阳离子性脂质的制作方法

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阳离子性脂质的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种阳离子性脂质,该阳离子性脂质可利用于向细胞质的核酸传递,而可解决脂质复合物的物理稳定性的课题。本发明的阳离子性脂质的特征在于:它是下述通式(3)所表示的化合物或其药剂学上可接受的盐。[化66][式(3)中,L表示碳数7~12的烷基或碳数7~12的烯基,R表示碳数1~2的烷基;n1及n2分别独立地表示1~3的整数。]。
【专利说明】
阳离子性脂质
技术领域
[0001] 本发明涉及一种新颖的阳离子性脂质。
[0002] 本申请案是基于2014年1月9日在美国提出申请的临时申请案61/925,267号而主 张优先权,并将其内容引用到本文中。
【背景技术】
[0003] siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、shRNA(短发夹RNA、或小发夹RNA)表达载体、 反义寡核苷酸等核酸是在活体内诱导序列特异性基因表达抑制的核酸,其作为核酸医药而 为公众所知。
[0004] 在这些核酸医药中,特别是siRNA备受瞩目。siRNA是包含19~23个碱基对的双链 RNA,其会诱导被称为RNA干扰(RNA interference;RNAi)的序列特异性基因表达抑制。
[0005] 然而,siRNA虽化学性质稳定,但在治疗用途中存在如下问题:容易被血浆中的 RNase(核糖核酸酶,ribonuclease)分解、及当单独存在时难以透过细胞膜(例如,专利文献 1)〇
[0006] 针对所述问题,已知有通过将siRNA封入到含有阳离子性脂质的微粒子内,而保护 所封入的siRNA免于在血浆中发生分解,且可使siRNA透过脂溶性细胞膜,作为此种含有阳 离子性脂质的脂质粒子,提出了含有特定的阳离子性脂质并通过挤出法或线内混合法而制 备的脂质制剂(例如,参照专利文献1)。
[0007] 专利文献1中所记载的脂质制剂是在微粒子中封入了核酸等高分子的核酸-脂质 粒子组合物,并且披露了该脂质制剂可将核酸导入到细胞中。
[0008] 另外,作为被期待利用于核酸医药的阳离子性脂质,现在开发出了各种化合物(例 如,参照专利文献2~6及非专利文献1),但已知含有具有非对称结构的阳离子性脂质的脂 质纳米粒(Lipid nanoparticles,LNPs)在保管期间粒径会增大,也就是说在物理稳定性方 面存在课题(非专利文献2)。
[0009] 针对所述问题,非专利文献2中披露了通过对含有具有非对称结构的阳离子性脂 质的LNPs选择性地使用某种磷脂质,而使粒径的增大得到抑制。
[0010]现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1:日本专利特表2012-530059号公报 [0013] 专利文献2:国际公开第2012/040184号
[0014] 专利文献3:国际公开第2013/059496号
[0015] 专利文献4:国际公开第2010/144740号 [0016] 专利文献5:美国公开第2013/0178541号 [0017] 专利文献6:美国专利第8158601号 [0018]非专利文献
[0019]非专利文献 l:Angew.Chem.Int.Ed.(德国应用化学)2012,51,8529-8533
[0020] 非专利文献2:Mol .Pharmaceutics(分子制药)2014,3,11(11) ,4143-53

【发明内容】

[0021] 发明所要解决的技术问题
[0022] 然而,尽管最近有所进展,但可利用于向细胞质的核酸传递而可解决如上所述的 物理稳定性的课题的阳离子性脂质仍然是必要的。
[0023]解决问题的技术手段
[0024] 本发明的阳离子性脂质的特征在于:它是下述通式(1)所表示的化合物或其药剂 学上可接受的盐。
[0025] [化1]
[0026]
[0027]通式(1)中,R1及R2分别独立地表示碳数4~24的烷基或碳数4~24的烯基,m及Π 2 分别独立为1~3的整数,R3为碳数1~3的烷基。
[0028] 所述通式(1)中,R1也可具有由碳链的一部分缩合而形成的1个以上的环丙烷。
[0029] 所述通式(1)中,R1也可具有由碳链的一部分缩合而形成的1个环丙烷。
[0030] 所述通式(1)中,R1为
[0031] [化2]
[0032] (2)
[0033] R2为表示碳数7~12的烷基或碳数7~12的烯基的L、R3为碳数1~2的烷基R的本发 明的阳离子性脂质是以下述通式(3)表示。
[0034] [化3]
[0035]
[0036] 关于本发明的阳离子性脂质,在通式(3)中,m及112也可分别独立为1~2的整数。
[0037] 本发明的阳离子性脂质也可为选自以下化合物中的化合物或其药剂学上可接受 的盐。
[0038] 1)[化4]
[0050] 7)[化 10]
[0054] 本发明的阳离子性脂质也可为下述式(4)所表示的化合物或其药剂学上可接受的 盐。
[0055] [化12]
[0056]
[0057] 本发明的阳离子性脂质也可为下述式(5)所表示的化合物或其药剂学上可接受的 盐。
[0058] [化13]
[0059]
[0060] 本发明的阳离子性脂质也可为下述式(10)所表示的化合物或其药剂学上可接受 的盐。
[0061] [化 14]
[0062]
[0063] 本发明的组合物的特征在于含有:(1)本发明的阳离子性脂质、(II)选自由中性脂 质、聚乙二醇修饰脂质及固醇所组成的组中的至少一种脂质及(III)核酸。
[0064] 本发明的组合物可通过如下制造方法而制造,该制造方法包括:将包含(I)本发明 的阳离子性脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇修饰脂质及固醇所组成的组中的至少一 种脂质的含极性有机溶剂的水溶液、与含有(III)核酸的水溶液加以混合而获得混合液的 步骤;以及使所述混合液中的极性有机溶剂的含量减少的步骤。
[0065]发明效果
[0066]根据本发明的阳离子性脂质,可向细胞质高效率地释放核酸。另外,根据本发明的 阳离子性脂质,可解决如上所述的物理稳定性的课题。因此,本发明的阳离子性脂质具有作 为用于向细胞质传递核酸的脂质的可利用性。
【附图说明】
[0067]图1是表示实施例20及比较例1的组合物的平均粒径随时间经过而产生的变化。 [0068]图2是表示实施例21~25及比较例2的组合物在保管前后的平均粒径变化。
【具体实施方式】
[0069]《阳离子性脂质》
[0070] 在一个实施方式中,本发明提供一种阳离子性脂质,它是下述通式(1)所表示的化 合物或其药剂学上可接受的盐。阳离子性脂质也可为所述盐的水合物或所述盐的溶剂合 物。
[0071] [化15]
[0072]
[0073]通式(1)中,R1及R2分别独立地表示碳数4~24的烷基或碳数4~24的烯基,m及Π 2 分别独立为1~3的整数,R3为碳数1~3的烷基。
[0074]通式(1)中,R1可具有由碳链的一部分缩合而形成的1个以上的环丙烷,也可具有1 个环丙烷。
[0075] 所述通式(1)中,R1以 [0076][化 16]
[0077]
[0078] 表示、R2为表示碳数7~12的烷基或碳数7~12的烯基的L、R3为碳数1~2的烷基R的 本发明的阳离子性脂质是以下述通式(3)表示。
[0079] [化 17]
[0080]
[0081] 关于本发明的阳离子性脂质,在通式(3)中,m及112也可分别独立为1~2的整数。
[0082] 在本发明中,所谓阳离子性脂质,是指下述式所表示的具有脂质亲和性区域X和亲 水性区域Z的两亲分子(amphiphilic molecule),该脂质亲和性区域X含有一个以上的经 基,该亲水性区域Z含有在生理pH值下会质子化的极性基。此外,本发明的阳离子性脂质也 可在脂质亲和性区域和亲水性区域之间具有连结区Y。
[0083] [化 18]
[0084] X-Y-Z
[0085] 在本说明书中,所谓"烷基",是指具有指定个数的碳原子的直链状、环状或支链状 的饱和脂肪族烃基。
[0086] 在本说明书中,所谓"烯基",是指具有指定个数的碳数的直链状、环状或支链状的 不饱和脂肪族烃基,例如可列举二烯、三烯及四烯等,但并不限定于这些。
[0087]作为所述环状"烷基"或环状"烯基",例如可列举具有1个以上由碳链的一部分缩 合而形成的环丙烷或环丁烷等环的基,但并不限定于这些。
