一种鉴别白及及其混淆品的方法及pcr特异性鉴别引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种鉴别白及及其混淆品的方法及PCR特异性鉴别引物。本发明本利用特异性位点PCR的技术设计的特异性鉴别引物，其上游引物BJ?F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物BJ?R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为508bp。应用该引物及本发明确定的PCR扩增反应体系和反应条件，用1克样品，一周内即可鉴别出正品白及和伪品，具有操作简单、快速、准确、样品用量少的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势，非常有利于白及中药的快速鉴别。
【专利说明】
一种鉴别白及及其混淆品的方法及PCR特异性鉴别引物
技术领域
[0001 ]本发明涉及分子标记技术领域，特别是涉及一组特异性PCR鉴别引物及其白及和 混淆品的方法。
【背景技术】
[0002] 白及属(Bletilla Rchb.F)为兰科多年生草本植物，不仅观赏价值较高，亦是常用 中药之一，又称小白芨、莲及草、甘根、白根、紫兰(根)等。药名为白及，假鳞茎均供药用，具 有收敛止血、清热解毒、消肿生肌之功效。白及属全世界约有6种，分布于亚洲的緬甸北部经 中国至日本。中国产有华白及(Bletilla sinensis)、小白发(Bletilla formosana)、白及 (Bletilla striata)和黄花白发(Bletilla ochracea)4种。分布于北起江苏、河南，南至台 湾，东起浙江，西至西藏东南部察隅。长期以来，白及药材来源主要以野生采集为主。随着市 场对药材白及需求量的增加和野生资源的急剧减少，采集野生白及不但不能满足市场需 求，更破坏了生态环境和白及野生资源。近年白及的应用越来越广泛，云南市场上，出现了 将兰科（Or chidaceae)白及属（Bletilla)的小白及（Bletilla formo sana (Hay a ta) Schltr.);兰科（Orchidaceae)独蒜兰属（Pleione)的独蒜兰（Pleione bulbocodioides (Franch · )Rolfe)，半附生草本；兰科（Orchidaceae)筒瓣兰属(Anthogonium)的筒瓣兰 (Anthogonium gracile Lindl ·)，地生草本；兰科（Orchidaceae)兰属（Cymbidium)的冰球 子（Oreorchis patens (Lindl.)Lindl)，多年生草本；兰科（Orchidaceae)羊耳蒜属 (Liparis)的见血青（Liparis nervosa(Thunb.ex A.Murray)Lindl ·)，地生草本；越南白及 等伪品掺入白及中或直接用其他药材以假乱真，白及的真伪鉴别具有现实的市场指导意义 (彭翠仙等.Journal of Anhui Agri.Sci.2014,42(32):11279-11281)〇
[0003] 目前，运用DNA分子标记技术对白及属植物进行鉴定上，有学者运用过SCAR分子标 记方法对黄花白及(Ble til la ochracea)与白及(Bletilla striata)小白及(Bletilla formosana)和云南独蒜兰（又名独叶白发）（Pleione yunnnanensis(Rolfe)RoIfe)进行鉴 定区别（赵爽，黄春球，杨耀文，等.黄花白及的SCAR分子标记转化研究.中草药，2012，43 (10) :2036-2039)，也有学者采用SRAP标记技术，拟探索建立一个分析白及物种遗传多样性 的实验体系(蒋瑞彬，徐旭栋，蓝小明，等.野生白及SRAP-PCR反应体系的优化，中华中医药 学刊，2013,31(2):353-355)。此外，还有学者选用11扣嫩几3和7〇^构建町树成功鉴定了白 及粉末状药材及其混伪品。结果表明，nrDNA ITS和ycfl序列可以作为白及属及其混伪品鉴 定用的DNA条形码序列。市场上"巨茎白及"的nrDNA ITS序列和ycfl序列与安徽六安白及亲 缘关系最近，NJ树均与白及聚为一支;基于形态及分子数据可初步将安徽"巨茎白及"归为 白及属白及植物(吴劲松，张宇思，刘薇等.白及属药用植物DNA条形码的确立及其应用，药 学学报2014,49( 10): 1466-1474)。
