一种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)取清洗干净的绿豆，粉碎过筛，浸泡除脂，烘干，磷酸盐缓冲液提取，离心收集上清，盐析，得绿豆蛋白粗提液；2)将步骤1)得到的绿豆蛋白粗提液进行阴离子交换层析，分别收集280nm检测线的洗脱峰；3)将步骤2)得到的洗脱峰分别进行体外胆酸结合率测定，收集结合率最高的目的峰，即为目的蛋白。根据本发明的制备方法能够制得具有功效的绿豆蛋白，而且经过DEAE?Sepharose Fast Flow洗脱纯化后得到的纯化蛋白起降血脂肪功效更强。本方法具有绿豆蛋白筛选、纯化等作用，粗蛋白的提取操作简单，便于大范围推广。
【专利说明】
-种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及植物提取技术领域，特别设及一种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 绿豆，属于蝶形花科，菜豆族班豆属中的一个种，是溫带、亚热带地区广泛种植的 豆类之一，在中国已有两千余年的栽培史，是重要的药食物同源物质，被誉为"食中要物"， "济世粮谷"，"清热解暑良药"。中医认为:绿豆味甘，性凉，归屯、经，具有清热解毒解暑除烦、 利水消肿、清胆养胃、润肠通便、明目、降血糖、降血压、降血脂、抗肿瘤、抗过敏、保护肝脏和 屯、血管、增强免疫力、排铅等功效，适用于暑热烦渴、里热、小便不利、水肿、皮疹、食物及药 物中毒等。
[0003] 绿豆中蛋白质含量较高，约为20%，其氨基酸种类齐全，且蛋白质功效比高，居各 种豆类之首，具有开发价值。绿豆蛋白质主要为球蛋白类，其中富含蛋氨酸、色氨酸、赖氨 酸、亮氨酸、苏氨酸，运些都是人体每日需要补充的营养元素。
[0004] 目前国内的绿豆加工主要W淀粉利用为主，而绿豆蛋白等尚未得到充分利用。绿 豆功效研究中也主要是W绿豆全粉或者绿豆水提物运些混合物为研究基础，没有细化到绿 豆蛋白的功效作用，还有一些研究使用酶解法将绿豆蛋白水解为多肤从而研究其抗氧化及 解酒等功效，另外一些研究用Osborne分级分离法对绿豆中的蛋白质进行分级分离，得到四 种蛋白组分:清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，并对其进行功能性质评价，目前少量研究 证明绿豆蛋白能够提高染铅大鼠肾功能及抗氧化活性。
[0005] 目前国内外绿豆蛋白提取方法包括:碱提酸沉法、辅助浸提、酶解法、均质-超声联 合提取等。分离纯化绿豆蛋白方法包括:透析、超滤、离屯、、凝胶渗透层析、盐析法等。实际操 作中，造成大量的酸碱浪费，同时操作复杂。
[0006] 本发明在此基础上提出一种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，该方法能够 得到具有功效的绿豆蛋白，而且经过DEAE-琼脂糖凝胶FF洗脱纯化后得到的纯化蛋白起降 血脂肪功效更强。同时，本方法具有绿豆蛋白筛选、纯化等作用，粗蛋白的提取操作简单，便 于大范围推广。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法， 该方法能够得到具有功效的绿豆蛋白，而且经过洗脱纯化后得到的纯化蛋白起降血脂肪功 效更强。
[000引本发明所要解决的技术问题是通过W下技术方案来实现的：
[0009] -种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，包括W下步骤：
[0010] 1)取清洗干净的绿豆，粉碎过筛，浸泡除脂，烘干，憐酸盐缓冲液提取，离屯、收集上 清，盐析，得绿豆蛋白粗提液；
[0011] 2)将步骤I)得到的绿豆蛋白粗提液进行阴离子交换层析，分别收集280nm检测线 的洗脱峰；
[0012] 3)将步骤2)得到的洗脱峰分别进行体外胆酸结合率测定，收集结合率最高的目的 峰，即为目的蛋白。
[0013] 优选地，上述技术方案中，所述制备方法包括W下步骤：