[0088] 作为所述通式(3)所表示的化合物,可列举以下的化合物。
[0089] [化 19]

[0105] 本发明的阳离子性脂质是所述通式(1)所表示的化合物或其药剂学上可接受的 盐。即,本发明的阳离子性脂质可发生质子化而含有下述通式0-)所表示的阳离子。
[0106] [化 27]
[0107]
[0108] [通式(Γ)中,R1~R3、m及112分别表示与所述通式(1)中的R 1~R3、m及112相同的含 义]
[0109] 作为与所述通式(Γ)所表示的阳离子成对,且本发明的阳离子性脂质可含有的阴 离子,只要为药剂学上可接受的阴离子,则没有特别限定,例如可列举:氯化物离子、溴化物 离子、硝酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子等无机离子;醋酸根离子、草酸根离子、马来酸 根离子、富马酸根离子、柠檬酸根离子、苯甲酸根离子、甲磺酸根离子等有机酸根离子等。 [0110]《阳离子性脂质的制造方法》
[0111] 对本发明的阳离子性脂质的制造方法进行说明。下述式(12)及(13)中表示阳离子 性脂质的合成流程的一个实施方式。
[0112] [化 28]
[0113] 合成流程1
[0114]
[0115] 合成流程2
[0116]
[0117] 通式中,R4是以下述通式(14)表示。
[0118] [化 29]
[0119]
[0120] 通式中,R3、nLSn2分别表示与所述通式(1)中的R 3、nLSn2相同的含义。
[0121 ]通式中,a及b分别表示0以上且a与b的和成为17以下的整数。
[0122] 新颖阳离子性脂质(1-5)的合成例如可依照合成流程1而合成。通过对化合物(1-1)缩合叱0-二甲基羟基胺而获得温勒伯酰胺(1以1^4 &1^如)(1-2)。通过添加格氏试剂 (Grignard reagent)而获得酮(1-3)。并且,通过利用氢化错锂进行还原,而获得醇(1-4)。 通过使该醇(1 -4)和羧酸进行缩合而获得酯(1 -5)。
[0123] 含有环丙基的新颖阳离子性脂质(1-10)的合成例如可依照合成流程2而进行。通 过西蒙斯-史密斯环丙烷化(Simmons-Smith clopropanation),由不饱和的温勒伯酰胺(1-6)而获得含有环丙基的温勒伯酰胺(1-7)。通过添加格氏试剂而获得酮(1-8)。并且,通过利 用氢化铝锂进行还原,而获得醇(1 -9)。通过使该醇(1 -9)和羧酸进行缩合而获得酯(1 -10)。
[0124] 《组合物》
[0125] 在一个实施方式中,本发明提供一种组合物,其含有(I)本发明的阳离子性脂质、 (II)选自由中性脂质、聚乙二醇修饰脂质及固醇所组成的组中的至少一种脂质及(III)核 酸。
[0126] 以下,对本发明的组合物的优选实施方式进行说明,但该实施方式是为了更好地 理解发明的主旨而具体地进行说明,只要没有特别指定,则并不限定本发明。
[0127] 本实施方式的组合物中的脂质组成优选含有本发明的阳离子性脂质10摩尔%~ 100摩尔%,更优选含有20摩尔%~90摩尔%,特别优选含有40摩尔%~70摩尔%。
[0128] 作为本实施方式的组合物中的核酸,可列举:siRNA、miRNA、shRNA表达载体、反义 寡核苷酸、核酶等,优选s iRNA、miRNA。
[0129] 本实施方式的组合物优选含有核酸0.01重量%~50重量%,更优选含有0.1重 量%~30重量%,特别优选含有1重量%~10重量%。
[0130] 本实施方式的组合物中的脂质组成中含有(I)本发明的阳离子性脂质和(II)选自 由中性脂质、聚乙二醇修饰脂质及固醇所组成的组中的至少一种脂质。
[0131]作为中性脂质,可列举:二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱 (P0PC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、二山嵛酰磷脂酰胆碱(DBPC)、二 (二十四酰)磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰胆碱(D0PC)、鞘磷脂、神经酰胺、二油酰磷脂 酰甘油(D0PG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺 4- (N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1 -羧酸酯(DOPE-ma 1)等。
[0132] 本实施方式的组合物中的脂质组成中优选含有中性脂质0摩尔%~50摩尔%,更 优选含有〇摩尔%~40摩尔%,特别优选含有0摩尔%~30摩尔%。
[0133] 作为聚乙二醇修饰脂质,可列举:PEG2000-DMG(PEG2000-二肉豆蔻基甘油、 PEG2000-DPG(PEG2000-二棕榈酰甘油)、PEG2000-DSG(PEG2000-二硬脂酰甘油)、PEG5000-DMG(PEG5000-二肉豆蔻基甘油)、PEG5000-DPG(PEG5000-二棕榈酰甘油)、PEG5000-DSG (PEG5000-二硬脂酰甘油)、PEG-cDMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉 豆蔻基氧基丙基-3-胺)、PEG-C-D0MG(R-3-[(co-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1, 2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、聚乙二醇(PEG)-二酰甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、 PEG-磷脂质、PEG-神经酰胺(Cer)等。
[0134] 作为PEG-二烷氧基丙基,可列举:PEG-二月桂氧基丙基、PEG-二肉豆蔻氧基丙基、 PEG-二棕榈氧基丙基、PEG-二硬脂氧基丙基等。
[0135] 本实施方式的组合物中的脂质组成中优选含有聚乙二醇修饰脂质0摩尔%~30摩 尔%,更优选含有〇摩尔%~20摩尔%,特别优选含有0摩尔%~10摩尔%。
[0136] 作为固醇,可列举:胆固醇、二氢胆固醇、羊毛固醇、β-谷固醇、菜油固醇、豆固醇、 菜籽固醇、麦角固醇、岩藻固醇、3β-[Ν_(Ν',Ν'_二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)等。
[0137] 本实施方式的组合物中的脂质组成中优选含有固醇0摩尔%~90摩尔%,更优选 含有10摩尔%~80摩尔%,特别优选含有20摩尔%~50摩尔%。
[0138] 本实施方式的组合物中的脂质组成的组合没有特别限定,例如优选本发明的阳离 子性脂质、中性脂质及固醇的组合,或本发明的阳离子性脂质、中性脂质、聚乙二醇修饰脂 质及固醇的组合。
[0139] 此外,本实施方式的组合物也可含有蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、乳糖等糖;谷氨酰 胺、谷氨酸、谷氨酸钠、组氨酸等氨基酸;柠檬酸、磷酸、醋酸、乳酸、碳酸、酒石酸等酸的盐 等。
[0140]本实施方式的组合物也可制剂化为医药组合物。作为医药组合物的剂型,例如可 列举注射剂。
[0141 ]本实施方式的组合物例如可为通过冷冻干燥等而去除了溶剂的粉末状态,也可为 液体状态。在组合物为粉末状态的情况下,可在使用前悬浮或溶解到药学上可接受的介质 中制成注射剂而使用。在组合物为液体状态的情况下,可直接使用或者悬浮或溶解到药学 上可接受的介质中制成注射剂而使用。
[0142] 作为药学上可接受的介质,可列举:无菌水;生理盐水;含有葡萄糖、D-山梨糖醇、 D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠等辅助药的等渗液等。本实施方式的组合物还可含有乙醇、 丙二醇、聚乙二醇等醇等溶解辅助剂,稳定剂、抗氧化剂、防腐剂等添加剂。
[0143] 本实施方式的组合物形成由含有阳离子性脂质的脂质所构成的微粒子内封入了 核酸的脂质复合物。脂质复合物的"平均粒径"可通过体积平均、数量平均、Z-平均的任一种 方法算出。在本实施方式的组合物中,脂质复合物的平均粒径(Z-平均)例如优选10nm~ 1 OOOnm,更优选30nm~500nm,特别优选30nm~200nm。
[0144] 本实施方式的组合物优选在保管期间,粒径和保管前相比不会过度增大的组合 物。例如,优选在4°C下保管6个月的情况下的粒径的大小相对于保管前的粒径的大小为1.6 倍以下的组合物,更优选1.3倍以下,特别优选1.2倍以下。
