一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法

文档序号:10548611阅读:819来源:国知局
一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法。该方法结合了实时荧光定量PCR技术及熔解曲线分析技术,根据熔解曲线Tm值差异鉴定GDr180株与野毒株;操作简单:只需在PCR反应之前加探针即可;检测速度快且高通量:全部操作过程只需3小时,极大缩短了分型所需时间;费用相对较低:只需要一条普通探针即可达到鉴别检测的目地;准确性高、特异性好,重复性好,可以准确、快速、高通量地进行分析,有利于在临床实践中推广应用。
【专利说明】
_种快速区分HP-PRRS疫苗GDr 180株与野毒株的引物、探针及 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及病毒活疫苗毒株与野毒株的鉴别方法,具体涉及一种快速区分高致病 性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株的检测方法及其引物和探针。
【背景技术】
[0002] 2006年夏,在中国南方爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征(High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP_PRRS)疫情,这次疫情发病快、病 死率高、治愈率低,在半年内波及全国各地,给我国养猪业造成严重的损失。HP-PRRS是由猪 繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)变异株引起的一种急性高致死性疫病,该变异株称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征 病毒(HP-PRRSV)。目前我国主要采取以疫苗免疫为主的综合性防控措施,对猪实施强制免 疫,使用的高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗均为活疫苗(江西株JXA1-R、湖南株Hun4-F112、天津株 TJM-F92、广东株 GDrl80)。
[0003] 由于高致病性猪蓝耳病疫苗种类较多,加之国内外学者与养猪企业对HP-PRRS疫 苗使用观点的差异,导致我国目前猪蓝耳病疫苗的使用相对混乱。多种疫苗株同时使用增 加了病毒重组的风险,同时部分疫苗有毒力返强的可能性。所以,对发病猪进行病原检测, 有效、尽早地诊断感染病原是疫苗株还是野毒株,对于猪场有效控制动物疫病,最大限度减 少经济损失具有重要意义。HP-PRRS疫苗株⑶rl80于2015年5月获得农业部颁发的三类新兽 药注册证书并上市。针对HP-PRRS疫苗株⑶rl80与野毒株的鉴别诊断方法仅有一篇采用MGB 探针法的报道(张文利,等.高致病性PRRSV⑶疫苗株与野毒株双重荧光定量RT-PCR鉴别 方法的建立[J],中国预防兽医学报.2012, 11(34): 898-902)。虽然该方法具有较高灵 敏度和特异性,但该方法涉及到两条MGB探针,成本较高,难以普及使用。所以建立一种成本 低,灵敏度高,特异性强,推广易,可快速区分HP-PRRSV活疫苗GDrl80株与野毒株的检测方 法具有重要的意义。
[0004] 焚光恪解曲线分析技术(fluorescence melting curve analysis,FMCA)是一种 结合了实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)及熔解曲线分析(Melting Curve Analysis,MCA)技 术的新的基因分型诊断检测技术(Ahn JJ, Kim Y, Lee SY, Hong JY, Kim GW, Hwang SY. Fluorescence melting curve analysis using self-quenching dual-labeled peptide nucleic acid probes for simultaneously identifying multiple DNA sequences. Anal Biochem. 2015, 484:143-7·)。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 GDrl80株与野毒株的引物和探针。
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 ⑶r 180株与野毒株的方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 GDr 180株与野毒株的试剂盒。
[0008] 本发明所采取的技术方案是: 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗株GDrlSO株与野毒株的引物,其核 苷酸序列如下所示: 引物P1:5'-GGTTGACATGCTGACTTG-3'(SEQIDN0:1), 引物P2:5'-CACTGAACCAATGGTGAG-3'(SEQ ID N0:2)。
[0009] 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株的探针,其 核苷酸序列如下所示: 探针P:5'-CCCAAGGATGATTCTCGAGACACCG _3'(SEQ ID N0:3)。
