稀少微生物核酸的检测的制作方法

稀少微生物核酸的检测的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种方法，其用于在体外检测生物样本中存在的来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸，所述方法包含核酸样本的制备，所述制备包含使用双链特异性核酸酶进行处理，相对减少占主导的双链DNA分子的量，并且增加稀少核酸分子的比例。本发明还涉及双链特异性核酸酶用于制备包含核酸分子的样本的用途，以及用于表征生物产品的用途。
【专利说明】
稀少微生物核酸的检测
技术领域
[0001] 本发明涉及一种方法，其用于在体外检测生物样本中的来自微生物或病毒的至少 一种稀少核酸分子，其中所述方法包括使用双链特异性核酸酶处理所述生物样本的核酸分 子的步骤。本发明还涉及一种用于表征生物产品的方法，以及涉及一种用于评估用于生物 产品的制备的制造过程的方法，所述方法包括使用双链特异性核酸酶处理核酸分子的步 骤。
[0002] 本发明还涉及双链特异性核酸酶用于体外检测生物样本中的微生物或病毒的稀 少核酸分子的用途，用于表征生物产品和/或用于评估生物产品的制备的制造过程的用途。 本发明还涉及一种用于检测来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸的试剂盒。
【背景技术】
[0003] 分子方法在诊断实验室中成为主要工具，其使用实时PCR或qPCR作为扩增或检测 方法。作为用于诊断的强有力的工具，如果分子生物学方法取代用于常规诊断的传统方法 (例如用于病毒学的细胞培养和用于细菌的培养介质），则出现问题。在病毒学领域，qPCR已 被用于检测和分析不能在细胞培养中生长的病毒，例如但不限于:HCV、HBV和B19。该方法提 高了检测的灵敏度和速度。尽管qPCR的设计受高度保守的区域的扩增的影响，在检测属 (genus)中的所有基因组或新突变的基因组中，该技术存在一些限制。例如，在检测人类免 疫缺陷病毒1型（HIV-1)株中，一组9重qPCR是必需的（Gardner等人，2003)。此外，在多重 qPCR中不同的扩增序列的检测被限制在4种或5种靶标。因此，当需要详尽的对照 (exhaustive control)时，需要大量样本以进行全部qPCR试验。
[0004]高通量测序（High Throughput Sequencing，HTS)，也称为新一代测序（Next-Generation Sequencing ，NGS) 已经被广泛用于全基 因组测序和宏基因组 (metagenomic) 研 究。在微生物学领域，其已经被应用于在宿主或种群中的基因组变异的鉴定，但该方法主要 的应用是其已经成功用于检测和发现新病原体。NGS的优势和主要优点是其能够检测微生 物的全谱(full spectrum)(Barzon等人，2011)，不需要"先验(a priori)"试验。其他优点 是如果在可用的数据库(例如Genbank)中存在检测到的序列，则NGS直接鉴定出病原体。
[0005] 其他基于测序的方法被成功地应用于新病原体的检测，包括消减法(subtractive methods)、抗核酸酶保护片段的测序，但是这些方法用于高通量分析是费力的，且不够灵 敏。
[0006] 为了实现更广泛的病毒检测，开发了例如微阵列方法和电喷雾电离质谱（PCR/ ESI-MS)的新方法，所述新方法依赖于从病毒基因组的广泛保守区域的PCR扩增获得的碱基 组成标签。尽管这些方法被设计用于病毒家族中新病毒的高度广泛的检测和发现，但由于 序列特异性，预期其不允许全病原体的检测。
[0007] 在NGS试验中，灵敏度受核酸分子量的影响。如NGS测序样本中的所有核酸分子，递 增的灵敏度依赖于递减的非感兴趣的序列的水平，在微生物学诊断的情况中，非感兴趣的 序列是来自宿主的核酸分子。为了检测生物样本中最低水平的污染物(contaminant)，需要 生成序列的最大可能拷贝数或"读取(reads)"。然而在一些情况中，所述最大数对检测污染 物是不足的。
[0008] 近期，为改进NGS试验的灵敏度以及克服占主导的核酸的高水平取得了进展。一些 文献描述了使用核酸酶处理样本，水解存在于样本中的游离核酸，然而保护病毒核酸。然而 核酸酶对紧密连接蛋白的核酸分子的不可及性(11011-&(^688；[13；[1；^7)，使得该水解步骤不 充分。
[0009] 为减少样本中rRNA的量，使用经改进的VIDISCA方法(基于CDNA-AFLP(扩增片段长 度多态性）的病毒发现）（Vries等人，2010)。同样，Cheval等人(2011)描述了在以接近L0D的 浓度(检测限）掺入了不同病毒的MRC5上清液中，使用Phi 29的滚环扩增(RCA)的使用。如 Cheval等人公开的，Phi29扩增提高了HTS样本的灵敏度，且检测到以3x L0D掺入的9种病毒 中的7种，以及以0.8x L0D掺入的9种病毒中的4种。然而比较试验证实qPCR的灵敏度最高。 [0010]因此，仍有需要改进稀少核酸检测方法的灵敏度。

【发明内容】

[0011]这是本发明的目的。
[0012] 本发明涉及一种基于在包含核酸的样本中减少占主导核酸分子的方法，其由于在 扩增前水平使用双链特异性核酸酶(DSN)，该方法可充当一种归一化方法，用以在体外制备 包含核酸分子的样本中提高稀少核酸，其中所述样本在任何扩增步骤前使用双链特异性核 酸酶处理。
[0013] 近期出版物描述了仅在扩增后水平的DSN处理，其为了在文库制备期间对核酸分 子群进行归一化，并且已显示减少了基因组覆盖中的变异(Rodrigue等人，2009)。应注意， 与本发明相反，根据Rodriuqgue等人的方法的目的和所述方法解决的问题是尽可能避免测 序稀少污染物核酸。
[0014] 在根据本发明的方法中，使用双链特异性核酸酶处理相对地减少占主导双链DNA 分子的量，并且提高了样本中稀少核酸分子的比例。
[0015] 根据本发明的方法，其允许在DNA文库生成中降低偏倚，且允许达到与qPCR相似或 优于qPCR的灵敏度，qPCR是迄今最灵敏的试验。根据本发明的方法具有以下优点：
[0016] -无"先验"试验，不需要用于检测的序列特异性引物，
[0017] -允许鉴定病原体，
[0018] -与qPCR同样灵敏。
[0019] 本发明涉及用于以高灵敏度检测生物样本(例如细胞上清液）中的微生物或病毒 剂的方法，所述方法包含使用双链特异性核酸酶处理核酸分子的步骤。该方法被设计用于 检测任何微生物或病毒，包膜的或裸的、单链的或双链的DNA或RNA。本发明的方法提供了一 种基本方案，该方案能被应用于以高灵敏度检测来自任何微生物或者病毒剂的稀少核酸分 子。
[0020] 根据文中给出的详细描述，以及所附附图，本发明将被更全面地理解，详细描述以 及所附附图仅以示例的方式给出，且不限制本发明的范围。
[0021] 首先，本发明涉及一种方法，其用于在体外检测生物样本中存在的来自微生物或 病毒的至少一种稀少核酸，所述方法包含步骤：
[0022] a)提取生物样本中的核酸分子，其中所述核酸分子包括双链核酸分子、单链核酸 分子或者其组合，
[0023] b)诱导步骤a)的双链核酸分子的变性和复性，
[0024] c)步骤b)的产物与双链特异性核酸酶(DSN)接触，
[0025] d)从步骤c)的产物中灭活和/或提取所述DSN，并浓缩核酸分子，
[0026] e)扩增步骤d)的产物的核酸分子，
[0027] f)制备来自步骤e)的产物的DNA文库，
[0028] g)确定步骤f)的DNA文库的分子的核酸序列，并从所述核酸序列检测来自微生物 或病毒的至少一种稀少核酸的存在。
[0029] 术语"生物样本"指任何容许包含或包含任何生物材料的样本或提取物。更优选 地，根据本发明的方法中的生物样本包含核酸分子，以及甚至更优选地，根据本发明的方法 中的生物样本包含核酸分子和细胞。
[0030] 在具体的实施方案中，本发明涉及一种方法，用以在体外检测生物样本中的来自 微生物或病毒的至少一种稀少核酸，其中所述生物样本制备自选自以下的材料:人生物流 体或组织、动物生物流体或组织、人或动物生物流体或组织的培养物，真核细胞培养物、原 核细胞培养物、真核细胞和原核细胞培养物。通过使用如生物样本的提取或纯化的方法，以 生物材料制备生物样本，用以适应根据本发明的方法的进行。
[0031 ] "生物流体"指一种被这样定义的流体，即源自机体的液体以及可能地排泄或分泌 的液体。在根据本发明的方法中，所述机体流体或组织选自：血浆、血清、全血、全血提取物、 尿、粪便、汗、淋巴、羊水、胆汁、乳汁、唾液、痰、眼泪、精液、阴道分泌物、房水、玻璃状液和脑 脊液。
[0032] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种方法，用于在体外检测生物样本中的 来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸，其中所述生物样本是生物治疗产品，优选地选自： 重组蛋白、单克隆抗体、疫苗、细胞治疗产品、基因治疗产品、人或动物起源的产品，例如衍 生自血液的产品、肝素、透明质酸和胶原。