[0145] 关于本实施方式的组合物,为了使其不容易引起非特异性吸附或免疫反应,优选 在pH值约7.4的环境下(例如,血液中)其表面几乎无电荷的组合物。另外,关于本实施方式 的组合物,为了在因内吞作用而被吞入到细胞内时,容易和内吞体膜融合,优选在低pH值环 境下带正电的组合物。
[0146] 《组合物的制造方法》
[0147] 在一个实施方式中,本发明提供一种组合物的制造方法,该制造方法包括步骤(a) 及步骤(b),步骤(a)是将包含(I)本发明的阳离子性脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇 修饰脂质及固醇所组成的组中的至少一种脂质的含极性有机溶剂的水溶液、与含有(III) 核酸的水溶液加以混合而获得混合液,步骤(b)是使所述混合液中的极性有机溶剂的含量 减少。
[0148] 以下,对本发明的组合物的制造方法的优选实施方式进行说明,但该实施方式是 为了更好地理解发明的主旨而具体地进行说明,只要没有特别指定,则并不限定本发明。
[0149] 通过水溶性的核酸和上述阳离子性脂质的静电相互作用及脂质间的疏水相互作 用,可形成由脂质构成的微粒子内封入了核酸的脂质复合物。例如,通过改变含有(I)本发 明的阳离子性脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇修饰脂质及固醇所组成的组中的至少 一种脂质的脂质成分在含极性有机溶剂的水溶液中的溶解度,可形成脂质复合物。作为极 性有机溶剂,可列举乙醇等醇。
[0150] 首先,在步骤(a)中,将溶解了(I)本发明的阳离子性脂质和(II)选自由中性脂质、 聚乙二醇修饰脂质及固醇所组成的组中的至少一种脂质的含极性有机溶剂的水溶液、与含 有(III)核酸的水溶液加以混合而获得混合液。含极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶 剂的浓度只要在与核酸的水溶液混合后仍然满足溶解脂质分子的条件,则没有特别限定。
[0151] 接着,在步骤(b)中,向所述混合液中添加水等,由此使极性有机溶剂的含量减少。 由此,可形成脂质复合物。为了高效率地形成脂质复合物,优选使极性有机溶剂的含量急剧 降低。
[0152] 根据本实施方式的组合物的制造方法,可获得核酸被高效率地封入到微粒子内部 的脂质复合物。
[0153] 在封入到组合物中的核酸为核酸医药的情况下,可用作医药组合物。
[0154] 实施例
[0155] 以下,列举实施例更详细地说明本发明,但本发明并不限定于这些实施例。另外, 实施例中的化合物名是使用Marvin Sketch ver.5.4(ChemAxion)进行命名。
[0156] <阳离子性脂质的合成>
[0157] 实施例1 : 1-甲基哌啶-4-羧酸1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-酯(1-(2-octylcyclopropyl )heptadecan-8-yl l-methylpiperidine-4_carboxylate)(以下,称为 "阳离子性脂质Γ)的合成
[0158] 依照所述合成流程1或2,合成阳离子性脂质1。
[0159] 第1步骤:
[0160] 向将油酸(75.0g,265.5mmol)溶解到二氯甲烷(531.0mL)中而成的溶液中,添加 WSC(water soluble carbohydrate,水溶性碳水化合物)(101.8g,531.05mmol)、三乙基胺 (53.748,531.05!11111〇1)、10-二甲基羟基胺盐酸盐(51.88,531.05111111〇1)。在室温下搅拌到次 日后,添加水,将有机层分液。将有机层利用水清洗5次后,利用1M氢氧化钠水溶液清洗1次, 利用无水硫酸镁将其干燥。通过过滤将干燥剂去除,将滤液在减压下浓缩。对于所获得的组 合物1 (88.92g),不进行纯化而用于下一步骤。
[0161] 第2步骤:
[0162] 将二乙基锌(764.9mL,764.9mmol [ 1M溶液])溶解到二氯甲烷(1416.5mL)中,并冷 却到0°C。向该溶液中缓慢地滴加 TFA(Trif louroacetic acid,三氟醋酸)(87.2g, 764.9mmo 1)。因为已升温,所以再次冷却至IjO °C后添加二碘甲烷(204.9g,764.9mmo 1),并在0 °C的状态下搅拌30分钟。向该溶液中添加粗产物1 (83.0g,255. Ommol),升温到室温并搅拌1 小时。在确认反应结束后,利用氯化铵(300mL)使反应淬灭。将分液所获得的有机层利用无 水硫酸镁进行干燥。通过过滤将干燥剂去除,将滤液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法进行 纯化,而获得化合物2 (73.0g)。
[0163] 第3步骤:
[0164] 将化合物2(17.(^,50.07_〇1)溶解到1'冊(161:抑117(11'〇;1^11抑11,四氢咲喃)(1001111^) 中,在氮气环境下且室温下滴加1M的溴化壬基镁(100 1^,100!11111〇1)。搅拌1小时,确认反应结 束后添加充分量的氯化铵水溶液而使反应淬灭。对反应溶液进行水洗,将有机层利用无水 硫酸镁进行干燥。通过过滤将干燥剂去除,将滤液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法进行纯 化,而获得化合物3(11.7g)。
[0165] 第4步骤:
[0166] 向将所获得的化合物3(25.0g,61.5mmol)溶解到四氢呋喃(123mL)而成的溶液中, 添加氢化铝锂(2.3g,61.47_〇1),并加热回流一小时。在确认反应结束后,向反应体系中依 序缓慢地添加水(2.3mL)、15 %氢氧化钠水溶液(2.3mL)、水(6.9mL)而使反应淬灭。对该溶 液进行硅藻土过滤,将滤液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法进行纯化,而获得化合物4。
[0167] 第5步骤:
[0168] 向将所获得的化合物(0.5g,1.22mmo 1)溶解到二氯甲烷(4.9mL)而成的溶液中,添 加吧以0.478,2.45!11111〇1)、二甲基氨基吡啶(0.03 8,0.24臟〇1)、1-甲基哌啶-4-羧酸(0.358, 2.45_〇1)。在室温下搅拌到次日后,添加水,将有机层分液。将有机层利用水清洗5次后,利 用1N氢氧化钠水溶液清洗1次,并利用无水硫酸镁将其干燥。通过过滤将干燥剂去除,将滤 液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法进行纯化,而获得下述式(4)所表示的阳离子性脂质1 (0.2g,0.37mmol)〇
[0169] [化 30]
[0170]
[0171 ]在以下条件下利用HPLC_LC/MS(high performance liquid chromatography-liquid chromatography/mass spectrometry,高效液相色谱-质谱联用)对所获得的化合 物进行确认。色谱柱:YMC-TriartC18、150-4 · 6mm、5μπι,洗提液:MeOH(均匀溶剂),流速: 1. OmL/分钟,运行时间:15分钟,柱温:45°C,检测:UV( 215nm)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)。
[0172] HPLC-LC/MS,Rt 11.3分钟,ESI-MS(M+H)计算值533.5、测量值534.6,咕 NMR (400MHz,CDCl3)S4.87(lH,q),2.81(2H,d),2.26(3H,s),2.23(lH,m),1.98(2H,t),1.93 (2H,d),1.80(2H,m),1.50(4H,m),1.37(6H,m),1.27(32H,m),1.13(2H,s),0.87(6H,dd), 0.64(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0173] 实施例2~9、参考例1~4
[0174] 和实施例1同样地合成下述的阳离子性脂质2~13。
[0175] 实施例2:1-甲基吡咯烷-3-羧酸1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-酯(1-(2-octylcyclopropyl)heptadecan-8-yl l-methylpyrrolidine-3_carboxylate)(阳离子性 脂质2)
