成纤维细胞混合物及其制备和使用方法
【专利摘要】本公开提供了一种非自体产品，所述产品是两种以上同源或异源的分离自不同个体的成纤维细胞的细胞或组织培养物、或来自培养物的提取物、或培养基的混合物。所述细胞或因子被共混在赋予接受者的皮肤所期望的特性的产品中，所述接受者不是所述混合物的来源。本公开还涉及制备和使用和/或培养所述成纤维细胞的方法，所述方法包括对所述混合物的效能进行优化以赋予接受者的皮肤一种或多种所期望的特性。
【专利说明】
成纤维细胞混合物及其制备和使用方法
技术领域
[0001] 本公开涉及两种以上分离自不同个体的同源或异源的成纤维细胞的组织培养物、 或来自所述培养物的提取物、或者培养基的混合物。本公开还涉及应用此类成纤维细胞培 养物、细胞共培养物、来自细胞的提取物、形成所述细胞培养物或培养基的可扩散要素(单 独或与环境条件配合)使细胞生长并诱导其产生其因子或要素（由所述细胞产生或提取自 所述细胞)的阵列。本公开还涉及将上述细胞或因子共混在产品中，所述产品对接受者的皮 肤赋予所期望的的特性，所述接受者不是所述混合物或任何个体成纤维细胞的来源，即，非 自体(non-autologous)。本公开还涉及制备和使用和/或培养所述成纤维细胞及其混合物 的方法，包括优化混合物中的所述细胞或因子的潜能或效能以对接受者的皮肤赋予所期望 的特性的方法。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞的主要功能之一是通过连续分泌胞外基质的前体来维持结缔组织的 结构完整性。成纤维细胞分泌胞外基质的所有成分的前体，主要是基质和各种纤维或结构 蛋白。成纤维细胞也分泌小分子量可扩散因子，小分子量可扩散因子影响并协调相邻细胞 的功能和产物从而增强组织响应。胞外基质的组成极大地决定了结缔组织的物理性质。
[0003] 本领域已知有利用自体成纤维细胞（即，获取成纤维细胞的供体也是经过培养的 所述成纤维细胞的接受者)的方法。在这类成纤维细胞的已知应用中，存在通过施用经培养 的成纤维细胞来促进伤口（例如，表皮伤口或痿管）愈合的方法;通过增大与声带缺陷相邻 的组织进行的校正手术方法;和治疗声襞瘢痕以及修复皮肤和软组织缺陷的方法。
[0004] 本领域还已知有由为了个体而培养的自体成纤维细胞所组成的剂量单元，该个体 同时也是供体。此外，存在生长成纤维细胞用于自体应用的方法。
[0005] 从两种以上分离自不同个体的同源或异源的成纤维细胞的组织培养物或者来自 培养物的提取物或培养基的混合物获得商用非自体产品。
【发明内容】
[0006] 本公开提供了非自体产品。
[0007] 本公开还提供了这样的非自体产品：其为两种以上来自相同性别的的成纤维细胞 培养物、由其获得的提取物和/或从培养基回收的可扩散要素形成的同源和异源混合物。
[0008] 本公开还提出，来自相同性别的同源和/或异源的成纤维细胞培养物或其提取物 的每种混合物可以具有基于通过所述混合物所希望获得的特性的"加权"因子。
[0009] 本公开还提出，可以影响成纤维细胞培养物或其提取物或形成细胞培养物的可扩 散要素，以便在产物或所得产品中产生变化。
[0010]另外，本公开提出，对于每种产品可以存在至少三种因子，其中一种或多种因子具 有更高的权重。
[0011]本公开还提出，所述因子包括但不限于:年龄、DNA测试、种族同质性、健康状况、外 观美丽度(符合由黄金比例(有时称之为斐波拉契数列)所描述的经典美），以便在产物或不 同的所得产品中产生或创建变化。所述不同的所得产品可以用于提高、调节或处理本公开 组合物的使用者的一种或多种所期望的特性。
[0012] 本公开还提供了使用来自相同性别的成纤维细胞或其提取物或形成细胞培养物 的可扩散要素的异源和/或同源的混合物来提供非自体产品的方法。
[0013] 另外，本公开提供了制备（即，培养)混合物的方法，其包括增强所述混合物的有益 效果或调节所述混合物的效果的方面。
【附图说明】
[0014] 图1至4是展示整体表达谱的差异的测试结果的图。
【具体实施方式】