[0033] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种方法，用于在体外检测生物样本中 来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸，其中人或动物生物流体或组织培养物包含来自细 胞培养物的细胞，其中所述细胞培养物包含真核细胞、原核细胞或其组合。真核细胞包括 人、动物、植物、真菌和单细胞真核生物例如酵母。原核细胞包括细菌和古细菌。在一个更具 体的实施方案中，根据本发明，用于在体外检测生物样本中来自微生物或病毒的至少一种 稀少核酸的方法中，生物样本选自：来自被病毒感染的细胞培养物的细胞、来自杂交瘤产生 的细胞例如用于生产单克隆抗体的小鼠/人杂交瘤、以及容许被用于生产重组蛋白的细胞。 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种方法，用于在体外检测生物样本中的来自微 生物或病毒的至少一种稀少核酸，其中所述生物样本是来自细胞库的样本，优选地选自：主 细胞库、工作细胞库和生产细胞库。
[0034] "核酸"指包含天然的或人工的核苷酸的聚合物分子，并且优选是脱氧核糖核酸 (DNA)和/或核糖核酸(RNA)。根据本发明的方法，"稀少核酸分子"是这样一种分子，即相对 于包含在所述生物样本中的核酸分子的总量，该核酸分子的碱基的浓度以有限的比例和频 率存在于样本中。在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种方法，用于检测生物样本中至 少一种稀少核酸分子，其中，相对于核酸分子的总量，所述至少一种稀少核酸分子以包括在 约1/104至约1/109、优选约1/105至约1/108、更优选约1/10 6至约1/107之内的比例存在，其中 "约"指+/-10%。在根据本发明的方法的具体的实施方案中，"稀少核酸分子"是微生物的或 者病毒的核酸分子，其定义为所述微生物或病毒的检测限(LOD)的函数。
[0035] "微生物"指选自真核生物和原核生物的微生物剂或微观的生物体。
[0036] 根据本发明，用于在体外检测生物样本中存在的来自微生物或病毒的至少一种稀 少核酸的方法，来自生物样本的核酸分子的提取可以通过被描述用于分离核酸分子的任何 方法进行，例如Maniatis T等人（1999版）中描述的方法，这在操作核酸分子和包含所述核 酸分子的生物产品的领域中是技术人员所熟知的。
[0037] 优选地，核酸的提取通过提取过程的选择来进行，所述的提取过程即使在不存在 载体分子(例如RNA载体)时仍是高效的。作为产生合适的回收的试剂盒的非限制性的示例， 可以使用Silica-adembeads(Ademtech)和NucleoSpin RNA病毒（Macherey Nagel)。优选 地，在不存在任何定义为RNA载体的分子中进行核酸分子提取，所述RNA载体在一些方法中 用于纯化和浓缩核酸。确实，RNA载体可在其它的步骤中充当模型(matrix)，并且在其它的 HTS中成为主要的污染物序列。
[0038] "核酸变性"指这样一种步骤，即其中核酸互补链离解，或单核酸链中的核酸互补 结构离解。双链核酸分子和双链核酸结构通过互补核苷酸间的氢键的非共价结合形成，核 酸变性通过所述氢键断裂发生。链的核苷酸组成可影响变性-复性的条件，因为6和(：碱基可 通过3个氢键连接，且A和T碱基可通过2个氢键连接。与包含较低比例的G和C碱基的链相比， 含有高比例的6和(：碱基的链更不易被变性。核酸变性是可逆的。本领域技术人员很容易确 定用于诱导变性和复性的条件。在根据本发明的方法中，诱导双链核酸分子的变性可以通 过任何能够使氢键不稳定的任何物理或化学剂处理核酸的方法来实现，例如提高温度、PH、 溶剂、高离子浓度和碱性(alcalinic)剂。酶剂同样能够诱导所述氢键断裂及变性。可用的 剂的示例是离液成分(chaotropic element) 〇
[0039] 核酸变性是可逆的，当通过提高温度诱导变性，温度冷却的步骤允许复性，其中互 补链以氢键的形成重组。当通过应用具体的条件或添加具体的剂诱导变性时，导致从所述 剂提取核酸的任何方法可允许所述核酸的复性。
[0040] 在一个具体的实施方案中，根据本发明用于在体外检测来自微生物或病毒的稀少 核酸的方法，其包含诱导核酸分子变性的步骤，其中核酸样本被置于这样一种温度，即包含 在约85°C至约105°C、优选约90°C至约100°C之内的、以及优选约95°C。术语"约"指多或少 10%的可能变化。通过加热样本诱导双链变性之后，复性的步骤包含逐渐返回至初始温度， 以允许在退火步骤中互补双链核酸的再结合。本领域技术人员熟知这些方法。在一个具体 的实施方案中，根据本发明用于在体外检测来自微生物或病毒的稀少核酸的方法包括诱导 核酸分子复性的步骤，其中核酸被置于约70°C的温度持续复性所需的时间，优选持续至少4 小时。核酸的变性和复性可在热循环仪中进行，且通过在260nm的紫外光谱很容易被监测。
[0041] 在用于检测来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸的方法的具体的实施方案中， 诱导双链核酸分子的变性通过本领域技术人员任何已知的方法实现，以诱导所述变性，优 选通过使所述核酸样本温度提高。
[0042] 在一个更具体的实施方案中，根据本发明的用于在体外检测来自微生物或病毒的 稀少核酸的方法，其包含诱导双链核酸分子变性的步骤，其中核酸被置于约95°C的温度，随 后诱导双链核酸分子复性的步骤，其中核酸分子被置于约70°C的温度持续至少4小时。 [0043]对于被置于约70°C持续4小时的核酸分子，约70°C的温度确保复性以十分特异性 的方式发生，且限制错误配对。
[0044] "双链特异性核酸酶（duplex specific nuclease)"或"双链特异性核酸酶 (double strand specific nuclease)"是这样一种酶，其特异性地切割双链或配对DNA分 子、或在DNA分子中的双链或配对DNA结构，以及切割由配对的DNA和RNA分子组成的配对核 酸分子。
[0045] 使用双链特异性核酸酶处理导致在双链DNA中和在DNA-RNA的杂交双链中的DNA分 子的特异性切割，且不显著地切割单链DNA。作为一个具体的示例，可以引用纯化于帝王(堪 察加半岛）蟹的肝胰腺的DSN(Shagin等人，2002KDSN还可以区分完全和非完全匹配的短 DNA双链。DSN被广泛用于全长富集cDNA的归一化（Zhulidov等人，2004;Bogdanova等人 2011a)，以及构建归一化RNA-seq文库用于新一代测序(Christodoulou等人，2011)。
[0046] 核酸分子的浓度对应于浓缩核酸分子直至其浓度为至少两倍的初始浓度。该浓度 适合随后的酶反应的进行。
[0047] 作为一个非限制性的示例，核酸分子的浓缩可以通过使用提取试剂盒进行，例如 智能（smart)D-N Ademkit。该过程有效地去除DSN酶并浓缩核酸。DSN通过任何已知的灭活 或去除酶的方法以灭活或去除，例如加热或者物理提取酶。作为一个示例，DSN可以通过使 用提取过程智能D-N Ademkit提取。
[0048]通过使用本领域技术人员已知的任何方法扩增核酸分子。优选地，通过滚环扩增 (RCA)进行核酸的扩增。首先连接DNA片段，随后通过Phi29酶扩增。如果基因组拷贝数接近 或低于1000个基因组，则Phi 29酶用于处理小基因组是没有效的。进行连接步骤以连接这 些小片段，以便它们能在RCA扩增中能被扩增。用于RCA的任何商业试剂盒可以被用于该步 骤。优选地，根据qiagen?WTA试剂盒进行RCA过程。
[0049] DNA文库是DNA或cDNA的集合，其代表了来自具体生物体或样本的已知的DNA或 cDNA序列。根据本发明用于体外制备DNA文库的方法中，DNA文库优选是cDNA文库，其包含从 RNA分子逆转录获得的cDNA片段。必要时，NGS、DNA或cDNA片段可以直接被用作文库用于克 隆扩增。
[0050] 在众多的用于确定核酸分子的序列的方法中，包括链终止(Sanger测序），可以引 用以下新一代测序(NGS)方法:单分子实时测序(PacificBio?)、离子半导体(离子激流测 序)通过合成的焦磷酸测序(454) (lUmnina ? )和通过连接的测序(SOLiD测序）。
[0051] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于在体外检测样本中来自微生物或病毒 至少一种稀少核酸的存在的方法，其中在步骤a)中，核酸分子包含DNA分子、RNA分子或其组 合，并且其中核酸分子的提取之后，逆转录步骤a)的RNA分子。
[0052]表述"RNA的逆转录"定义了一种方法，其中样本的RNA分子在合适的条件下接触逆 转录酶，用于从RNA分子生成cDNA分子。任何逆转录酶可以被用于根据本发明的方法中，然 而优选转录酶RNase H minus或RNase Η活性降低的转录酶。作为非限制性的示例，使用工 程或未修饰的逆转录酶(1?1')进行1^^分子的逆转录，更优选使用8卯6^(31^口1:1111?1'(1^1^ technologies)〇