[0176] [化 31]
[0177]
[0178] HPLC-LC/MS,Rt 11.0min,ESI-MS(M+H)计算值519.5、测量值520.6,1H NMR (400MHz,CDC13)54.85(lH,ddd),3.03(lH,t),2.87(lH,t),2.64(lH,dd),2.59(lH,dd), 2.47(lH,d),2.35(3H,s),2.09(2h,ddd),1.50(4H,m),1.36-1.25(37H,m),1.12(3H,m), 0.87(6H,m),0.62(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0179] 实施例3: 1-乙基吡咯烷-4-羧酸1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-酯(1-(2-octylcyclopropyl )heptadecan-8-yl l-ethylpiperidine-4_carboxylate)(阳离子性月旨 质3)
[0180] [化 32]
[0181]
[0182] HPLC-LC/MS,Rt 12.1min,ESI-MS(M+H)计算值547.5、测量值548·6,1Η NMR (400MHz,CDC13)54.88(lH,ddd),2.90(2H,d),2.49(2H,dd),2.27(lH,m),1.98(4H,m),1.78 (2H,m),1.49(4H,m),l.36-1.25(37H,m),1.12(6H,m),0.87(6H,m),0.62(2H,dd),0.55(1H, m),-0.34(lH,dd)
[0183] 实施例4:1-甲基吖丁啶-3-羧酸1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-酯(1-(2-octylcyclopropyl )heptadecan-8-yl l-methylazetidine-3_carboxylate)(阳离子性月旨 质4)
[0184] [化 33]
[0185]
[0186] HPLC-LC/MS,Rt 9.65min,ESI-MS(M+H)计算值505.5、测量值506.5,1H NMR (400MHz,CDC13)54.88(lH,d),3.56(2H,m),3.26(3H,m),2.31(3H,s),1.76(lH,m),1.51 (4H,m),1.36-1.25(36H,m),1.12(3H,m),0.87(6H,m),0.62(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34 (lH,dd)
[0187] 实施例5: 1-甲基哌啶-4-羧酸1-( 2-辛基环丙基)十五烷-8-酯(1-(2-octylcyclopropyl )pentadecan-8-yl l-methylpiperidine-4_carboxylate)(阳离子性月旨 质5)
[0188] [化 34]
[0189]
[0190] HPLC-LC/MS,Rt 11.5min,ESI-MS(M+H)计算值505.5、测量值506.7,1H NMR (400MHz,CDC13)S4.87(lH,d),2.81(2H,d),2.33(3H,s),2.25(lH,m),2.01(2H,ddd),1.90 (2H,dd),1.79(2H,ddd),1.72(lH,m),1.50(4H,m),1.36-1.25(32H,m),1.12(3H,m),0.87 (6H,m),0.62(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0191] 实施例6: 1-甲基哌啶-4-羧酸1-( 2-辛基环丙基)十六烷-8-酯(1-(2_ octylcyclopropyl )hexadecan-8-yl l-methylpiperidine-4_carboxylate)(阳离子性月旨 质6)
[0192] [化 35]
[0193]
[0194] HPLC-LC/MS,Rt 13.1min,ESI-MS(M+H)计算值5丄9.5、测量值520·6,1Η NMR (400MHz,CDC13)S4.87(lH,d),2.81(2H,d),2.33(3H,s),2.25(lH,m),2.01(2H,ddd),1.90 (2H,dd),1.79(2H,ddd),1.72(lH,m),1.50(4H,m),1.36-1.25(34H,m),1.12(3H,m),0.87 (6H,m),0.62(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0195] 实施例7: 1-甲基哌啶-4-羧酸1-( 2-辛基环丙基)十八烷-8-酯(1_(2_ octylcyclopropyl )octadecan-8-yl l-methylpiperidine-4_carboxylate)(阳离子性月旨 质7)
[0196] [化 36]
[0197]
[0198] HPLC-LC/MS,Rt 17.1min,ESI-MS(M+H)计算值547.5、测量值548.5,1H NMR (400MHz,CDC13)S4.87(lH,d),2.81(2H,d),2.33(3H,s),2.25(lH,m),2.01(2H,ddd),1.90 (2H,dd),1.79(2H,ddd),1.72(lH,m),1.50(4H,m),1.36-1.25(38H,m),1.12(3H,m),0.87 (6H,m),0.62(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0199] 实施例8: 1-甲基哌啶-4-羧酸1-( 2-辛基环丙基)二十烷-8-酯(1_(2_ octy lcyclopropy 1) icosan-8-y 1 l-methylpiperidine-4_carboxylate)(阳离子性月旨质 8)
[0200] [化 37]
[0201]
[0202] HPLC-LC/MS,Rt 22.6min,ESI-MS(M+H)计算值575.5、测量值576.5,1H NMR (400MHz,CDC13)S4.87(lH,d),2.81(2H,d),2.33(3H,s),2.25(lH,m),2.01(2H,ddd),1.90 (2H,dd),1.79(2H,ddd),1.72(lH,m),1.50(4H,m),1.36-1.25(42H,m),1.12(3H,m),0.87 (6H,m),0.62(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0203] 实施例9: 1-乙基吡咯烷-3-羧酸1-(2-辛基环丙基)十七碳-8-酯(1-(2-octylcyclopropyl )heptadecan-8-yl l-ethylpyrrolidine-3_carboxylate)(阳离子性月旨 质9)
[0204] [化 38]
[0205]
[0206] HPLC-LC/MS,Rt 11.9min,ESI-MS(M+H)计算值533.5、测量值534·6,1Η NMR (400MHz,CDC13)S4.86(lH,ddd),3.00(2H,m),2.73(lH,dd),2.54(2H,dd),2.47(2H,ddd), 2.08(2H,m),1.50(5H,m),1.36-1.25(36H,m),1.12(6H,m),0.87(6H,m),0.62(2H,dd),0.55 (lH,m),-0.34(lH,dd)
[0207] 参考例1 :3-(二甲基氨基)丙酸1-( 2-辛基环丙基)十七烷-8-酯(1_(2_ octylcyclopropyl)heptadecan_8-yl 3-(dimethylamino)propanoate)(阳离子性脂质 10)
[0208] [化 39]
[0209]
[0210] HPLC-LC/MS,Rt 10.4min,ESI-MS(M+H)计算值507.5、测量值508.6,1H NMR (400MHz,CDC13)S4.88(lH,q),2.61(2H,dd),2.45(2H,dd),2.24(6H,s),1.51(4H,m),1.34 (6H,m),1.27(32H,m),1.13(2H,m),0.88(6H,m),0.64(2H,m),0.56(lH,dd),-0.34(lH,dd)