[0014] 1)取清洗干净的绿豆，粉碎过筛，石油酸浸泡除脂，烘干，加入抑7.0憐酸盐缓冲液 提取，离屯、收集上清，硫酸锭盐溶液盐析，得绿豆蛋白粗提液；
[0015] 2)将步骤1)得到的绿豆蛋白粗提液进行阴离子交换层析，分别收集280nm检测线 的洗脱峰，透析脱盐，冻干成粉末；
[0016] 3)将步骤2)得到的粉末分别进行体外胆酸结合率测定，收集结合率最高的目的 峰，即为目的蛋白。
[0017] 优选地，上述技术方案中，所述步骤1)具体为：
[001引11)将清洗干净的绿豆粉碎，过80目筛，按固液比1:巧日入石油酸，浸泡2地除脂； [0019] 12)烘干后，按料液比1:4-1:10加入抑7.0憐酸盐缓冲液，提取，溫度为40-70°C，揽 拌30-120mins，离屯、后收集上清液；
[0020] 13)用浓度>50%的硫酸锭盐溶液进行盐析，至不产生沉淀为止，得绿豆蛋白粗提 物。
[0021 ]优选地，上述技术方案中，所述步骤2)的纯化方法包括：
[0022] 21)选用DEAE-琼脂糖凝胶FF作为阴离子交换层析的柱填料，对填料进行预处理；
[0023] 22)将绿豆粗提物溶解，12000r离屯、，得蛋白溶液，上柱，W抑7.5憐酸盐缓冲溶液 洗脱1倍柱体积，再W0-2N氯化钢溶液梯度洗脱2-3倍柱体积；
[0024] 23)在氯化钢溶液梯度洗脱过程中，收集280nm检测线的多个洗脱峰，分别装入透 析袋，4 °C过夜透析脱盐，冻干成粉末；
[0025] 24)将步骤23)得到的洗脱峰的粉末分别进行体外胆酸结合率测定，其中结合率最 高的粉末，即为具有降血脂功效的绿豆蛋白。
[00%]优选地，上述技术方案中，步骤12)的料液比为1:8;提取时间为90mins;提取溫度 40°(：;离屯、条件为:350化、15111111、4°(：离屯、。
[0027]优选地，上述技术方案中，步骤13)中，用80%硫酸锭盐溶液进行盐析，至不产生沉 淀为止，得绿豆蛋白粗提物。
[00%]优选地，上述技术方案中，所述硫酸锭盐溶液，是在已知上清液的体积后添加一定 质量的硫酸锭，从而形成已知硫酸锭盐溶液。
[0029] 优选地，上述技术方案中，步骤21)的预处理的方法为:将填料装柱后，用pH7.5憐 酸盐缓冲溶液洗脱，流速为〇.5ml/min，洗脱过夜直至检测线平衡。
[0030] 优选地，上述技术方案中，步骤22)的洗脱流速为:2ml/min，洗脱液4ml/瓶;所述憐 酸盐为憐酸氨二钢和憐酸二氨钢的混合溶液。
[0031] 优选地，上述技术方案中，步骤23)中，透析过夜的时间为8-12h，所述透析袋4°C过 夜透析脱盐需要进行流水透析;所述冷冻干燥的溫度为-40°C，真空力200mTorr。
[0032] 本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
[0033 ] 1.水提取，水做溶剂，安全，污染，价格低廉。
[0034] 2.对绿豆蛋白进行提取并进行纯化工艺。
[0035] 3.经过系统提取纯化研究，粗蛋白与胆酸结合率为37.93 %，纯化后蛋白峰3胆酸 结合率可达56.30%。
[0036] 4.粗蛋白提取工艺简单，对企业的技术要求低，可适应与大范围的推广。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明的提取溫度对胆酸结合率的影响。
[0038] 图2为本发明的提取时间对胆酸结合率的影响。
[0039] 图3为本发明的料液比对胆酸结合率的影响。
[0040] 图4为本发明的阴离子交换层析蛋白含量检测结果。
【具体实施方式】
[0041 ]下面对本发明的具体实施例进行详细描述，W便于进一步理解本发明。
[0042] W下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043] W下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0044] 实施例1绿豆蛋白粗提液的制备