[0053] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于在体外检测样本中来自微生物或病毒 的至少一种稀少核酸的方法，其中在进行步骤g)之前，使用DSN处理步骤f)的DNA文库。
[0054] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于检测样本中的至少一种稀少核酸 分子的方法，其中所述至少一种稀少核酸分子是微生物的核酸分子。
[0055] 在根据本发明的一个方法中，微生物或微生物剂是选自以下的微观的生物体:真 核生物(例如酵母、真菌、藻、原生动物)和原核生物(例如细菌和古细菌）。细菌包括革兰氏 阳性和革兰氏阴性细菌。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于检测至少一种 微生物剂的方法，其中，所述微生物剂选自：革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、分枝杆菌、支 原体和真菌。在用于检测稀少核酸分子的方法的具体实施方案中，所述微生物的天然的基 因组选自：双链DNA、单链DNA、双链RNA和单链RNA。
[0056] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于检测来自支原体的至少一种稀少 核酸的存在的方法。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及用于检测来自支原体的至少 一种稀少核酸的存在的方法，所述支原体选自：猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、肺炎 支原体(Mycoplasma pneumoniae)、拉氏无胆甾原体(Acheloplasma laidlawii)、发酵支原 体（Mycoplasma fermentans)、口腔支原体（Mycoplasma orale)、梓檬螺旋原体 (Spiroplasma citri )、关节液支原体（Mycoplasma synoviae)、鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum)和精氨酉爱支原体(Mycoplasma arginini) 〇
[0057] 在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种用于检测来自口腔支原体的至少一 种稀少核酸的存在的方法。
[0058] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于检测样本中至少一种稀少核酸 分子的方法，其中所述至少一种稀少核酸分子是病毒的核酸分子。
[0059] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于检测样本中来自病毒的至少一种 稀少核酸分子的方法，其中所述病毒的基因组是包在包膜内的（encapsulated)。在另一个 具体实施方案中，本发明涉及一种用于检测样本中的来自病毒的至少一种稀少核酸分子的 方法，其中所述的病毒基因组是游离的(free)。
[0060] 在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于检测样本中来自病毒的至少一 种稀少核酸分子的方法，其中所述病毒选自：双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒和单 链RNA病毒。在一个甚至更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于检测样本中来自病毒的 至少一种稀少核酸分子的方法，其中所述病毒是"分节段病毒(segmented virus)"，其基因 组被分割为单独的部分。在另一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于检测样本中 来自病毒的至少一种稀少核酸分子的方法，其中所述病毒是"非分节段病毒"，其基因组不 被分割为单独的部分。
[0061] 在一个更具体的实施方案中，本发明涉及用于检测样本中来自病毒的至少一种稀 少核酸分子的方法，其中所述病毒选自：人病毒、猴病毒、嗤齿动物病毒、马病毒，牛病毒、猪 病毒、昆虫病毒和菌体。
[0062] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于在体外检测生物样本中来自病毒 的至少一种稀少核酸的方法，其中所述病毒选自：
[0063] ?腺病毒科(Adenoviridae)(包括腺病毒5型）
[0064] ?指环病毒科(Anelloviridae)
[0065] ?博尔纳病毒科（Bornaviridae)
[0066] ?本扬病毒科(Bunyaviridae)
[0067] ?杯状病毒科(Caliciviridae)(包括水泡疼病毒(vesivirus)2117)
[0068] ?环病毒科(Circoviridae)(包括猪环状病毒1型和2型）
[0069] ?冠状病毒科（Coronaviridae)
[0070] ?丝状病毒科(Filoviridae)
[0071 ] ?黄病毒科(Flaviviridae)(包括BVDV、丙型肝炎病毒、西尼罗病毒）
[0072] ?肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(包括乙型肝炎病毒）
[0073] ?肝炎病毒科(Hepeviridae)(包括戊型肝炎病毒）
[0074] ?疱疹病毒科（Herpe s v ir i dae)(包括 HSV、HCMV、EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8)
[0075] ?正粘病毒科（Orthomyxoviridae)
[0076] ?乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)
[0077] ?副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(包括 RSV_A、RSV_B)
[0078] ?细小病毒科（Parvoviridae)(包括 B19、MVM、PPV)
[0079] ?小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(包括甲型肝炎病毒）
[0080] ?多瘤病毒科(Polyomaviridae)(包括人多瘤病毒BK和JC、MyCV)
[0081] ?痕病毒科(Poxviridae)
[0082] ?呼肠孤病毒科（Reoviridae)
[0083] ?逆转录病毒科(Retroviridae)(包括人类免疫缺陷病毒、鼠白血病病毒）
[0084] ?弹状病毒科(Rhabdoviridae)，和
[0085] ?披膜病毒科（Togaviridae)
[0086] 在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于在体外检测生物样本中的来自 病毒的至少一种稀少核酸的方法，其中所述病毒选自：牛病毒性腹泻病毒(BVDV);牛腺病毒 3型(BAV3);牛细小病毒(BPV);蓝舌病毒(BTV)，BT-2株;牛合胞体病毒(BRSV)，TN株;呼肠孤 病毒3型(Reo3)，阿布尼株(Abney strain)MLV PPV，乙型流感、FluA H3N8和狂犬病病毒。
[0087] 在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于在体外检测生物样本中来自病 毒的至少一种稀少核酸的方法，其中，所述病毒的特异性的检测是通过使用至少一种、优选 两种特异性的引物进行的，其中所述引物选自：