[0211] 参考例2 :4-(二甲基氨基)丁酸1-( 2-辛基环丙基)十七烷-8-酯(1-( 2-octylcyclopropyl)heptadecan_8-yl 4_(dimethylamino)butanoate)(阳离子性脂质11) [0212][化 40]
[0213]
[0214] HPLC-LC/MS,Rt 10.5min,ESI-MS(M+H)计算值521.5、测量值522.6,1H NMR (400MHz,CDC13)54.87(lH,q),2.31(4H,m),2.21(6H,s),2.17(lH,s),1.80(2H,m),1.61 (lH,s),1.50(2H,d),1.37(6H,m),1.27(32H,m),1.14(2H,m),0.87(6H,dd),0.64(2H,dd), 0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0215] 参考例3 :3-(二甲基氨基)-2-甲基丙酸1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-酯(1-(2-octylcyclopropyl )heptadecan-8-yl3-(dimethylamino)-2_methylpropanoate)(阳离子 性脂质12)
[0216] [化 41]
[0217]
[0218] HPLC-LC/MS,Rt 12.5min,ESI-MS(M+H)计算值521.5、测量值522·6,1Η NMR (400MHz,CDC13)S4.87(lH,q),2.66(2H,t),2.22(6H,s),1.51(4H,m),1.36-1.27(38H,m), 1.15(6H,m),0.88(6H,dd),0.64(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0219] 参考例4 :3-(哌啶-1-基)丙酸1-( 2-辛基环丙基)十七烷-8-酯(1-( 2-octylcyclopropyl )heptadecan_8-yl 3-(piperidin-l_yl )propanoate)(阳离子性脂质 13)
[0220] [化 42]
[0221]
[0222] HPLC-LC/MS,Rt 14.1min,ESI-MS(M+H)计算值547.5、测量值548.6,1H NMR (400MHz,CDC13)54.87(lH,q),3.59(2H,m),2.66(2H,t),2.48(2H,t),2.39(2H,m),1.58 (4H,m),1.49(4H,m),1.43-1.27(38H,m),1.13(4H,m),0.88(6H,dd),0.64(2H,dd),0.55 (lH,m),-0.34(lH,dd)
[0223] 参考例5:2-(二甲基氨基)-N_[ 1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-基]乙酰胺(以下,称 为"阳离子性脂质14")的合成
[0224] 依照下述合成流程3或4,而合成阳离子性脂质14。
[0225] [化 43]
[0226] 合成流程3
[0227]
[0228] 合成流程4
[0229]
[0230] 第1步骤:
[0231] 向将油酸(75 · 0g,265 · 5mmol)溶解到二氯甲烷(531 · OmL)而成的溶液中,添加 WSC (101.88,531.05謹〇1)、三乙基胺(53.748,531.05臟〇1)、叱0-二甲基羟基胺盐酸盐(51.88, 531.05_〇1)。在室温下搅拌到次日后,添加水,将有机层分液。将有机层利用水清洗5次后, 利用1M氢氧化钠水溶液清洗1次,并利用无水硫酸镁将其干燥。通过过滤将干燥剂去除,将 滤液在减压下浓缩。对于所获得的粗产物1(88.92g),不进行纯化而用于下一步骤。
[0232] 第2步骤:
[0233] 将二乙基锌(764.9mL,764.9mmol [ 1M溶液])溶解到二氯甲烷(1416.5mL)中,并冷 却至Ijo °C。向该溶液中缓慢地滴加 TFA(87.2g,764.9mmo 1)。因为已升温,所以再次冷却到0 °C 后添加二碘甲烷(204.9g,764.9mmol),并在0°C的状态下搅拌30分钟。向该溶液中添加粗产 物l(83.0g,255.Ommo 1),升温到室温并搅拌1小时。在确认反应结束后,利用氯化铵(300mL) 使反应淬灭。将分液所获得的有机层利用无水硫酸镁进行干燥。通过过滤将干燥剂去除,将 滤液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法进行纯化,而获得化合物2(73.0g)。
[0234] 第3步骤:
[0235] 将化合物2( 17.0g,50.07mmol)溶解到THF( 100mL)中,在氮气环境下且室温下滴加 1M的溴化壬基镁(10011^,100_〇1)。搅拌1小时,确认反应结束后添加充分量的氯化铵水溶 液而使反应淬灭。对反应溶液进行水洗,将有机层利用无水硫酸镁进行干燥。通过过滤将干 燥剂去除,将滤液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法进行纯化,而获得化合物3 (11.7g)。
[0236] 第4步骤:
[0237] 向将所获得的化合物3(11.0g,27. Ommol)溶解到乙醇(108mL)而成的溶液中,添加 羟基胺盐酸盐(2.4g,35. lmmol)、吡啶(18. OmL),在室温下搅拌一晚。将反应溶液浓缩,利用 醋酸乙酯进行萃取,并水洗,将有机层利用无水硫酸镁进行干燥。通过硅胶柱色谱法进行纯 化,而获得化合物4(10.8g)。
[0238] 第5步骤:
[0239] 将所获得的化合物4(10.0g,23.7mmo 1)溶解到THF(237mL)中,并冷却到0 °C。向该 溶液中添加氢化铝锂(〇. 9g,23.7mmol),加热回流1小时。在确认反应结束后,向反应体系中 依序缓慢地添加水(〇 . 9mL)、15 %氢氧化钠水溶液(0.9mL)、水(2.7mL)而使反应淬灭。对该 溶液进行硅藻土过滤,将滤液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法进行纯化,而获得化合物5 (5.5g)〇
[0240] 第6步骤:
[0241] 向将所获得的化合物(0.5g,1.23mmo 1)溶解到二氯甲烷(4.9mL)而成的溶液中,添 加 ¥3(:(0.478,2.45111111〇1)、三乙基胺(0.258,2.45111111〇1)川川-二甲基甘氨酸(0.25 8, 2.45_〇1)。在室温下搅拌到次日后,添加水,将有机层分液。将有机层利用水清洗5次后,利 用1N氢氧化钠水溶液清洗1次,并利用无水硫酸镁将其干燥。通过过滤将干燥剂去除,将滤 液在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法进行纯化,而获得下述式(20)所表示的阳离子性脂质 14(Ο·4g,Ο·8mmo1)〇
[0242] [化 44]
[0243]
[0244] HPLC-LC/MS,Rt 6.91 分钟,ESI-MS(M+H)计算值492.5、测量值493.6/Η NMR (400MHz,CDC13)56.84(lH,d),3.88(lH,dd),2.93(2H,s),2.29(6H,s),1.64(lH,m),1.49 (2H,m),1.27(39H,m),0.89(2H,m),0.88(6H,m),0.64(2H,m),0.56(lH,dd),-0.34(lH,dd)
[0245] 参考例6~13
[0246] 和参考例5同样地,依照所述合成流程3或4合成下述的阳离子性脂质15~22。
[0247] 参考例6:3-(二甲基氨基)-N_[ 1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-基]丙酰胺(3_ (dimethylamino)-N_[ l-(2_octylcyclopropyl )heptadecan_8-yl ]propanamide)(阳离子 性脂质15)
[0248] [化 45]
[0249]
[0250] HPLC-LC/MS,Rt 7.10min,ESI-MS(M+H)计算值506.5、测量值507·5,1Η NMR (400MHz,CDC13)56.84(lH,d),3.88(lH,dd),2.93(2H,s),2.29(6H,s),1.64(lH,m),1.49 (2H,m),1.27(41H,m),0.89(2H,m),0.88(6H,m),0.64(2H,m),0.56(lH,dd),-0.34(lH,dd)