[0004] 上述技术，显示了分子标记技术在白及药材正伪鉴别应用的可能性，申请号为： 201410733438.0,名称为"一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法"（【公开日】 2015年3月4日，公开号CN104388569A)的中国专利申请与本发明类似，但该专利技术所用鉴 别引物与本发明所用鉴别引物并不相同；本发明利用特异性位点PCR的技术，克服了传统鉴 别方法中依靠形态学手段进行物种鉴定本身的复杂性和低效性，而且传统生药鉴定要求具 备很高的专业技术知识，受鉴定主观因素影响容易产生错误的鉴定结果。将白及与冰球子、 见血青、独蒜兰、筒瓣兰、越南白及进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。本发明 提供的一组PCR鉴别引物及以之鉴别白及及其伪品的方法，只需在一个扩增体系内进行PCR 扩增反应，即能快速、准确鉴别白及及其伪品。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一组鉴别白及及其混淆品的PCR特异性鉴别引物。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供用上述特异性鉴别引物鉴别白及及其混淆品的方 法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] 1. 一组鉴别白及及其混淆品的PCR特异性鉴别引物由上游引物BJ-F和下游引物 BJ-R组成，所述上游引物BJ-F的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物BJ-R的碱基序列如 SEQ ID N0:2所示。用所述的一组鉴别白及及其混淆品的PCR特异性鉴别引物通过PCR扩增 检测到有扩增产物，即可进行鉴别。
[0009] 2. -种鉴别白及及其混淆品的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0010] (1)提取待鉴定样品的基因组DNA;
[0011] (2)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，用技术方案1所述的一组鉴别白及及其混 淆品的PCR特异性鉴别引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中，10 X PCR Taq buffer(Mg2+plus 20mM)2.5yL，10mM dNTP 0·5μL，10μΜ上游引物BJ-F 1μL，10μΜ下游引 物BJ-R lyL，2U/yL DNA Taq聚合酶0.5yL，10-100ng DNA模板lyL，灭菌蒸馏水 18.5yL;PCR 扩增程序为:94°C预变性4min，循环内94°C变性45s，58°C退火lmin，72°C复性lmin，32个循 环后72°C延伸7min;
[0012] (3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行电泳检测，在508bp处检测出条带的待鉴定样品 为白及，在508bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。
[0013] 与现有技术相比，本发明的创新点及有益效果是：
[0014]总体而言，基于SNP分子标记的位点特异性PCR技术与RFLP、PAPD、SSR等传统的DNA 标记差异较大。在开发检测技术上，过去一般是建立在凝胶电泳基础上对多个个体进行分 析的方法，步骤比较繁琐，速度相对较慢，价格又较贵。而特异性PCR技术在检测样品时无需 像检测RFLP、SSR标记那样测量片段的长度，只需要进行PCR扩增，然后检测扩增产物的有无 或扩增产物的量即可进行鉴别，具有快速、简便的特点。并且遗传稳定性高，相比重复微卫 星等多态性标记，基于SNP型位点特异性PCR技术是基于单核苷酸的突变，突变频率较低，遗 传稳定性相对较高。位点丰富且分布广泛，富有代表性。
[0015] 本发明本利用特异性位点PCR的技术设计的特异性鉴别引物，及本发明确定的PCR 扩增反应体系和反应条件，用1克样品，一周内即可鉴别出正品白及和伪品，具有操作简单、 快速、准确、样品用量少的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势，非常有利于 白及中药的快速鉴别。
[0016] 序列表中SEQ ID N0:1所示的是上游引物BJ-F的碱基序列。