[0088] a)用于检测来自Ad5的核酸：引物包含与选自SEQ ID N°1、SEQ ID N°2、和SEQ ID N°3的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0089] b)用于检测来自BK的核酸：引物包含与选自SEQ ID N°4、SEQ ID N°5、和SEQ ID N°6的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0090] C)用于检测来自BVDV的核酸：引物包含与选自SEQ ID N°7、SEQ ID Ν°8、和SEQ ID N°9的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0091] d)用于检测来自HBV的核酸：引物包含与选自SEQ ID N°10、SEQ ID N°ll、和SEQ ID N° 12的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0092] e)用于检测来自FluA的核酸：引物包含与选自SEQ ID N°13、SEQ ID N°14、和SEQ ID N° 15的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0093] f)用于检测来自MLV的核酸：引物包含与选自SEQ ID N°16、SEQ ID N°17、和SEQ ID N° 18的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0094] g)用于检测来自PPV的核酸：引物包含与选自SEQ ID N°19、SEQ ID N°20、和SEQ ID N° 21的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0095] h)用于检测来自Reo3的核酸：引物包含与选自SEQ ID N°22、SEQ ID N°23、和SEQ ID N° 24的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0096] 本发明还涉及一种用于表征生物样本的至少一种微生物或病毒的存在和/或水平 的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物样本中的来自微生物或者病毒 的至少一种稀少核酸的方法，以及表征所述生物样本的所述至少一种微生物或病毒的存在 和/或水平。
[0097] "表征至少一种微生物或病毒的存在和/或水平"指确定至少一种微生物或病毒的 存在或不存在，和/或如果存在，所述至少一种微生物或病毒的量。在一个具体的实施方案 中，本发明用于表征生物产品的至少一种微生物或病毒的存在和/或水平的方法是这样一 种方法，即用于确定生物产品中污染微生物或病毒的存在和/或水平。
[0098] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于表征生物产品的至少一种微生物的存 在和/或水平的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测生物样本中的来自所述微 生物的至少一种稀少核酸的方法，以及表征所述生物产品的所述至少一种微生物的存在 和/或水平，其中所述微生物选自：革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、支原体、酵母和真菌。
[0099] 在一个更具体的实施方案中，本发明涉及用于表征在生物产品中至少一种微生物 的存在和/或水平的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物产品中的来 自所述微生物的至少一种稀少核酸的方法，以及表征所述生物产品的所述至少一种微生物 的存在和/或水平，其中所述微生物是支原体，所述支原体选自：猪鼻支原体、肺炎支原体、 拉氏无胆留原体、发酵支原体、口腔支原体、柠檬螺旋原体、关节液支原体、鸡毒支原体和精 氨酸支原体。
[0100] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于表征在生物产品中的至少一种病毒的 存在和/或水平的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物产品中的来自 所述病毒的所述至少一种稀少核酸的方法，以及表征所述生物产品的所述至少一种病毒的 存在和/或水平，其中所述病毒选自：腺病毒科、指环病毒科、博尔纳病毒科、本扬病毒科、杯 状病毒科、环病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、肝炎病 毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳头瘤病毒科、副黏液病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病 毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科、和披膜病毒科。
[0101] 在另一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于表征在生物产品的至少一种 病毒的存在和/或水平的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物产品的 来自所述病毒的所述至少一种稀少核酸的方法，以及表征所述生物产品的所述至少一种病 毒的存在和/或水平，其中所述病毒选自：腺病毒5型、水泡疹病毒2117、猪环状病毒1型和2 型、丙型肝炎病毒、西尼罗病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、批￥、!0^48￥、冊￥-6、冊￥-7、HHV-8、RSV-A、RSV-B、B19、MVM、PPV、甲型肝炎病毒、人多瘤病毒BK和JC、MyCV、人类免疫缺 陷病毒、鼠白血病病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV);牛腺病毒3型(BAV3);牛细小病毒(BPV); 蓝舌病毒（BTV)，BT-2株；牛合胞体病毒(BRSV)，TN株；呼肠孤病毒3型（Re 〇3)，阿布尼株； MLV; PPV;乙型流感、FluA H3N8;和狂犬病病毒。
[0102] 在另一个具体的实施方案中，本发明用于表征生物产品的至少一种微生物或病毒 的存在和/或水平的方法，其是一种用于评估生物产品的安全性的方法，其中确定所述至少 一种微生物或病毒的存在和/或水平是与具体生物产品中给定微生物或病毒的已知可接受 的存在和/或水平相比较。
[0103] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于评估用于生物产品的制备的制 造过程的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测生物样本中来自微生物或病毒的 至少一种稀少核酸的方法，其中所述在体外检测所述生物产品中的来自微生物或病毒的至 少一种稀少核酸是在所述制造过程的至少两个不同的阶段进行的。
[0104] 在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于评估用于制备生物产品的制造 过程的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物产品中来自微生物的至少 一种稀少核酸的方法，其中所述微生物选自：革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、支原体、酵 母和真菌。
[0105] 在一个甚至更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于评估用于制备生物产品的 制造过程的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物产品中的来自微生物 的至少一种稀少核酸的方法，其中所述微生物是支原体，所述支原体选自：猪鼻支原体、肺 炎支原体、拉氏无胆留原体、发酵支原体、口腔支原体、柠檬螺旋原体、关节液支原体、鸡毒 支原体和精氨酸支原体。
[0106] 在另一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于评估用于制备生物产品的制 造过程的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物产品中的来自微生物的 至少一种稀少核酸的方法，其中所述微生物是病毒，所述病毒选自：腺病毒科、指环病毒科、 博尔纳病毒科、本扬病毒科、杯状病毒科、环病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、肝 脱氧核糖核酸病毒科、肝炎病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳头瘤病毒科、副黏液病毒 科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、 弹状病毒科、和披膜病毒科。
[0107] 在另一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种用于评估用于制备生物产品的制 造过程的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物产品中的来自微生物的 至少一种稀少核酸的方法，其中所述微生物是病毒，所述病毒选自：腺病毒5型、水泡疹病毒 2117、猪环状病毒1型和2型、丙型肝炎病毒、西尼罗病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、 HSV、HCMV、EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8、RSV-A、RSV-B、B19、MVM、PPV、甲型肝炎病毒、人多瘤病 毒BK和JC、MyCV、人类免疫缺陷病毒、鼠白血病病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV);牛腺病毒3 型(BAV3);牛细小病毒(BPV);蓝舌病毒(BTV)，BT-2株；牛合胞体病毒(BRSV)，TN株;呼肠孤 病毒3型(Reo3)，阿布尼株MLV PPV、乙型流感、FluA H3N8和狂犬病病毒。
