一致条件下常规管理种植，于施菌 后第28d收取玉米根检测。
[0024]方法步骤如下：1)清洗玉米根，吸干表面水分，保存于-20°C备用。2)DNA提取。3) pcr 检测，合成弓丨物 fus'-ggggtagtcagtattctggcgggckrus'-ggggttccacggcgagaccgccaat) ; 配制 PCR 反应体系 。运行 PCR 程序 ，将 PCR 反应产物经1. 2 % 琼 脂糖电泳，得到电泳图谱。
[0025] 结果见图3,可见接种了带gpd-ben标记的绿僵菌M2-2-44044菌株的玉米根DNA用 F1/R1和F2/R2引物均能扩增出预期的绿僵菌特征条带，而接种原始菌株MBJQH2-2的根样只 能用F1/R1引物，而对照根样用F1/R1引物均没有扩增到相应的条带，证明了 F1/R1引物能有 效检测绿僵菌物种在玉米种的内生性，而F2/R2引物能够针对特定gpd-ben标记的菌株检测 其植物内生性。
【主权项】
1. 检测绿僵菌在植物根中内生性的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的序列 为： 引物Fl: 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC; Rl：5'-GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT 〇2. 特异性检测绿僵菌在植物根中内生性的方法，其特征在于，所述方法包括使用以下 引物进行检测的步骤， 引物Fl: 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC; Rl：5'-GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT 〇
【文档编号】C12R1/645GK105907872SQ201610395664
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】农向群, 刘少芳, 王广君, 李兴佳, 曹广春, 张泽华
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所