[0017] 序列表中SEQ ID NO:2所示的是下游引物BJ-R的碱基序列。
[0018] 序列表中SEQ ID N0:3所示的是通用引物psbA-trnH的上游引物psbA-trnH-F的碱 基序列。
[0019] 序列表中SEQ ID繼:4所示的是通用引物口8&4-1：1'11!1的下游引物口8&4-1：1'11!1-1?的碱 基序列。
[0020] 本发明人进行了一系列实验，以优选本发明提供的一组鉴别白及及其混淆品的 PCR特异性鉴别引物以及鉴别白及及其混淆品的方法的特异性PCR扩增条件等，证明本发明 鉴别方法的有效性。具体引物设计是：
[0021] 选择通用引物psbA-trnH对正品白及和混淆品进行扩增，扩增后样品送至上海生 工生物公司测序。正品白及以及其伪品psbA-trnH片段测序所得结果使用BioEdit软件进行 序列分析，校对和对比，找出正品白及特有的变异位点，发现正品白及lllbp处为A，而其他 混淆品为T，冰球子为C，利用primer premier 5·0软件设计1对鉴别白及及其混淆品的PCR 特异性鉴别引物，所述鉴别白及及其混淆品的PCR特异性鉴别引物由上游引物BJ-F和下游 引物BJ-R组成，所述上游引物BJ-F的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示，所述下游引物BJ-R的碱 基序列如SEQ ID N0:2所示，目标产物片段长度为508bp。
[0022] 通用引物psbA-trnH由上游引物psbA-trnH-F和下游引物psbA-trnH-R组成，所述 上游引物psbA-trnH-F的碱基序列如SEQ ID N0:3所示，下游引物psbA-trnH-R的碱基序列 如SEQ ID N0:4所示。
【附图说明】
[0023] 图1为白及及其混淆品总DNA的电泳检测图谱。图1中：泳道1为白及，泳道2为冰球 子，泳道3为见血青，泳道4为独蒜兰，泳道5为筒瓣兰，泳道6为越南白及；Μ为标准对照 (Marker)〇
[0024] 图2为白及及其混淆品用通用引物psbA-trnH进行PCR扩增的电泳检测图谱。图2 中：1为白及，2为冰球子，3为见血青，4为独蒜兰，5为筒瓣兰，6为越南白及，7为阴性对照;Μ 为标准对照(Marker)。
[0025] 图3为白及及其混淆品用本发明鉴别引物进行PCR扩增的电泳检测图谱。图3中：1 为白及，2为冰球子，3为见血青，4为独蒜兰，5为筒瓣兰6为越南白及，7为阴性对照;Μ为标准 对照(Marker)。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例所用白及、冰球子、见血青、独蒜兰、筒瓣兰、越南白及材料为野外采集 和人工种植且均可通过商业渠道购买到。所用试剂均为分析纯，实施例中无特殊说明为常 规方法。实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。
[0027] 实施例1
[0028] 1)材料、试剂与仪器
[0029] a.材料
[0030]材料如下表1所示，白及、冰球子、见血青、独蒜兰、筒瓣兰、越南白及为待鉴定样 品，这些材料可采集也可从市场上购买。
[0031] 表1样品来源表
[0032]
[0033] b ·试剂琼脂糖(美国Promega公司）；DL2000(北京鼎国昌盛公司）；
[0034] 10XPCR Taq buffer(Mg2+plus 20mM)(北京鼎国昌盛公司）；10mM dNTP
[0035] (Takara bio宝生物工程(大连)有限公司）；核酸染料(北京鼎国昌盛公司）；引物 为上海生工生物科技有限公司合成;2U/yL DNA Taq聚合酶(北京鼎国昌盛公司）；10-100ng DNA模板(北京鼎国昌盛公司）。
[0036] c.仪器 PCR 仪（Bio-RAD TIOOThermal Cycler);凝胶成像系统（G-BOX F3 英国 Syngene);电泳仪(北京市六一仪器厂，型号DYY-6D)。
[0037] 2)基因组DNA提取:分别取表1所示的6个待鉴定样品各1 g，分别采用改良的CTAB法 提取各样品基因组DNA(李毅等.天麻总DNA提取及聚合酶链反应扩增鉴定.贵阳医学院学报 2005,30(04) :311 -314)，分别于-20°C保存。
[0038] 3)特异性PCR扩增：