[0108] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于表征在生物产品中至少一种病 毒的存在和/或水平的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测所述生物产品中的 来自所述病毒的所述至少一种稀少核酸的方法，以及表征所述生物产品中所述至少一种病 毒的存在和/或水平，其中所述病毒选自：腺病毒科、指环病毒科、博尔纳病毒科、本扬病毒 科、杯状病毒科、环病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、肝 炎病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳头瘤病毒科、副黏液病毒科、细小病毒科、小核糖核 酸病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科、和披膜病毒 科。
[0109]在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于表征在生物产品中的至少一种 病毒的存在和/或水平的方法，所述方法包含根据本发明的用于在体外检测所述生物产品 中的来自所述病毒的所述至少一种稀少核酸的方法，以及表征所述生物产品中所述至少一 种病毒的存在和/或水平，其中所述病毒选自：腺病毒 5型、水泡疹病毒2117、猪环状病毒1型 和2型、丙型肝炎病毒、西尼罗病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、HSV、HCMV、EBV、HHV_6、 HHV-7、HHV-8、RSV-A、RSV-B、B19、MVM、PPV、甲型肝炎病毒、人多瘤病毒BK和JC、MyCV、人类免 疫缺陷病毒、鼠白血病病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV);牛腺病毒3型(BAV3);牛细小病毒 (BPV);蓝舌病毒(BTV)，BT-2株;牛合胞体病毒(BRSV)、TN株;呼肠孤病毒3型(Reo3)，阿布尼 株MLV PPV、乙型流感、FluA H3N8和狂犬病病毒。
[0110]在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于鉴定生物样本中的至少一种微 生物或病毒的方法，所述方法包含根据本发明用于在体外检测样本中来自微生物或病毒的 至少一种稀少核酸的方法，以及根据在所述检测方法中生成的DNA文库的分子核酸序列，鉴 定至少一种微生物或病毒的步骤。
[0111] 在一个更具体的实施方案中，本发明涉及DSN用于检测样本中至少一种稀少核酸 分子的方法中的用途。
[0112] 在一个更具体的实施方案中，根据本发明，本发明涉及DSA用于检测样本中微生物 或病毒的至少一种稀少核酸分子的方法中的用途，其中至少在扩增所述核酸分子的步骤之 前使核酸分子与DSN接触。
[0113] 在一个甚至更具体的实施方案中，根据本发明，本发明涉及DSN用于检测样本中的 微生物或病毒的至少一种稀少核酸的方法中的用途，其中在扩增所述核酸分子的步骤之前 和之后，使核酸分子与DSN接触。
[0114] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其用于检测生物样本中的 来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸分子，其中所述试剂盒包含DSN和至少一种化合物， 所述化合物选自：缓冲液、阳性对照和使用说明书。
[0115] 在一个更具体的实施方案中，根据本发明的试剂盒包含：
[0116] a)DSN，
[0117] b)至少一种选自以下的化合物:缓冲液、阳性对照和使用说明书，以及
[0118] c)用于特异性的检测至少一种微生物或病毒的引物。
[0119] 在一个更具体的实施方案中，根据本发明的试剂盒包含：
[0120] a)DSN，
[0121] b)至少一种选自以下的化合物:缓冲液、阳性对照和使用说明书，以及
[0122] c)用于特异性的检测至少一种微生物或病毒的引物，其中所述引物被特异性地设 计用于检测至少一种支原体，所述支原体选自：猪鼻支原体、肺炎支原体、拉氏无胆留原体、 发酵支原体、口腔支原体、柠檬螺旋原体、关节液支原体、鸡毒支原体和精氨酸支原体。
[0123] 在另一个具体的实施方案中，根据本发明的试剂盒包含：
[0124] a)DSN，
[0125] b)至少一种选自以下的化合物:缓冲液、阳性对照和使用说明书，以及
[0126] c)用于特异性的检测至少一种病毒的引物，其中所述引物被特异性地设计用于检 测至少一种病毒，所述病毒选自：腺病毒科、指环病毒科、博尔纳病毒科、本扬病毒科、杯状 病毒科、环病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、肝炎病毒 科、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳头瘤病毒科、副黏液病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒 科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科、和披膜病毒科。
[0127] 在另一个具体的实施方案中，根据本发明的试剂盒包含：
[0128] a)DSN，
[0129] b)至少一种选自以下的化合物:缓冲液、阳性对照和使用说明书，以及
[0130] c)用于特异性的检测至少一种病毒的引物，其中所述引物被特异性地设计用于检 测至少一种病毒，所述病毒选自：腺病毒5型、水泡疹病毒2117、猪环状病毒1型和2型、丙型 肝炎病毒、西尼罗病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、HSV、HCMV、EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8、 RSV-A、RSV-B、B19、MVM、PPV、甲型肝炎病毒、人多瘤病毒BK和JC、MyCV、人类免疫缺陷病毒、 鼠白血病病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV);牛腺病毒3型(BAV3);牛细小病毒(BPV);蓝舌病 毒(BTV)，BT-2株;牛合胞体病毒(BRSV)，TN株;呼肠孤病毒3型(Reo3)，阿布尼株MLV PPV、乙 型流感、FluA H3N8和狂犬病病毒。
[0131] 在一个甚至更具体的实施方案中，根据本发明的试剂盒包含：
[0132] . DSN,
[0133] ?至少一种选自以下的化合物:缓冲液、阳性对照和使用说明书，以及
[0134] ?用于特异性检测至少一种病毒的至少一种引物，其中所述至少一种引物选自：
[0135] a)用于检测来自Ad5的核酸：引物具有与选自SEQ ID N°1、SEQ ID N°2、和SEQ ID N°3的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0136] b)用于检测来自BK的核酸：引物具有与选自SEQ ID N°4、SEQ ID N°5、和SEQ ID N°6的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0137] c)用于检测来自BVDV的核酸：引物具有与选自SEQ ID N°7、SEQ ID N°8、和SEQ ID N°9的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0138] d)用于检测来自HBV的核酸：引物具有与选自SEQ ID N°10、SEQ ID N°ll、和SEQ ID N° 12的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0139] e)用于检测来自FluA的核酸：引物具有与选自SEQ ID N°13、SEQ ID N°14、和SEQ ID N° 15的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0140] f)用于检测来自MLV的核酸：引物具有与选自SEQ ID N°16、SEQ ID N°17、和SEQ ID N° 18的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0141] g)用于检测来自PPV的核酸：引物具有与选自SEQ ID N°19、SEQ ID N°20、和SEQ ID N° 21的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0142] h)用于检测来自Reo3的核酸：引物具有与选自SEQ ID N°22、SEQ ID N°23、和SEQ ID N° 24的序列相同或具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0143] 除非另有规定，本文提供的以下实施例和附图仅用于说明目的，并且不旨在限制。