[0251] 参考例7 :4-(二甲基氨基)-N_[ 1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-基]丁酰胺(4_ (dimethylamino)-N_[ l-(2_octylcyclopropyl )heptadecan_8-yl]butanamide)(阳离子性 脂质16)
[0252] [化 46]
[0254] nrLL-LL/Mb , κτ ? · ζιιπιιη,?:5?-Μ:5、Μ+??/)ΤΓ#1Μ·?3Ζ?)·ο、?κ?]Μ1Μ·521·5,1ΗΝΜΚ (400MHz,CDC13)56.06(lH,d),3.88(lH,dd),2.28(4H,m),2.21(6H,s),1.78(2H,q),1.64 (4H,s),1.27(40H,m),0.88(6H,m),0.64(2H,m),0.56(lH,dd),-0.34(lH,dd)[0255] 参考例8:2_(二甲基氛基)_N_[ (20Z, 23Z)_二十七碳-20,23-二稀-l0-基]乙醜胺 (2_(dimethylamino)-N_[ (20Z,23Z)-heptacosa_20,23-dien_l0-yl ]acetamide)(阳离子 性脂质17)
[0253]
[0256] [化 47]
[0257]
[0258] HPLC-LC/MS,Rt 6.50min,ESI-MS(M+H)计算值476.5、测量值477·5,1Η NMR (400MHz,CDC13)56.84(lH,d),5.35(4H,m),3.88(lH,dd),2.93(2H,s),2.77(2H,t),2.29 (6H,s),2.17(2H,s),2.05(4H,m),1.63(4H,m),1.36(3H,t),1.25(25H,m),0.88(6H,dd)
[0259] 参考例9:2-(二甲基氛基)-N_[(18Z)-二十七碳-18-稀_l0-基]乙醜胺(2_ (dimethylamino)-N_[ (18Z)-heptacos-18-en_l0-yl] acetamide)(阳离子性脂质 18)
[0260] [化 48]
[0261]
[0262] HPLC-LC/MS,Rt 7.98min,ESI-MS(M+H)计算值478.5、测量值479.5,1H NMR (400MHz,CDC13)56.83(lH,d),5.36(2H,m),3.88(2H,m),3.74(lH,t),2.93(2H,s),2.28 (2H,m),2.17(2H,s),2.00(3H,m),1.85(lH,m),1.50(3H,m),1.25(37H,m),0.86(6H,dd)
[0263] 参考例10:1-甲基-N-[l_(2-辛基环丙基)十七烷-8-基]吡咯烷-2-甲酰胺(1-methyl_N-[l-(2_octylcyclopropyl)heptadecan_8-yl]pyrrolidine-2_carboxamide)(阳 离子性脂质19)
[0264] [化 49]
[0265]
[0266] HPLC-LC/MS,Rt 8.14min,ESI-MS(M+H)计算值518.5、测量值519.7,1H NMR (400MHz,CDC13)56.99(lH,d),3.85(lH,m),3.07(lH,m),2.85(lH,m),2.35(3H,s),2.33 (2H,m),2.23(lH,m),1.76(4H,m),1.47(4H,m),1.26-1.25(35H,m),1.12(3H,m),0.87(6H, m),0.62(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0267] 参考例11:1-乙基-n-U-U-辛基环丙基)十七烷-8-基]吡咯烷-2-甲酰胺(1-ethyl_N_[l-(2_octylcyclopropyl)heptadecan_8-yl]pyrrolidine-2_carboxamide)(阳 离子性脂质20)
[0268] [化 50]
[0269]
[0270] HPLC-LC/MS,Rt 8.95min,ESI-MS(M+H)计算值532.5、测量值533·6,1Η NMR (400ΜΗζ,αΧ:13)δ7·17(lH,d),3.84(lH,m),3.16(lH,t),3.00(lH,dd),2.64(lH,ddd),2.47 (lH,ddd),2.27(lH,ddd),2.15(lH,ddd),1.76(4H,m),1.47(2H,m),1.26-1.25(37H,m), 1.12(3H,m),1.06(4H,m),0.87(6H,m),0.62(2H,dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0271] 参考例12:1-甲基-n-U-U-辛基环丙基)十七烷-8-基]哌啶-2-甲酰胺(卜 methyl_N-[l-(2_octylcyclopropyl)heptadecan_8-yl]piperidine-2_carboxamide)(阳 离子性脂质21)
[0272] 「化 511
[0273]
[0274] HPLC-LC/MS,Rt 7.43min,ESI-MS(M+H)计算值532.5、测量值533·6,1Η NMR (400MHz,CDC13)S6.28(lH,d),3.88(lH,m),2.89(lH,d),2.42(lH,dd),2.21(3H,s),2.00 (2H,m),1.72(2H,m),1.49(4H,m),1.26-1.25(40H,m),1.12(3H,m),0.87(6H,m),0.62(2H, dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0275] 参考例13:1-乙基4-[1-(2-辛基环丙基)十七烷-8-基]哌啶-2-甲酰胺(1-6让71-N_[ l-(2_octylcyclopropyl)heptadecan-8-yl ]piperidine-2_carboxamide)(阳离子性月旨 质22)
[0276] [化 52]
[0277]
[0278] HPLC-LC/MS,Rt 8.03min,ESI-MS(M+H)计算值546.6、测量值547·6,1Η NMR (400MHz,CDC13)53.88(lH,m),2.89(lH,m),2.85(lH,m),2.48(3H,s),1.89(lH,m),1.76 (2H,m),1.63(2H,m),1.47(2H,m),1.26-1.25(41H,m),1.12(6H,m),0.87(6H,m),0.62(2H, dd),0.55(lH,m),-0.34(lH,dd)
[0279] <组合物的制备(1)>
[0280] 实施例10
[0281] 使用实施例1的阳离子性脂质1而制备组合物。作为核酸,使用如下核酸,该核酸是 包含有义链5 ' -GGAf Uf CAf Uf Cf Uf CAAGf Uf CfUfUAf CT*T-3 '(序列编号^^嫩彳山代二〗'-Fluoro RNA,* =硫代磷酸酯连结子)、反义链5 '-GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCT*T-3 '(序 列编号2,1':0嫩,仰、沈=2'4111(^〇1?熟,* =硫代磷酸酯连结子)的碱基序列且抑制?&(^(^ VII(凝血因子VII)基因的表达的siRNA,而且是经过退火的核酸(基因设计(GeneDesign)股 份有限公司,以下有称为"Factor VIIsiRNA"的情况)。
[0282] 将Factor VII siRNA利用25mM醋酸钠(pH值4.0)溶解为216yg/mL,而制成siRNA稀 释液。另外,将阳离子性脂质1、DSPC(日本精化股份有限公司)、胆固醇(日本精化股份有限 公司)、MPEG2000-DMG(日油股份有限公司)以60/8.5/30/1.5(摩尔比)的比例以总脂质浓度 成为15mM的方式溶解到乙醇中,而制成脂质溶液。将siRNA稀释液和脂质溶液分别以2.4mL/ 分钟、1.29mL/分钟的流速进行混合,进而将25mM醋酸钠(pH值4.0)以9.25mL/分钟的流速进 行混合,由此获得脂质复合物水溶液。将所获得的脂质复合物水溶液供于使用透析膜(商品 名"Float-A-Lyzer G2",美国斯百全(SPECTRUM)公司,50K MWC0)的透析,将外液置换成磷 酸缓冲液(PBS,pH值7.5)。透析后,进行浓缩及过滤灭菌,而获得实施例10的组合物。