[0010] -种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株的试剂盒, 该试剂盒含有上述所述的引物。
[0011] 进一步的,该试剂盒还含有上述所述的探针。
[0012] 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株的方法,包 括以下步骤: 1) 从样品中提取病毒核酸; 2) 以核酸为模板,用上述所述的引物对PI、P2、探针P进行FMCA扩增反应获得扩增产物; 3) 对扩增产物进行FMCA分析,确定病毒类型。
[0013] 进一步的,步骤2冲FMCA扩增反应体系为: 核酸模板 1 yL PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.5 yL 2X1 Step Buffer 6.25yL 2.0Mm 引物 PI 0.5pL lOMm 引物 P2 0.5pL lOMm 探针P 0.25pL RNase Free ddH2〇 3.5pL 总体积 12.5yL。
[0014] 进一步的,步骤2)中的FMCA扩增反应程序为:50°C反转录30min; 95°C预变性2min; 95°C 变性 20s,55°C 退火 20s,72°C 延伸 20s;循环 55 次;98°C 变性 2min,40°C 杂合 2min,55°C 到 75°C以l°C/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
[0015] 进一步的,步骤3)中所述FMCA分析的具体分析过程为: 以标准阳性样品高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO为阳性对照,若待检样品 和阳性对照之间熔解峰Δ Tm值的绝对值小于1.0°C,则判定为HP-PRRSV疫苗株GDrl80; 以标准阳性样品高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒GD株为阳性对照,若待检样品和阳 性对照之间熔解峰Δ Tm值的绝对值小于1.0°C,则判定为HP-PRRSV野毒株。
[0016] 本发明的有益效果是: 1)本发明首次建立了一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与 野毒株的熔解曲线分析方法、引物和探针,操作简单:只需在PCR反应之前加探针即可;检测 速度快且高通量:全部操作过程只需3小时,极大缩短了分型所需时间;费用相对较低:只需 要一条普通探针即可达到鉴别诊断的目地;准确性高、特异性好,重复性好,可以准确、快 速、高通量地进行分析,有利于在临床实践中推广应用。
[0017] 2)本发明的FMCA引物,对HP-PRRSV疫苗株GDr 180及野毒株,均有很好的扩增性,有 助于提高PCR的效率,减少病毒鉴别分型的时间。
[0018] 3)本发明的探针P对疫苗株⑶rl80有完全的匹配性,对HP-PRRSV野毒株仅有一个 碱基的差异,有助于提高分析效率,减少病毒分型的时间。
[0019] 4)本发明的FMCA引物和探针特异性好,只与疫苗株GDrl80和野毒株结合,不与其 他常见猪源病毒,如猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪伪狂犬病毒 (Pseudorabies Virus, PRV)、猪圆环2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪细小病 毒(Porcine parvovirus, PPV)等核酸结合,特异性扩增HP-PRRSV核酸,有利于提高本发明 对HP-PRRSV疫苗株GDrl80和野毒株分析的正确性。
[0020] 5)本发明利用一步法FMCA方法来提高区别HP-PRRSV疫苗株GDrl80及野毒株的准 确性和重复性。本发明方法成本低,灵敏度高,特异性强,具有较高的临床应用推广价值。
【附图说明】
[0021] 图1为⑶rl80和⑶标准样品FMCA峰型化熔解曲线图; 图2为临床样品FMCA峰型化熔解曲线图;以标准品⑶rl80和⑶作为阳性对照;红色熔解 曲线为HP-PRRSV疫苗株GDr 180阳性对照品,蓝色熔解曲线为HP-PRRSV野毒株GD阳性对照 品,其它的为临床野毒样本及水对照样品; 图3为FMCA方法特异性试验结果;红色熔解曲线为HP-PRRSV疫苗株⑶r 180阳性对照品, 蓝色熔解曲线为HP-PRRSV野毒株⑶阳性对照品,其它的为CSFV、PRV、PCV2和PPV核酸样本及 水对照样品; 图4为质粒阳性样本FMCA方法灵敏度试验结果;其中A为质粒p-GDrl80梯度稀释扩增曲 线,B为质粒p-GDrl80梯度稀释恪解曲线;C为质粒p-GD梯度稀释扩增曲线,D为质粒p-GD梯 度稀释熔解曲线。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
[0023]实施例1 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株 的引物和探针 1)FMCA引物: 经过对所设计的大量引物进行筛选后,发现引物碱基序列SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2 对FMCA方法区分HP-PRRSV疫苗GDr 180株和野毒株的效果最好,其碱基序列如下所示。
[0024] P1:5,-GGTTGACATGCTGACTTG-3,(SEQ ID N0:1), P2:5,-CACTGAACCAATGGTGAG-3,(SEQ ID N0:2)〇