[0015] 如上所述，本公开提供了两种以上分离自相同性别的不同个体的同源或异源的成 纤维细胞的组织培养物、细胞共培养物、来自细胞或培养物的提取物、形成细胞培养物的可 扩散要素或者培养基的混合物。成纤维细胞培养物、细胞的共培养物、来自细胞或培养物的 提取物、形成细胞培养物的可扩散要素或培养基单独或与环境条件配合使用，从而使生长 细胞并诱导所述细胞产生其要素（由所述细胞产生或提取自所述细胞)阵列。这些细胞、培 养物、细胞的共培养物、形成所述细胞培养物的可扩散要素和培养基和/或因子被共混到为 接受者的皮肤赋予所期望的特性的产品中。重要的是，因为接受者不是混合物或任何个体 成纤维细胞的来源，因此接受者与成纤维细胞之间的关系被称之为"非自体"。由于产品旨 在用于特定性别，即女性或男性，因而每种产品中的细胞、共培养物、培养物、形成所述细胞 培养物的可扩散要素和培养基和/或要素源自所期望的的性别。
[0016] 由如上所述的细胞、培养物、培养基和/或要素产生或可从其提取的这些要素被共 混起来并包含在产品中。所述要素包括但不限于：包括表皮生长因子在内的生长因子、蛋 白、肽、细胞因子和存在于细胞或培养基中的所有其它生物分子。
[0017] 根据本公开，产品优选为局部组合物。优选的局部组合物是乳霜、精华液（serum) 或乳液。所述组合物可以包含递送载剂，例如脂质体和胶束。所述组合物还可以包含转运分 子，例如促进或提供分子雪橇运输(molecular sledding)的蛋白或大分子。使用这类分子 使得能够将所述要素递送至接受者的表皮或真皮。然而，所述组合物可以是胃肠外（例如， 可注射或静脉内等)组合物、通过装置(例如，激光器、微针头或吸入器等)递送或者口腔牙 周组合物(包括漱口水）。
[0018] 还可以对组织培养成纤维细胞或者成纤维细胞或培养物或者来自培养物的提取 物、形成细胞培养物的可扩散要素或者培养基施以影响，以便在由细胞或培养基产生或可 从其提取的要素的阵列、要素的量和类型方面由于暴露于不同的化学物质、培养物、或培养 物生长培养基的环境要素而产生变化。例如，氧水平(缺氧、高氧或正常的氧水平）、Α0Χ、ρΗ、 温度、和细胞在不同水平的紫外光和1^^、1^8、1^(：、11?和可见光的不同混合光下的暴露可能 作用于或影响成纤维细胞培养物或来自其的提取物。此外，环境条件可能影响培养的成纤 维细胞或成纤维细胞培养物、或来自培养物的提取物、或培养基、或要素。这类环境条件包 括但不限于P02、C0(高氧或缺氧条件）、对不同的紫外谱带或其它形式能量的暴露以及温度 等。
[0019] 如本文所用，术语"同源"是指使用的成纤维细胞培养物获自下述供体，所述供体 构成的族群的血统80%以上、优选90%以上、更优选95%以上和最优选基本100%为单一民 族或种族。因此，成纤维细胞培养物获自同源供体组(相同性别），例如以下的族群：日本女 性、西非女性或印度女性。由于数世纪之久的民族融合，术语"同源"通常不适用选自例如美 国或加勒比群岛的那些族群。
[0020] 如本文所用，术语"异源"是指使用非种族同质性的成纤维细胞，例如获自相同性 别但为不同族群或来源的组合的成纤维细胞，例如以下的族群:西非女性和日本女性、或西 非女性和印度女性、或日本女性和西欧女性。
[0021] 可以对本公开的同源和/或异源的成纤维细胞组织培养物的混合物进行"定制 (tailoring)"以便使包括的一个种族族群多于另一种种族族群。此外，"定制"可以包括考 虑基于期望从所述混合物获得的特性而对因子进行"加权"。所述因子包括但不限于:年龄、 DNA测试、种族同质性、健康状况、外观美丽度(符合由黄金比例(有时称之为斐波拉契数列） 所描述的经典美态），以便在产物或不同的所得产品中产生或创建变化。这些不同的所得产 品可以用于提高本公开的组合物的使用者的一种或多种所期望的特性。