[0283] 实施例11
[0284] 作为阳离子性脂质,使用实施例4的阳离子性脂质4代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例10同样地获得实施例11的组合物。
[0285] 实施例12
[0286] 作为阳离子性脂质,使用实施例5的阳离子性脂质5代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例1 〇同样地获得实施例12的组合物。
[0287] 实施例13
[0288] 作为阳离子性脂质,使用实施例6的阳离子性脂质6代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例1 〇同样地获得实施例13的组合物。
[0289] 实施例14
[0290] 作为阳离子性脂质,使用实施例7的阳离子性脂质7代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例1 〇同样地获得实施例14的组合物。
[0291] 实施例15
[0292] 作为阳离子性脂质,使用实施例8的阳离子性脂质8代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例1 〇同样地获得实施例15的组合物。
[0293] <组合物的分析(1)>
[0294] 针对实施例10~15的组合物,测定s iRNA向脂质复合物中的封入率。
[0295] 具体而言,利用无 RNA酶水(RNase Free Water)稀释组合物,使用Quant-iT RiboGreen RNA试剂(美国英杰(Invitrogen)公司)进行测定,将所测得的siRNA浓度(A)设 为脂质复合物外液中所存在的siRNA。
[0296] 另外,将组合物利用l%Triton X-100进行稀释并测定,将所测得的siRNA浓度(B) 设为脂质组合物中的总siRNA浓度。接着,通过下式(F1)算出核酸的封入率。
[0297] 封入率(%) = 1〇〇 -(A/B)X100(F1)
[0298] 另外,利用粒径测定装置(商品名"Zetasizer Nano ZS",英国马尔文(Malvern)公 司制造)测定复合物的平均粒径。
[0299] 表1中表示siRNA的封入率及脂质复合物的平均粒径(Z-平均)。
[0300] [表1]
[0301]
[0302] <组合物的制备(2) >
[0303] 实施例16
[0304] 使用实施例2的阳离子性脂质2而制备组合物。作为核酸,使用和实施例10的组合 物中所使用的核酸相同的Factor VII siRNA。
[0305] 将Factor VII siRNA利用25mM醋酸钠(pH值4.0)溶解为538yg/mL,而制成siRNA稀 释液。另外,将阳离子性脂质2、DSPC(日本精化股份有限公司)、胆固醇(日本精化股份有限 公司)、MPEG2000-DMG(日油股份有限公司)以60/8/30/2(摩尔比)的比例以总脂质浓度成为 30mM的方式溶解到乙醇中,而制成脂质溶液。将siRNA稀释液和脂质溶液分别以2.0mL/分 钟、1.08mL/分钟的流速进行混合,进而将25mM醋酸钠(pH值4.0)以18.45mL/分钟的流速进 行混合,由此获得脂质复合物水溶液。将所获得的脂质复合物水溶液供于使用透析膜(商品 名"Float-A-Lyzer G2",美国斯百全(SPECTRUM)公司,50K MWC0)的透析,将外液置换成磷 酸缓冲液(PBS,pH值7.5)。透析后,进行浓缩及过滤灭菌,而获得实施例16的组合物。
[0306] 实施例17
[0307] 作为阳离子性脂质,使用实施例3的阳离子性脂质3代替阳离子性脂质2,除此以 外,和实施例16同样地获得实施例17的组合物。
[0308] 参考例14
[0309] 作为阳离子性脂质,使用参考例10的阳离子性脂质19代替阳离子性脂质2,除此以 外,和实施例16同样地获得参考例14的组合物。
[0310] 参考例15
[0311] 作为阳离子性脂质,使用参考例12的阳离子性脂质21代替阳离子性脂质2,除此以 外,和实施例16同样地获得实施例15的组合物。
[0312] <组合物的分析(2) >
[0313] 和实施例10的组合物同样地,针对实施例16、17及参考例14、15的组合物,测定 siRNA向脂质复合物中的封入率及平均粒径。
[0314] 表2中表示siRNA的封入率及脂质复合物的平均粒径(Z-平均)。
[0315] [表 2]
[0316]
L〇317j <组合物的制备(3) >
[0318] 实施例18
[0319] 使用实施例1的阳离子性脂质1而制备组合物。作为核酸,使用和实施例10的组合 物中所使用的核酸相同的Factor VII siRNA。
[0320] 将Factor VII siRNA利用25mM醋酸钠(pH值4.0)溶解为400yg/mL,而制成siRNA稀 释液。另外,将阳离子性脂质1、DSPC(日本精化股份有限公司)、胆固醇(日本精化股份有限 公司)、MPEG2000-DMG(日油股份有限公司)以60/8/30/2(摩尔比)的比例以总脂质浓度成为 12mM的方式溶解到乙醇中,而制成脂质溶液。将siRNA稀释液和脂质溶液分别以2.0mL/分 钟、2. OmL/分钟的流速进行混合,进而将25mM醋酸钠(pH值4.0)以12. OmL/分钟的流速进行 混合,由此获得脂质复合物水溶液。将所获得的脂质复合物水溶液供于使用透析膜(商品名 "Float-A-Lyzer G2",美国斯百全(SPECTRUM)公司,50K MWC0)的透析,将外液置换成磷酸 缓冲液(PBS,pH值7.5)。透析后,进行浓缩及过滤灭菌,而获得实施例18的组合物。
[0321] 实施例19
[0322] 作为阳离子性脂质,使用实施例9的阳离子性脂质9代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得实施例19的组合物。
[0323] 参考例16
[0324] 作为阳离子性脂质,使用参考例1的阳离子性脂质10代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例16的组合物。
[0325] 参考例17
[0326] 作为阳离子性脂质,使用参考例2的阳离子性脂质11代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例17的组合物。
[0327] 参考例18
[0328] 作为阳离子性脂质,使用参考例3的阳离子性脂质12代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例18的组合物。
[0329] 参考例19
[0330] 作为阳离子性脂质,使用参考例4的阳离子性脂质13代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例19的组合物。
[0331] 参考例20
[0332] 作为阳离子性脂质,使用参考例5的阳离子性脂质14代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例20的组合物。
[0333] 参考例21
[0334] 作为阳离子性脂质,使用参考例8的阳离子性脂质17代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例21的组合物。
[0335] 参考例22
[0336] 作为阳离子性脂质,使用参考例9的阳离子性脂质18代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例22的组合物。
[0337] 参考例23
[0338] 作为阳离子性脂质,使用参考例11的阳离子性脂质20代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例23的组合物。
[0339] 参考例24
[0340] 作为阳离子性脂质,使用参考例13的阳离子性脂质22代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例18同样地获得参考例24的组合物。
[0341] <组合物的分析(3) >
[0342] 和实施例10的组合物同样地,针对实施例18、19及参考例16~24的组合物,测定 siRNA向脂质复合物中的封入率及平均粒径。