[0025] 2)探针 经过对所设计的大量探针进行筛选后,发现探针碱基序列SEQ ID N0:3对FMCA方法区 分HP-PRRSV疫苗GDrlSO株和野毒株的效果最好,其碱基序列如下所示。
[0026] 探针P: 5 ' -FAM-CCCAAGGATGATTCTCGAGACACCG-BHQ1-3 '(SEQ ID NO: 3),或其核苷 酸反向互补序列。
[0027] 实施例2 -种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株 的检测方法 标准样品的FMCA分析 1 )PRRSV标准品核酸的提取: 分别取HP-PRRSV疫苗⑶r 180株,加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行溶解,取HP-PRRSV野毒 ⑶株细胞培养液,分别取200yL按TAKARA公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4.0的说明书进行核酸提取。
[0028] 2)阳性标准样品的FMCA操作步骤 为了验证所设计的引物和探针对实际样品的鉴别能力,本研究利用HP-PRRSV疫苗株 GDr 180和HP-PRRSV野毒GD株作为标准样品进行FMCA分析。分别以上述标准样品提取核酸作 为核酸模板,分别进行FMCA扩增反应和分析。
[0029] FMCA 分析: 参照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit产品说明书,按以下组成配制FMCA反应液。
[0030] RT-PCR扩增反应程序为50°C反转录30min; 95°C预变性2min; 95°C变性20s,55°C退 火20s,72°C延伸20s;循环55次。
[0031] FMCA运行程序:98°C变性2min,40°C杂合2min,55°C到75°C以l°C/s的熔解速率进 行恪解曲线分析。FMCA试验结果用LightCycler? 96 SW 1.1软件进行分析。
[0032] 3)阳性标准样品FMCA结果分析 RT-PCR扩增产物用ROCHE LightCycler 96分析仪进行分析。
[0033]图1为⑶rl80和⑶标准样品FMCA峰型化熔解曲线图。分析结果显示,熔解曲线分析 方法能够区分HP-PRRSV疫苗株⑶rl80和HP-PRRSV野毒株。其中,GDrl80熔解峰Tm值较高为 68.42 ± 0.2°C,⑶熔解峰Tm值较低为63.65 ± 0.1°C,两者熔解峰Tm差异明显(约4.7°C )。 [0034]实施例3 -种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株 的方法 临床样品FMCA分析 1)从样本中提取病毒核酸:分别取疑似感染有HP-PRRSV的猪肺脏组织样品2g,加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行研磨,将研磨好的匀浆液4000 Xg离心8 min,并吸取离心上清液 至_80°C保存备用;或血清样本200yL;组织样品匀浆液和血清样品按TAKARA公司的 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行核酸提取。
[0035] 2)以提取的病毒核酸为模板,以上述实施例2中所述的方法进行FMCA分析,结果分 析方法如下: 以标准品GDrlSO为阳性对照,待检样品和阳性对照之间熔解峰Δ Tm值的绝对值小于 1.0°C时判定为HP-PRRSV疫苗株GDrl80; 以标准品GD为阳性对照,待检样品和阳性对照之间熔解峰Δ Tm值的绝对值小于1.0°C 时判定为HP-PRRSV野毒株。
[0036] 为了验证所建立的方法对实际临床样品的鉴别能力。本发明对广东省养殖场收集 到的1 〇份HP-PRRSV临床样品进行FMCA分析,分析结果如图2,从中可以看出,10份临床样品 中共检测出1份HP-PRRSV疫苗株GDrl80(9号样本)和9份HP-PRRSV野毒株(1-8号、10号样 本)。1份HP-PRRSV疫苗株GDrl80(9号样本)熔解峰Tm值为68.38°C,与阳性对照样品⑶rl80 熔解峰Δ Tm值绝对值小于1°C(0.04°C),9份HP-PRRSV野毒株(1-8号、10号样本)熔解峰Tm值 为64.02 ± 0.36°C,与阳性对照样品⑶熔解峰Δ Tm值绝对值小于1°C (0.56 ± 0.36°C )。
[0037] 实施例4 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株 的方法 特异性实验 下面对本发明建立的FMCA检测方法进行特异性检测。
[0038] 分别提取其他常见猪病毒核酸,如猪痕病毒(classical swine fever virus, CSFV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)、猪圆环2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)的核酸为模板,以上述实施例3中所述 的方法进行FMCA分析,分别验证引物P1/P2和探针P特异性,同时以HP-PRRSV疫苗株⑶rl80 和HP-PRRSV野毒⑶株为阳性对照,水作为阴性对照进行FMCA分析。