【附图说明】
[0144] 图1:基因特异性的Cq和RNA 18S Cq之间的差的直方示意图，其中，从左至右:BK、 BVDV和PPV。对于每种病毒，左侧最浅色的条代表未扩增获得的结果，然而右侧最深色的条 代表扩增获得的结果。
[0145] 图2:基因特异性的Cq和RNA 18S Cq之间的差的直方示意图，其中，从左至右： 八(^5、819、81(、8￥0￥、冊￥、111伙、]\0^、]\^]\1、？?￥和1^〇3。对于每种病毒，左侧最浅色的条代表扩 增和DSN处理获得的结果，然而右侧最深色的条代表未扩增获得的结果。
【具体实施方式】
[0146] 实施例
[0147] 实施例1:评估检测需要读取的数量
[0148] 表1总结了需要生成的读取的数量，其用于检测来自受污染的宿主制备的样本中 的PCV1 (已知的最小的病毒基因组)和PRV(代表较大的病毒基因组大小）的病毒颗粒。表1基 于这样一种假设，即所述病毒基因组存在于包含lyg或lng的总核酸分子的样本中，且当使 用NGS方法时，序列被一致地扩增。
[0149] 表1
[0150]
[0151] 读取的数量依赖于病毒基因组的大小，与较大的基因组大小相比，小的基因组大 小提高21ogl0级别的读取数量。即使NGS仪器的性能（capacity)正在提高，读取的总数量对 于仪器的性能十分重要。
[0152] 实施例2: DSN处理对稀少核酸的扩增的作用
[0153 ] 获得来自人MRC5细胞的上清液，且以接近qPCR检测限的病毒浓度(对应定量(RT)- PCR的L0D)人工地掺入具有不同类型的基因组的病毒。掺入以下病毒:人腺病毒5型(HADV-5 或Adeno 5、或Ade5;在A549细胞中生产和滴定）、细小病毒B19(B19，世界卫生组织库，NIBSC 99/800,滴度以国际单位表示）、人多瘤病毒BK(BK ATCC-837)、牛病毒性腹泻病毒的NADL株 (BVDV-1-NADL或BVDV，在MDBK细胞中生产和滴定）、乙型肝炎病毒（HBV，WHO库，NIBSC 97/ 750，滴度以IU表示）、马流感病毒A(InfA或FluA H3N8，在MDCK细胞中生产并通过定量PCR以 每ml的基因组拷贝数(gc)滴定）、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV ATCC VR-190，在NIH/3T3中 生产并在FglOS+L-细胞中滴定）、猪细小病毒(PPV，VR-742，在ST细胞上生产和滴定）以及呼 肠孤病毒3型(或Reo3，ATCC VR-232,在Vero细胞中生产或滴定）。
[0154] 表2总结了试验的病毒、其起源以及作为检测限(L0D)的函数的稀释。
[0155] 表2 「01561

[0157] 首先在不存在任何DSN处理时，进行特异性实时PCR试验，用以比较稀少病毒核酸 的扩增与18S RNA序列（18S)的扩增。
[0158] 以下是用于PCR试验的引物的核酸序列：
[0159] · Ad5(Van de Pol等人，2007)
[0160] Ad5F:5，-AACCAGTTGCCGTGAGAG-3，（SEQ ID N°l)
[0161] Ad5R:5'-TCGTTAAGCAAGTCCTCGATACAT-3'（SEQ ID N°2)
[0162] Ad5探针：5'-(6-Fam)TGGGCGTCGCCAGGCTGTG(Tamra)-3'（SEQIDN°3)
[0163] · BK(Whiley等人，2001)
[0164] BK-F:5，CACTTTTGGGGGACCTAGT 3，（SEQ ID N°4)
[0165] BK-R:5，CTCTACAGTAGCAAGGGATGC 3，（SEQ ID N°5)
[0166] BK-探针：5'（6-Fam)TCTGAGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTT(Tamra)3'（SEQ ID N°6)
[0167] · BVDV(Bhudevi B.,&Weinstock D.,2001)
[0168] BVDV-F：5'-TAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3'(SEQ ID N° 7)
[0169] BVDV-R：5'-GACGACTACCCTGTACTCAGG-3'(SEQ ID N° 8)
[0170] BVDV-探针：5，-(6-Fam)AACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTT(Tamra)-3'（SEQIDN。9)
[0171] · HBV(Zane 11a等人，2002)
[0172] HBV F0R:5'-CCTATGGGAGTGGGCCTCA-3'（SEQ ID N°10)
[0173] HBV REV:5 '-CCCCAATACCACATCATCCATATA-3 '（SEQ ID N°11)
[0174] HBV：5,-(6-Fam)CACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA(Tamra)-3 ,(SEQ ID N°12)
[0175] · Flu A(Watzinger等人，2004):
[0176] FluA-F:5'CATGGAATGGCTAAAGACAAGACC 3'（SEQ ID N°13)
[0177] FluA-R:5，CCATTTAGGGCATTTTGGACA 3，（SEQ ID N°14)
[0178] FluA-探针：5，Fam TTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCA Tamra 3，（SEQ ID N°15)
[0179] . MLV
[0180] MLV-F：5'-AAATGAAAGACCCCCGCTG-3'(SEQ ID N°16)
[0181] MLV-R:5，-TGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3，（SEQ ID N°17)
[0182] MLV-探针：5，-(6-Fam)CGGGTAGTCAATCACTCAGAGGAGACCCT(Tamra)-3，（SEQIDN。 18)
[0183] . PPV
[0184] PPVVP2F：5'-CCAACATGGACACTTAACCACATC-3'(SEQ ID N°19)
[0185] PPVVP2R：5'-GTTGATTAAATTGTTGCTTTGGAGC-3'(SEQ ID N° 20)
[0186] PPV-探针：5，-(6-Fam)
[0187] TCACAAGAGCTAGAAAGATACACATTCAATCCACAAAG(Tamra)-3'(SEQ ID N° 21)
[0188] · RE03
[0189] RE03-3F：5'-GAGATGTTAGGTTTCTGCGTCTAGTG-3'(SEQ ID N° 22)
[0190] RE03-R:5'-AGAATGGGTAATCATCACAATCATACA-3'（SEQ ID N°23)
[0191] RE03-探针：5'-(6-Fam)TGCCCCACCGCAGGTCTTAGCTC(Tamra)-3'（SEQIDN°24)
[0192] 对于B19，qPCR的灵敏度在Cheval等人(2011)中描述。
[0193] 根据生产商的说明书，使用QIAamp病毒RNA迷你型试剂盒(Qiagen)进行核酸提取 过程：提取140yL的样本，且以100μΙ的最终体积洗脱核酸(DNA和RNA)。根据生产商的说明 书，使用Reverse Transcriptase Superscript III(Invitrogen公司）对洗脱的部分进行 逆转录。
[0194] 根据以下方法中的任一个处理样本：
[0195] 1)根据生产商的说明书，使用逆转录酶处理核酸(Berthet等人，2008 )，无后续通 过扣4扩增。确定对阶0￥、冊￥和？?￥的9?0?试验中的定量循环（9113111:丨;1^〇31:;[01105^168， Cq)，随后减去18S RNA序列的Cq。对于试验的三种病毒的每一种，基因特异性的模型Cq和 RNA 18S Cq之间的差包含在14Cq至18Cq(图1，左侧浅色的条）。
[0196] 2)提取核酸，使用逆转录酶处理，随后通过RCA扩增。确定对BVDV、HBV和PPV的qPCR 试验中的定量循环(Cq)，随后减去18S RNA序列的Cq。与18S序列相比，BVDV、HBV和PPV序列 被较少地扩增。由于RCA扩增后未检测到PPV序列，PPV的Cq定义为45，对应于PCR程序的结 束；因此，Cq之间的差为33。模型Cq和RNA 18S Cq之间的差包含在约19至约33Cq(图1，右侧 深色的条）。因此，稀少基因特异性和18S扩增的差在RCA扩增之后是更高的，指示偏倚的扩 增。