[0343] 表3中表示siRNA的封入率及脂质复合物的平均粒径(Z-平均)。
[0344] [表3]
[0345]
[0346] <组合物的制备(4) >
[0347] 实施例20
[0348] 使用实施例1的阳离子性脂质1而制备组合物。作为核酸,使用和实施例10的组合 物中所使用的核酸相同的Factor VII siRNA。
[0349 ]和实施例18同样地获得实施例20的组合物。
[0350] 比较例1
[0351] 作为阳离子性脂质,依照专利文献2中所记载的方法合成专利文献2中所记载的下 述式(29)所表示的(化学名)(以下,称为ML-5),使用其代替阳离子性脂质1,除此以外,和实 施例20同样地获得比较例1的组合物。
[0352] [化 53]
[0353]
[0354] <组合物的分析(4) >
[0355] 和实施例10的组合物同样地,针对实施例20及比较例1的组合物,测定siRNA向脂 质复合物中的封入率及粒径。另外,将所述组合物在密闭的玻璃小瓶中在4 °C下保管,同样 地测定保管后第1个月、第2个月、第4个月、第6个月、第9个月、及第12个月的siRNA的封入率 及粒径。
[0356] 表4、表5及图1中分别表示实施例20及比较例1的siRNA向脂质复合物中的封入率 及平均粒径(Z-平均)的随时间经过而产生的变化。
[0357] [表 4]
[0358]
[0361] 显示出和比较例1的组合物相比,实施例20的组合物在保管期间粒径的增大更加 得到抑制。
[0362] <组合物的制备(5) >
[0363] 实施例21
[0364] 使用实施例1的阳离子性脂质1而制备组合物。作为核酸,使用和实施例10的组合 物中所使用的核酸相同的Factor VII siRNA。
[0365] 将Factor VII siRNA利用25mM醋酸钠(pH值4.0)溶解为 108yg/mL,而制成siRNA稀 释液。另外,将阳离子性脂质1、DSPC(日本精化股份有限公司)、胆固醇(日本精化股份有限 公司)、MPEG2000-DMG(日油股份有限公司)以60/8/30/2(摩尔比)的比例以总脂质浓度成为 6mM的方式溶解到乙醇中,而制成脂质溶液。将siRNA稀释液和脂质溶液分别以3.36mL/分 钟、1.81mL/分钟的流速进行混合,进而将25mM醋酸钠(pH值4.0)以12.95mL/分钟的流速进 行混合,由此获得脂质复合物水溶液。将所获得的脂质复合物水溶液供于使用透析膜(商品 名"Float-A-Lyzer G2",美国斯百全(SPECTRUM)公司,50K MWC0)的透析,将外液置换成磷 酸缓冲液(PBS,pH值7.5)。透析后,进行浓缩及过滤灭菌,而获得实施例21的组合物。
[0366] 实施例22
[0367] 作为阳离子性脂质,使用实施例2的阳离子性脂质2代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例21同样地获得实施例22的组合物。
[0368] 实施例23
[0369] 作为阳离子性脂质,使用实施例4的阳离子性脂质4代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例21同样地获得实施例23的组合物。
[0370] 实施例24
[0371] 作为阳离子性脂质,使用实施例5的阳离子性脂质5代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例21同样地获得实施例24的组合物。
[0372] 实施例25
[0373] 作为阳离子性脂质,使用实施例8的阳离子性脂质8代替阳离子性脂质1,除此以 外,和实施例21同样地获得实施例25的组合物。
[0374] 比较例2
[0375] 作为阳离子性脂质,使用所述的ML-5代替阳离子性脂质1,除此以外,和实施例21 同样地获得比较例2的组合物。
[0376] <组合物的分析(5) >
[0377] 和实施例10的组合物同样地,针对实施例21~25及比较例2的组合物,测定平均粒 径。另外,将所述组合物在密闭的玻璃小瓶中在4°C下保管,测定2周后的平均粒径。
[0378] 表6及图2中表示组合物的平均粒径(体积平均)的随时间经过而产生的变化。
[0379] [表 6]
[0380]
[0381] 显示出和比较例2的组合物相比,实施例21~25的组合物在保管期间粒径的增大 更加得到抑制。
[0382] <组合物的活性评价(1)>
[0383] 试验例1
[0384] 将实施例10~15的组合物以封入到脂质复合物中的Factor VII siRNA浓度成为 l〇yg/mL的方式利用PBS进行稀释。将各组合物以10mL/kg的投予体积尾静脈内投予C57/BL6 小鼠(5周龄,雄性),从投予起24小时后在麻醉下实施采血及肝脏的采集。通过离心将血浆 从血液分离,利用市售的试剂盒(商品名"BIOPHEN FVII",HYPHEN BioMed公司)对血浆中的 Factor VII蛋白质浓度进行定量。作为阴性对照,对投予了PBS的组群进行相同处理。
[0385] 将roS投予组的Factor VII蛋白质浓度设为100%,以相对值算出组合物投予组的 Factor VII蛋白质浓度。将结果示于表7。
[0386] [表 7]
[0387]
[0388] 显示出实施例10~15的组合物的Factor VII蛋白质的表达抑制效果较高。即,显 示出利用本发明的阳离子性脂质会将核酸高效率地释放到细胞质中。
[0389] <组合物的活性评价(2) >
[0390] 试验例2
[0391] 将实施例16、17及参考例14、15的组合物以封入到脂质复合物中的Factor VII siRNA浓度成为30yg/mL的方式利用roS进行稀释。将各组合物以10mL/kg的投予体积尾静脈 内投予C57/BL6小鼠(5周龄,雄性),从投予起24小时后在麻醉下实施采血及肝脏的采集。利 用离心将血浆从血液分离,利用市售的试剂盒(商品名"BIOPHEN FVII",HYPHEN BioMed公 司)对血浆中的Factor VII蛋白质浓度进行定量。作为阴性对照,对投予了PBS的组群进行 相同处理。
[0392] 将roS投予组的Factor VII蛋白质浓度设为100%,以相对值算出组合物投予组的 Factor VII蛋白质浓度。将结果示于表8。
[0393] [表 8]
[0394]
1234 显示出实施例16、17的组合物的Factor VII蛋白质的表达抑制效果高于参考例 14、15的组合物。即,显示出利用本发明的阳离子性脂质会将核酸高效率地释放到细胞质 中。 2 <组合物的活性评价(3) > 3 试验例3 4 和试验例2同样地对C57/BL6小鼠(5周龄,雄性)投予实施例18、19及参考例16~24 的组合物,算出从投予起24小时后的血浆中的FactorVII蛋白质浓度的相对值及残存在肝 脏中的阳离子性脂质量的相对值。将结果示于表9。
[0399] [表 9]
[0400]
[0401 ] 显不出头施例i8的组贫物的Factor V11宙日质的衣込仰制双朱咼t穸考例ib~ 24的任一组合物。即,显示出利用本发明的阳离子性脂质会将核酸高效率地释放到细胞质 中。
[0402]由以上结果得知,根据本发明,可提供可将核酸高效率地释放到细胞质中的阳离 子性脂质。
[0403]另外,根据本发明,可提供可解决在将脂质复合物保管一定期间时粒径增大这一 物理稳定性课题的阳离子性脂质。
【主权项】
1. 一种阳离子性脂质,其特征在于:它是下述通式(3)所表示的化合物或其药剂学上可 接受的盐,所述通式(3)中,L表示碳数7~12的烷基或碳数7~12的締基,R表示碳数1~2的烷基;m 及m分别独立为1~3的整数。2. 根据权利要求1所述的阳离子性脂质,其特征在于:通式(3)中,m及m分别独立为1~ 2的整数。3. 根据权利要求1或2所述的阳离子性脂质,其特征在于:它是选自W下的化合物(4)~ (11)中的化合物或其药学上可接受的盐,4.根据权利要求1至3中任一项所述的阳离子性脂质,其特征在于:它是下述式(4)所表 示的化合物或其药学上可接受的盐, [化 63] 示表
【文档编号】C12N15/09GK105916839SQ201580003735
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2015年1月7日
【发明人】铃木裕太, 兵头健治, 田中阳平
【申请人】卫材R&D管理有限公司
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