[0039]分析结果如图3所示,从图上可看出,本发明FMCA检测方法能特异性扩增出HP-PRRSV并形成特异的熔解峰型,而其它常见病毒,如CSFV、PRV、PCV2和PPV样品均未形成特异 的熔解峰型,表明本发明使用的探针p、引物P1/P2特异性高,适合作为FMCA探针和引物。 [0040]实施例5 -种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株 的检测方法 灵敏度试验 下面对本发明建立的检测方法进行灵敏度检测。
[0041 ] 分别以HP-PRRSV疫苗株GDrl80和HP-PRRSV野毒GD株Nsp3基因构建阳性质粒P- GDrl80和p-GD(Nsp3基因中含有本发明检测的目的基因片段),将阳性质粒分别进行定量和 梯度稀释后进行FMCA分析,检测本发明检测方法最低检测限。
[0042] 其中FMCA反应参考TAKARA公司的Ex Taq? Version 2.0说明书配制扩增反应体 系,为:
PCR扩增反应程序为95°C预变性2min; 95°C变性20s,55°C退火20s,72°C延伸20s;循环 55次。
[0043]其余按照上述实施例3中所述的方法进行分析。
[0044]图4为质粒阳性样本FMCA方法灵敏度试验结果;A为质粒p-GDrl80梯度稀释扩增曲 线,B为质粒p-GDrl80梯度稀释恪解曲线;C为质粒p-GD梯度稀释扩增曲线,D为质粒p-GD梯 度稀释熔解曲线,数据卜10表示的质粒浓度依次为1.〇χ1〇 9、1.〇χ1〇8、1.〇χ1〇7、1.〇χ1〇6、 l.OxlO^l.OxlO'l.OxlO^l.OxlO^l.OxlO^l.OxloQcopies/yL;从图4中可看出,本发明 FMCA方法对阳性质粒p_GDrl80和p-GD最低检测限分别为1.0xl0Qcopy/yL和1.0xl0 Qcopy/y L〇
[0045]上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化, 均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗株GDrlSO株与野毒株的引物,其 核苷酸序列如下所示: 引物P1:5'-GGTTGACATGCTGACTTG-3'(SEQIDN0:1), 引物P2:5'-CACTGAACCAATGGTGAG-3'(SEQ ID NO:2)。2. -种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株的探针,其核 苷酸序列如下所示: 探针P:5'_ CCCAAGGATGATTCTCGAGACACCG-3'(SEQ ID NO:3)。3. -种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株的试剂盒,其 特征在于:该试剂盒含有权利要求1所述的引物。4. 根据权利要求3中所述的试剂盒,其特征在于:该试剂盒还含有权利要求2所述的探 针。5. -种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO株与野毒株的方法,其特 征在于:包括以下步骤: 1) 从样品中提取病毒核酸; 2) 以核酸为模板,用权利要求1所述的引物对P1、P2、权利要求2所述的探针P进行FMCA 扩增反应获得扩增产物; 3 )对扩增产物进行FMCA分析,确定病毒类型。6. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于:步骤2)中FMCA扩增反应体系为: 核酸模板 I yL PrimeScript I Step Enzyme Mix 0.5 yL 2X1 Step Buffer 6.25yL 2 .OMm 引物 Pl 0.5pL IOMm 引物 P2 0.5pL IOMm 探针P 0.25pL RNase Free ddH2〇 3.5pL 总体积 12.5yL。7. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于:步骤2)中的FMCA扩增反应程序为:50°C反 转录 30min; 95°C 预变性 2min; 95°C 变性 20s,55°C 退火 20s,72°C 延伸 20s;循环 55 次,98°C 变 性2min,40°C杂合2min,55°C到75°C以l°C/s的熔解速率进行熔解曲线分析。8. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于:步骤3)中所述FMCA分析的具体分析过程 为: 以标准阳性样品高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDrlSO为阳性对照,若待检样品 和阳性对照之间熔解峰Δ Tm值的绝对值小于1.0°C,则判定为HP-PRRSV疫苗株GDrl80; 以标准阳性样品高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒GD株为阳性对照,若待检样品和阳 性对照之间熔解峰Δ Tm值的绝对值小于1.0°C,则判定为HP-PRRSV野毒株。
【文档编号】C12Q1/68GK105907890SQ201610296854
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】刘志成, 张建峰, 沈海燕, 张春红, 孙俊颖, 康桦华
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所
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