[0022] 例如，成纤维细胞的组织培养物的混合物可以包括50%的来自西非女性的成纤维 细胞、30%的来自日本女性的成纤维细胞和20%的来自印度女性的成纤维细胞。每种百分 比可以获自单个女性或构成同源混合组(对术语同源的定义如上所述）的女性组，例如，来 自西非国家马里的多位女性。就需要改善或赋予接受者皮肤的特定色素或其它特性对于混 合物的成纤维细胞的选择和因子的权重进行预测。因此应该理解，根据本公开的一个实施 方式，组合物提供了选出一个或多个种族族群的供体和可能的"加权"混合物，以获得传递 至少一种性质(优选对皮肤)的所得产品。所述一种性质可以为例如增强的皮肤紧致性或光 滑度、或者皮肤更加饱满。而且，所述一种性质可以在几乎任何使用本公开该实施方式的组 合物的人(任何种族背景）中得以改善。
[0023] 要赋予接受者的皮肤的特定特性包括但不限于:肤色、皮肤弹性、皮肤光滑性、瘢 痕减少、皱纹减少、对炎性刺激的反应、水分保持能力、产生新的血管和输送养分的倾向以 及皮肤厚度或密度、对外伤或自由基伤害的反应的改善、或者本领域技术人员基于本公开 显而易见的皮肤特性的组合。由于可以"定制"同源和/或异源成纤维细胞培养物的混合物 来提供特定的期望的皮肤特性或皮肤特性的组合，本公开提供了为接受者的皮肤赋予特性 的无限可能性。因此，"定制"可以包括更大百分比的来自一个同源或异源的女性组的女性 的成纤维细胞培养物，因为已知或据信该女性或该组可提供所期望的特性。
[0024] 据信皮肤起皱纹是较浅色皮肤类型的问题。此外，斑驳的色素过度沉着和肤色不 均与较深色皮肤类型相关。此外，亚裔血统具有抵抗光老化的防护机制。因此，在决定包括 基于产品中所期望的皮肤特性或皮肤特性组合的权重的定制时可以考虑到上述因素。如下 文的测试数据所示，在相对于一组(或单培养物），"共培养物"中HAS1的增加显示出改善的 抗皱、和光损害的避免或最小化。这强调了制造其中可以实现对组合物的定制或个人化的 本公开组合物的能力。本公开中的测试数据证明了细胞或共培养物的任意组合，并支持认 为来自细胞或培养物的提取物、形成细胞培养物的可扩散要素、培养基或外部因子的任意 组合能够对组合物增加对HAS1 (透明质酸)生产的Collal刺激和/或MMP1抑制以生产抗老化 产品。
[0025] 在优选实施方式中，据信"加权"的混合物在各因子间存在等级之分。优选地，对于 种族同质性而言，考虑（1)健康状况、（2)年龄和(3)美丽度因子的优先级顺序。
[0026] 关于健康状况因子，重要的是考虑排除患有遗传疾病的供体。此外，应从供体"库" 中排除由于环境条件所致的过早老化，例如，自由基生成，即日晒和较高的赘生物以及因吸 烟所致的过早老化。
[0027] 对于年龄因素，供体"库"、尤其是女性，获取成纤维细胞的供体的年龄优选年纪较 轻，因其皮肤和成纤维细胞正处在生命的最佳阶段。所述年龄的范围基于种族可能有所不 同。据信，优选的年龄范围是18至35周岁，更优选18至30周岁。然而，可设想年龄范围可以具 有更低下限，达成熟个体的年龄，这在美国为青少年，即约12周岁。
[0028] 对于美丽度因子，符合由黄金比例(有时称为斐波拉契数列)所描述的经典美具备 许多希望的特征。这些希望的特征包括但不限于面部关键特征或要素(包括但不限于嘴、目艮 和眉弓）的角度和间距之间的几何学关系。对于这类特征的选择将包括在最终产品的"定 制"中。因此，可以将产品为预期的接受者定制。
[0029] 如上文所讨论，还认为本公开可以用于其它目的。例如，本发明的组合物可以用于 使伤口愈合或减轻瘢痕。因此，可设想不仅表皮层而且内表皮、真皮和SQ都能受到本公开的 组合物和方法的影响。
[0030] 本公开还提供了制备（即，培养)成纤维细胞混合物以及对所述培养进行优化的方 法。众所周知，成纤维细胞培养物要耗费相当的时间才能生长至足够数量，并且通常需要对 成纤维细胞在培养基中传代多次以获得满意的产率。此外，制备成纤维细胞的方法可以通 过例如外部和/或环境诱导等过程而改造。此外，成纤维细胞可以经遗传修饰。再者，可以从 皮肤或非皮肤来源(例如，脐带间充质干细胞)转化成成纤维细胞。根据本公开，成纤维细胞 培养物可以根据本领域已知方法获自如哺乳动物等动物。优选地，成纤维细胞培养物通过 从相同类型的组织分离成纤维细胞而获得，所述组织是本公开的应用方法的目标。包括培 养基和培养技术(例如，传代和选择）的培养成纤维细胞的方法也是本领域已知的。通常的 培养基包括牛血清白蛋白或不存在FBS的胎牛血清。然而，成纤维细胞可以在供体的血清混 合物中培养。优选地，选择生成胶原的成纤维细胞。