[0197] 第二步，在进行根据本发明的包括DSN处理的方法后，进行特异性实时PCR试验，用 以比较稀少病毒核酸的扩增和18S RNA序列（18S)的扩增。
[0198] 根据生产商的说明书，使用Silica Adembeads试剂盒(Ademtech)进行核酸提取过 程:提取250yL的样本，且以60μ1的最终体积洗脱核酸(DNA和RNA)。根据生产商的说明书，使 用Reverse Transcriptase Superscript III(Invitrogen公司）对洗脱的部分的28μ1 进行 逆转录。
[0199] 根据以下方法中的一个处理样本：
[0200] 1)提取核酸，随后使用逆转录酶处理，未通过RCA扩增。确定对Ade5、BK、BVDV、HBV、 InfA、PPV和Re〇3的qPCR试验中的定量循环(Cq)，随后减去18S RNA序列的Cq。对于试验的病 毒的每一种，基因特异性的矩阵Cq和RNA 18S Cq之间的差包含在llCq至17Cq(图2,右侧深 色的条）。
[0201] 2)提取核酸，使用逆转录酶处理，使用DSN处理，随后通过RCA扩增（本发明的方 法）<^(^5、819、81(、8￥0￥、邢￥、11^4、]\0^、]\^]\^?￥和1^〇3的定量循环(〇9)减去9?0?试验中检 测的18S RNA(18S)序列的Cq(图2,左侧浅色的条）。
[0202]根据本发明，当样本经受DSN和浓缩处理时，当扩增与不扩增样本时，病毒序列和 18S序列之间的比例是大致相同的，表明扩增方法是无偏倚的。当核酸经提取随后RT处理 时，无任何RCA扩增，发现三种矩阵与18S序列比较的差为约12Cq至17Cq。根据本发明的方 法，当核酸经提取、随后RT处理、随后DSN处理、浓缩和RCA扩增，病毒序列显示三种矩阵与 18S序列相比较的差约8Cq至21Cq。
[0203]偏倚的扩增现象基于低频率的靶标，在同一个反应中，当与较高数量的序列相比， 低频率的靶标更少地被检测和扩增。这导致测序宿主的主要的核酸，并且这能导致检测不 到污染物。当低水平的污染物分散在含有高水平的宿主核酸的生物样本中时，在使用HTS检 测低水平的污染物将是不利的。
[0204]比较根据本发明的方法制备的稀少核酸的扩增效率，显示该方法允许无偏倚的扩 增核酸。
[0205]实施例3:比较现有技术的方法中通过qPCR、通过NGS检测和通过本发明的方法检 测的灵敏度
[0206]如在实施例1中描述的，MRC5上清液以接近所述病毒的qPCR检测限的浓度人工地 掺入9种不同的病毒。对于每一种病毒制备两个系列的样本：
[0207] -0 · 8倍L0D浓度的病毒(混合物1)
[0208] -3倍L0D浓度的病毒(混合物2)
[0209] 病毒稀释与那些此前公布在Cheval等人（2011)中描述的NGS方法(NGS方法1)一 致，以允许比较本发明的方法(NGS方法2)与qPCR以及现有技术中描述的NGS方法1的灵敏 度。下表3总结了病毒的名称和参考。
[0210] 表3
[0211]
[0212] · NGS方法 1 (Cheval等人2011)
[0213] 使用1111(316〇8。;[111?嫩病毒试剂盒(]\^(3116代7-似861)提取15(^1体积的每种样本， 随后通过基于噬菌体Phi29聚合酶的多重置换扩增(MDA)进行扩增。
[0214] *NGS方法2(本发明）
[0215] 根据生产商的说明书，使用Silica Adembeads试剂盒(Ademtech)进行核酸提取过 程：提取250yL的样本，且以60μ1的终体积洗脱核酸（DNA和RNA)。使用Reverse Transcriptase Superscript III(Invitrogen公司）对洗脱的部分的28μ1 进行逆转录。 [0216] RT步骤之后进行DSN处理：70μ1的RT反应物与22·75μ1的4χ杂交缓冲液（Hepes NaCl 1M EDTA)混合，并且在98°C热变性3分钟。随后反应物保持在70°C持续4小时，之后添 加 10.5μ1的预热的2X DSN缓冲液和1.75μ1的DSN酶(Evrogen)，在70°C孵育反应物10分钟。 通过添加 1〇〇μ1的2X终止反应物终止反应，且经受智能提取，智能提取用于去除DSN和浓缩 已经在前面的步骤中被稀释的核酸。根据生产商的说明书，200μ1样本与200μ1裂解缓冲液、 200μ1的结合缓冲液和2μ1的智能D-N-Adembeads (Ademtech)混合。在5分钟孵育期间混合物 被混合两次，且使用1〇μ1的水洗脱5分钟。产生的核酸分子经连接，并根据生产商的说明书 使用QuantiTect全转录组试剂盒(Qiagen)扩增。
[0217] 结果
[0218] 表4显示对于每种病毒，NGS方法-1和NGS方法-2 (本发明的方法)检测到的序列的 数量，以及通过qPCR检测频率。
[0219] 表4还总结了对于每种方法和在每种条件(混合物1和混合物2)中检测到的病毒的 频率。
[0220] 表 4 [02211
[0222] 对于混合物1(0.8以》)4?〇?、如3方法1和如3方法2分别检测到10种病毒中的7种、 4种和9种。对于Mix 2(3L0D)，qPCR、NGS方法1和NGS方法2分别检测到10种病毒中的9种、7种 和9种。
[0223] 使用根据本发明用于制备核酸样本的方法，对混合物1和混合物2均检测到10种病 毒中的9种，这显示根据本发明的方法的效率。使用qPCR和当使用NGS方法1时情况并非如 此。本发明的方法的灵敏度优于qPCR的灵敏度。NGS方法2优于NGS方法1的灵敏度证实根据 本发明的方法通过使用DSN和浓缩步骤提供了技术效果。
[0224] 实施例4:检测生物样本中的病毒和细菌序列
[0225] 如下表5中描述的，以接近所述病原体的qPCR检测限的浓度，在细胞上清液中人工 地掺入四种不同的病原体(包括三种不同的病毒和一种支原体物种）。口腔支原体的特征在 于约680kpb的双链DNA组成的基因组。
[0226] 表 5
[0227]
[0228] 使用的方法与实施例3中的相同。
[0229] 根据生产商的说明书，使用Silica Adembeads试剂盒(Ademtech)进行核酸提取过 程：提取250yL的样本，且以60μ1的最终体积洗脱核酸（DNA和RNA)。使用Reverse Transcriptase Superscript III (Invitroge公司），对洗脱的部分的28μ1进行逆转录 (Berthet等人2008)。
[0230] RT步骤之后进行DSN处理：70μ1的RT反应物与22.75以的41杂交缓冲液（此？68 NaCl 1Μ EDTA)混合，并且在98°C热变性3分钟。随后反应物保持在70°C持续4小时，之后添 加10.5μ1的预热的2X DSN缓冲液和1.75μ1的DSN酶(Evrogen)，在70°C孵育反应物10分钟。 通过添加1〇〇μ1的2X终止反应物终止反应，且经受智能提取，智能提取用于去除DSN和浓缩 已经在前面的步骤中被稀释的核酸。根据生产商的说明书，200μ1样本与200μ1裂解缓冲液、 200μ1的结合缓冲液和2μ1的智能D-N-Adembeads (Ademtech)混合。在5分钟孵育期间混合物 被混合两次，且使用1〇μ1的水在70°C洗脱5分钟。产生的核酸分子经连接，并根据生产商的 说明书，使用QuantiTect全转录组试剂盒(Qiagen)扩增。
[0231 ]以下是用于PCR试验使用的引物的核酸序列：
[0232] . PCV1
[0233] PCV1 探针，TaqMan 探头（Sonde):
[0234] 5'Fam AAGCGGCCCGCAACCCCA Tamra 3'(SEQ ID N〇25)
[0235] PCV1F，正向引物：5'CCTCGGCAGCGTCAGTGA3'（SEQIDN°26)
[0236] PCV1R，反向引物：5'CGGAAGGATTATTAAGGGTGAACAC3'（SEQIDN°27)
[0237] . MVM
[0238] MvM-探针，TaqMan 探头，5 ' - (6-Fam)
[0239] CAAGCCATAGCACAAGCAGTTGGCAA(Tamra)-3,(SEQ ID N〇28)
[0240] MvM-F，正义（sens)引物：5，-CCAGCCAGCACAGGCAA-3，（SEQIDN。29)
[0241] MvM-R，反义（antisens)引物：5，-ACATTGGCTGCATTATAGCAACC-3，（SEQIDN。30)。 [0 242] 结果
[0243] 表6显示对于每一种病原体使用本发明的方法（"NGS"）检测到的序列的数量以及 通过qPCR检测到的循环阈值(Cp)的数。
[0244] 表 6
[0245]

[0246] 本发明的方法检测到已知的最小的哺乳动物病毒、PCV-1和属于细菌家族的支原 体物种。
[0247] 使用根据本发明用于制备核酸样本的方法，属于病毒和细菌序列的稀少微生物序 列能被检测和鉴定。