[0039]以步骤2)提取的基因组DNA为模板，用本发明一组鉴别白及及其混淆品的PCR特异 性鉴别引物对其进行PCR扩增，所述一组鉴别白及及其混淆品的PCR特异性鉴别引物由上游 引物BJ-F和下游引物BJ-R组成，所述上游引物BJ-F的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引 物BJ-R的碱基序列如SEQ ID腸：2所示，？0財广增反应体系总体积为25以1^，其中，10\卩0? Taq buffer(Mg2+plus 20mM)2.5yL，10mM dNTP 0·5μL，10μΜ上游引物BJ-F 1μL，10μΜ下游 引物BJ-R lyL，2U/yL DNA Taq聚合酶0.5yL，20ng DNA模板lyL，灭菌蒸馏水 18.5yL;PCR扩 增程序为:94°C预变性4min，循环内94°C变性458,58°(：退火111^11，72°(：复性11^11，32个循环 后72°C延伸7min。
[0040] 4)扩增产物检测及结果:对步骤3)的PCR扩增产物进行电泳检测，取5yL PCR扩增 产物加入含核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶中，90V稳定电压电泳40min，紫外凝胶成像系统观 察。结果显示，在一个PCR反应中的PCR扩增产物，白及样品在508bp处产生条带，其余样品未 产生条带，详见图3。
[0041] 本发明提供的鉴别白及及其混淆品的PCR特异性鉴别引物及以之鉴别白及及其混 淆品的的方法，只需在一个扩增体系内进行PCR扩增反应，能在一周内快速、准确鉴定白及 及其伪品，其操作步骤简单，可推广应用。本发明鉴别样品用量小，每次不超过lg，节约成本 的同时，采集取样也方便，并能快速准确的将白及及其混淆品鉴别出来。
[0042] 本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响， 直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，打破了依赖植物开花期作 为白及及物种鉴定的局限，对白及的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要 的现实意义。本发明具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优 势，非常有利于白及中药的快速鉴别。
[0043] 图2是对实施例1表1所列的6种样品，除所用的引物为上述通用引物psbA-trnH外， 其余方法与实施例1相同的PCR扩增的电泳检测图谱。图2表明这6种样品都可在750bp处上 下产生条带，因此，鉴别起来有难度。
【主权项】
1. 一组鉴别白及及其混淆品的PCR特异性鉴别引物，其特征在于:所述一组鉴别白及及 其混淆品的PCR特异性鉴别引物由上游引物BJ-F和下游引物BJ-R组成，所述上游引物BJ-F 的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示，所述下游引物BJ-R的碱基序列如SEQ ID N0:2所示。2. -种鉴别白及及其混淆品的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 提取待鉴定样品的基因组DNA; (2) 以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的一组鉴别白及及其混淆品 的PCR特异性鉴别引物对其进行PCR扩增，PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中，10 X PCR Taq buffer(Mg2+plus 20mM)2.5yL，10mM dNTP 0·5μL，10μΜ上游引物BJ-F 1μL，10μΜ下游引 物BJ-R IyL，2U/yL DNA Taq聚合酶0.5yL，IO-IOOng DNA模板IyL，灭菌蒸馏水 18.5yL，PCR 扩增程序为:94°C预变性4min，循环内94°C变性45s，58°C退火lmin，72°C复性lmin，32个循 环后72°C延伸7min; (3) 对步骤(2)的PCR扩增产物进行电泳检测，在508bp处检测出条带的待鉴定样品为白 及，在508bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。
【文档编号】C12Q1/68GK105907873SQ201610399569
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】季鹏章, 杨雁, 朱新焰, 李彦莹, 狐小斌, 董志渊, 金航, 杨天梅, 张智慧, 王家金
【申请人】云南省农业科学院药用植物研究所