[0031 ]本公开设想，根据所述制备方法获得的成纤维细胞培养物混合物的效能可以针对 改善的效力进行有益地修饰或进行优化。例如，效能的改善或要素的改变可以通过修改进 行培养和成纤维细胞生长的氧水平而实现。可以通过调节培养成纤维细胞的氧水平来调节 同源和/或异源的成纤维细胞培养物混合物的效能。
[0032] 根据本公开，与制备"定制"、"加权"的同源和/或异源成纤维细胞培养物的混合物 的能力结合时，通过调节生长成纤维细胞培养物的混合物的可选水平来调节所得成纤维细 胞培养混合物的效能的能力提供了更为广阔的选择，包括治疗选择。
[0033] 如本文所讨论，在优选的实施方式中，所针对的是女性。然而，本公开也可用于男 性。因此，相同的原理和教导(如上文所讨论)可以适用于男性。
[0034]将低传代的来自非裔美国人[非裔美国人组]和亚裔[亚裔/韩裔组]背景的人类女 性的人皮肤成纤维细胞接种至6孔皿。在单一培养物中并以非裔美国人与亚裔/韩裔为50: 50组合比例接种两组。进行细胞培养，直至在细胞达到汇合(紧密堆积的单层）后约二十四 (24)小时。在汇合后24小时，将细胞裂解并使用苯酚：氯仿提取法提取RNA(Trizol Reagent)。然后对RNA定量并评估RNA浓度。利用SABiosciences RT2Easy First Strand试 剂盒将所述RNA转化为cDNA。根据试剂盒说明，将cDNA与SYBR绿检测试剂混合并添加至其它 的SABiosciences RT2ECM and Adhesion分子阵列的孔内。将所述阵列加载至Bio-Rad iCycler内进行阵列分析和数据采集。利用专门针对所述阵列设计的基于网络的软件进行 分析。
[0035]由所述基于网络的软件对每个参数一个实验复制样品的结果针对对照细胞和暴 露细胞之间的倍数调制变化以及统计显著性/P值测定进行评估。然后对调节异常(具有或 不具有统计显著性)检验阵列上的基因，从而确定阵列的哪些区域具有最多的调节异常且 最可能是受到影响的过程。由于对于每个样品仅运行一个阵列，无法生成P值且下文所列的 值仅针对生物学显著性进行分析(相对于对照，基因表达值增加或减少超过2倍）。所有的基 因值相对于对照基因列表(Control Gene List)中的HPRTl、B2M、GAroH和RPLP0进行标准 化。将亚裔/韩裔细胞组设定为对照样品，因此以下比较是相对于亚裔/韩裔表达水平的基 因调节异常，如下文基因表达值总结表中所示。
[0038]
[0039] 这些测试所显示出的是可以获得混合不同组或种族群的成纤维细胞或细胞或者 共培养的能力。这可以在细胞阶段完成，而不是仅在培养基阶段。此外，通过检验总体表达 谱(将阵列上所测试的每种基因的表达值作图为线图），观察到非裔美国人细胞 v.s.非裔美 国人细胞与亚裔/韩裔细胞(下文称为50:50比例的"共培养物(CoCulture)"）的表达谱的显 著差异。在以亚裔/韩裔组作为对照并因此充当基线(或图上的〇线），图1一4所示的图清楚 地展示出总体表达谱的差异。与仅比较非裔美国人组细胞与亚裔组细胞相比，共培养物显 示出更大幅度的变化。在某些情况下，共培养物展示出相对非裔美国人细胞反方向的调节 异常（当共培养物上调时，非裔美国人细胞下调）。
[0040]
[UU41 j 开培乔物?不出对功酡組的.凶里为刺微丨生的双奴（蛍日的生成増加），时非倚美 国人单培养物则展示出更为抑制性(蛋白的生成减少)的效应。共培养物还展示出在参与所 列出的功能组的大部分的基因中更高的活性。仅基底膜成分以及胶原蛋白&ECM结构成分途 径展示出相同水平的调节异常(但它们仍展示出在共培养的细胞中更强的刺激性效应）。