[0248] 实施例5:本发明方法的灵敏度依赖于提取
[0249] 使用不同的提取试剂盒进行核酸提取之后，比较本发明的方法与qPCR的灵敏度。 以十分低水平的病毒掺入MRC5上清液制备两个系列的样本，对应于约1和0.1L0D的病毒基 因组，且分别指定为混合物B和混合物C。表7显示病毒的名称、起源和稀释。
[0250] 表 7
[0251]
[0252] 提取过程与实施例3中显示的相同。对于1L0D混合物和qPCR确定，评估三种提取试 剂盒:Qiagen(QIAamp病毒RNA迷你型试剂盒）、Macherey Nagel(MN) (NucleoSpin RNA病毒） 和Ademtech(Silica adembeads提取试剂盒），然而对于0.1L0D混合物评估两种提取试剂 盒：Qiagen(QIAamp病毒RNA迷你型试剂盒）和Macherey Nagel (MN) (NucleoSpin RNA病毒）。 [0253] 结果
[0254] 下表8显示在使用每种提取试剂盒之后，进行qPCR获得的检测到的序列Cq值，以及 使用根据本发明的方法检测到的不同序列的数量。对于qPCR检测，粗体和下划线字符表明 检测到重复的病毒序列，然而正常字符表明仅检测到单一序列。
[0255] 表 8
[0256]
[0257]
[0258] 结论
[0259] 尽管可以认为Macherey Nagel和Ademtech试剂盒稍加灵敏，全部三种试剂盒显示 相似的检测水平。使用根据本发明的方法的样本制备允许在混合物B(1L0D)检测到9种病毒 中的8种，显示本发明的方法用于该量的污染病毒至少与qPCR同样灵敏。
[0260]在混合物C(0.1L0D)中，使用本发明的方法检测到9种病毒中的8种。唯一未检测到 的病毒对应于以十分低水平掺入的MLV，其中十分低的水平对应于0.007L0D。使用qPCR确 定，最佳提取方法(MN)允许检测到9种病毒中的7种，其中检测到的5种病毒具有50 %的频 率，确认当与qPCR比较时，根据本发明的方法更高的灵敏度。
[0261 ] 参考文献
[0262] Gardner 等人，（2003)J Clin Microbiol.2003 Jun;41(6):2417-27.
[0263] Barzon 等人，（2011)Int J Mol Sci.2011;12(ll):7861-7884.
[0264] Vries等人，（2010)，PLoS 0ne.2011 Jan 24;6(l):el6118.
[0265] Cheval等人，J.Clin.Microbiol，Sept 2011,3268-75(2011)
[0266] 1?〇(148116等人，？1^〇5 0陬，56?12〇〇9,4卷，9期，（2〇〇 9)
[0267] Maniatis T ·等人.Molecular cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor，Ν·Υ·，1999版·
[0268] Shagin等人，Genome Res.Dec;12(12):1935-42(2002)
[0269] Zhulidov等人，Nucleic Acids Res .Feb 18; 32(3): e37(2004)
[0270] Bogdanova等人.Methods Mol Biol · ;729:85_98. (2011a)
[0271] Christodoulou等人，Curr Protoc Mol Biol ·Apr ;4章：4.12单元（2011)
[0272] Berthet等人，（2008)BMC Mol Biol.2008;9:77.
[0273] Van de Pol A.C，等人，（2007)J.Clin.Microbiol 45:2260-2262.
[0274] Whiley DM等人，（2001)J Clin Microbiol .Dec;39(12) :4357-61.
[0275] Bhudevi B.，和Weinstock D.，（2001)Vet.Microbiol 83:1-10.
[0276] Zanella I，等人，（2002)J Med Virol 2002 Dec;68(4) :494-9.
[0277] Watzinger F.等人，（2004)J.Clin.Microbiol 42:5189-5198。
【主权项】
1. 一种方法，其用于在体外检测生物样本中存在的来自微生物或病毒的至少一种稀少 核酸，所述方法包含步骤： a) 提取来自生物样本的核酸分子，所述核酸分子包含双链核酸分子、单链核酸分子或 其组合， b) 诱导步骤a)的双链核酸分子的变性和复性， c) 步骤b)的产物与双链特异性核酸酶(DSN)接触， d) 从步骤c)的产物中灭活和/或提取所述DSN，并浓缩核酸分子， e) 扩增步骤d)的产物的核酸分子， f) 制备来自步骤e)的产物的DNA文库， g) 确定步骤f)的DNA文库的分子的核酸序列，并从所述核酸序列检测来自微生物或病 毒的至少一种稀少核酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中所述核酸分子包含DNA分子、RNA分子或 其组合，并且其中提取核酸分子后，逆转录步骤a)的RNA分子。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤e)中扩增核酸分子是通过滚环扩增 (RCA)进行的。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述微生物选自：革兰氏阳性细菌、革 兰氏阴性细菌、支原体，酵母和真菌。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述微生物是支原体，所述支原体选自：猪鼻支原 体Mycoplasma hyorhinis、肺炎支原体Mycoplasma pneumoniae、拉氏无胆留原体 Acheloplasma Iaidlawii、发酉孝支原体Mycoplasma fermentans、口腔支原体Mycoplasma orale、梓檬螺旋原体Spiroplasma citri、关节液支原体Mycoplasma synoviae、鸡毒支原 体Mycoplasma galIisepticum和精氨酉爱支原体Mycoplasma arginini 〇6. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少一种稀少核酸分子是病毒的 核酸分子。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述病毒选自：双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链 RNA病毒和单链RNA病毒、分节段病毒和非分节段病毒。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒选自：人病毒、猴病毒、嗤齿动物病毒、马 病毒，牛病毒、猪病毒、昆虫病毒和噬菌体。9. 根据权利要求7或8所述的方法，所述病毒选自：丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒 (耶￥)319、腺病毒5型、81(、8￥0￥、？11^!13呢、11^、？?￥、呼肠孤病毒3型和乙型流感病毒。10. -种用于表征生物样本的方法，所述方法包含根据权利要求1至9中任一项所述的 检测来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸，以及表征所述生物样本的所述至少一种微生 物或病毒的存在和/或水平。11. 一种用于评估用于生物产品的制备的制造过程的方法，所述方法包含根据权利要 求1至9中任一项所述的检测所述生物样本中来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸，其中 来自微生物或病毒的所述稀少核酸的所述检测是在所述制造过程的至少两个不同的阶段 进行的。 12. DSN用于检测生物样本中的来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸的用途。13. 根据权利要求12所述的用途，其用于包含扩增核酸分子的步骤的方法中，其中至少 在所述扩增核酸分子的步骤之前进行所述DSN的使用。14. 一种试剂盒，其用于检测生物样本中的来自微生物或病毒的至少一种稀少核酸，所 述试剂盒包含DSN和至少一种选自以下的化合物:缓冲液、阳性对照和使用说明书。15. 根据权利要求14所述的试剂盒，其包含以下成分： a) DSN， b) 至少一种选自以下的化合物:缓冲液、阳性对照和使用说明书，以及 c) 至少一种能够特异性地检测所述至少一种微生物或病毒的引物。
【文档编号】C12N15/10GK105916998SQ201480063231
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年10月1日
【发明人】F·多朗热
【申请人】特克斯塞尔公司