[0042] 测试的结果说明了以下内容。能够对两种以上供体或不同种族群的成纤维细胞进 行混合。此外，测试支持了非裔美国人细胞与共培养物(50:50的非裔美国人和亚裔/韩裔） 中的那些细胞相比在表达谱上的显著差异。即，共培养物提供了 ：（1)对蛋白生成的更大的 刺激性效果，（2)在涉及跨膜分子、粘附分子(细胞一细胞;细胞一基质等等）、ECM蛋白酶和 抑制剂的途径中更大的程度；（3)不同的基因表达，（4)HAS1(透明质酸合成酶)的显著增加， (5)C0L7A1的增加(根据科学文献，C0L7A1的损失有助于皱纹形成）；和(6)更大量的MMP参 与。
[0043] 因此，显然出人意料地发现了即使在细胞水平也能够实现本公开所设想的定制 和/或个人化的共混。
[0044] 应该理解，本公开是局部组合物。优选地，所述局部组合物是涂敷于接受者的乳 霜。乳霜或乳霜产品具有载剂。所述载剂使得能够涂敷在接受者的皮肤上而不会妨碍成纤 维细胞混合物的效果。据信载剂的大部分百分比是水。此外还设想，整个局部组合物或乳霜 中的成纤维细胞混合物的量小于百分之5(%)，且优选小于1%。据认为，小于1%将在局部 组合物中产生最佳的结果。
【主权项】
1. 一种非自体的局部产品，基于要对接受者的皮肤赋予的一种或多种所期望的产品特 性，该产品包含两种以上分离自不同个体的同源或异源的成纤维细胞组织培养物或来自培 养物的提取物或培养基的混合物。2. -种非自体的局部产品，其单独利用或与环境条件配合利用成纤维细胞培养物、来 自细胞的提取物、或培养基来使细胞生长并诱导其产生其要素阵列，所述要素阵列由所述 细胞产生或从所述细胞提取，并且所述细胞或因子被共混在对接受者的皮肤赋予一种或多 种所期望的特性的产品中。3. 权利要求2所述的产品，其中，所述混合物经定制能够包含两个以上的种族群。4. 权利要求3所述的产品，其中，在所述两个以上的种族群中，来自一个种族群的供体 的百分比大于来自另外的一个或多个种族群的供体的百分比。5. 权利要求3所述的产品，其中，经定制的混合物包含对基于需要通过所述混合物获得 的特性进行加权的因子的考量。6. 权利要求5所述的产品，其中，所述加权的因子包括一个因子。7. 权利要求5所述的产品，其中，所述一个因子是多个因子。8. 权利要求6所述的产品，其中，所述多个因子包括每个供体的年龄、种族同质性、健康 状况和外在美丽度。9. 权利要求8所述的产品，其中，所述年龄因子包括仅处于12至35周岁的供体。10. 权利要求8所述的产品，其中，所述年龄因子包括仅处于18至30周岁的供体。11. 权利要求8所述的产品，其中，所述健康状况因子包括排除患有遗传疾病和因环境 条件导致过早老化的供体。12. 权利要求11所述的产品，其中，所述环境条件包括自由基生成。13. 权利要求12所述的产品，其中，所述自由基生成包括日晒、吸烟和较高的赘生物。14. 权利要求8所述的产品，其中，所述美丽度因子包括符合黄金比例。15. 权利要求2所述的产品，其中，所述局部产品选自由乳霜、精华液和乳液组成的组。16. 权利要求2所述的产品，其中，所述所期望的特性选自由以下特性组成的组:肤色、 皮肤弹性、皮肤光滑性、瘢痕减少、皱纹减少、对炎性刺激的反应、水分保持能力、产生新的 血管、输送养分的倾向、皮肤厚度或密度、及其任意组合。17. 权利要求16所述的产品，其中，所述所期望的特性决定所述产品的定制和加权。18. 权利要求1所述的产品，其中，所述产品用于优化混合物对接受者的皮肤赋予所期 望的特性的潜能或效能。19. 一种制备非自体局部产品的方法，基于要对接受者的皮肤赋予的一种或多种所期 望的产品特性，由两种以上分离自不同个体的同源或异源的成纤维细胞组织培养物或来自 培养物的提取物或培养基制备所述非自体局部产品。20. 权利要求19所述的方法，其中，能够对所述产品进行定制以包含两个以上的种族 群，其中一个种族群的供体的百分比大于另外的一个或多个种族群的供体的百分比。
【文档编号】C12N5/0775GK105916979SQ201480062569
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年11月14日
【发明人】J·沙克奈, M·S·沃兹曼, D·H·麦克丹尼尔
【申请人】德玛奇实验室公司