[0045] 分别研究提取溫度、提取时间、料液比W及硫酸锭浓度比对绿豆蛋白提取量的影 响。
[0046] (1)提取溫度、提取时间W及料液比对绿豆蛋白提取量的影响。
[0047] 准确称取50g的绿豆粉碎，过80目筛后，与石油酸按固液比1:2浸泡1天除脂，烘干。 将烘干后的样品放入IOOmL烧杯中，加入pH7.0憐酸盐缓冲溶液，按照一定的料液比、在一定 提取溫度下、揽拌提取一定时间后，离屯、收集上清液。
[004引分别考察料液比1:4、1:6、1:8、1:10; W及提取时间40°C、50°C、60°C、70°C ;揽拌提 取时间30mins、60mins、90mins、120mins;通过建立正交分析表来考察因素和指标。
[0049] 结果表明（如图1-图3所示）：在料液比1:8，提取时间90mins，提取溫度40°C时，提 取效果较好。
[0050] (2)硫酸锭浓度比对绿豆蛋白提取量的影响。
[0051] 采用上述优选条件处理后的上清液，进一步用一定浓度硫酸锭盐溶液进行盐析， 得到绿豆蛋白粗提液。该硫酸锭盐溶液，是在已知上清液的体积后添加一定质量的硫酸锭， 从而形成已知硫酸锭盐溶液。
[0化2] 其中，硫酸锭盐溶液调节到50 %、60 %、70 %、80%、90 %后，待沉淀物不再产生，离 屯、收集沉淀，冷冻干燥，计算冻干后重量。
[0053] 结果表明（如表1所示）：80%硫酸锭盐溶液所得的沉淀量最高达到12.33%，经过 透析冻干后体外胆酸盐结合率可达37.93 %。
[0054] 表1为硫酸锭盐溶液浓度对绿豆沉淀量的影响。
[0化5]
[0化6]
[0057] 实施例2静态吸附确认离子交换层析缓冲液体系的最适pH值
[0058] 分别加入一定量的DEAE-琼脂糖凝胶FF介质和一定体积的PH值的憐酸盐缓冲溶 液，充分揽拌平衡后静置15min，吸去上清液，重复3次。向层析介质中再加入相同体积的憐 酸盐缓冲液待平衡后，加入一定体积的已知浓度的绿豆粗提液，充分揽拌吸附后，静置 30min，用考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白含量。
[0059] 分别选取抑值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的憐酸盐缓冲溶液，进 行静态吸附方法，静置30min后测定上清液中的蛋白含量，比较不同pH值对介质吸附蛋白的 影响。
[0060] 吸附率/% = (pl-p2)/plX100
[0061] Pl为吸附液的初始质量浓度/(mg/mL);p2为吸附平衡后吸附液中的平衡质量浓 度/(mg/mL)
[0062] 结果表明（如表2所示）：pH值为7.5时DEAE-S邱harose Fast Flow介质对绿豆蛋白 的吸附率达到最高为83.62%，此后吸附率呈缓慢下降。因此，通过实验可W确定：采用 DEAE-琼脂糖凝胶FF作为填料的阴离子交换层析缓冲液体系的最适pH值为7.5。
[0063] 表2为不同pH值对介质吸附蛋白的影响。 「OOAAl
[0065] ~实施例3绿豆蛋白阴离子交换层析
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[0066] (1)取DEAE-琼脂糖凝胶FF(GE公司生产，货号17-0709-01)作为填料，装柱，用 pH7.5憐酸盐缓冲溶液洗脱，流速为0.5ml/min，洗脱过夜直至检测线平衡。
[0067] (2)将绿豆蛋白粗提液用水溶解，12000r离屯、后上柱，WpH7.5憐酸盐缓冲溶液洗 脱1倍柱体积，再W0-2N氯化钢溶液梯度洗脱2-3倍柱体积。该憐酸盐为憐酸氨二钢和憐酸 二氨钢的混合溶液。洗脱流速为:2ml/min，洗脱液4ml/瓶。
[0068] 实施例4水溶性蛋白对胆酸盐的吸附能力确认目的蛋白
[0069] 经过DEAE-Sepharose Fast Flow,pH值为7.5憐酸盐缓冲液-氯化钢系统洗脱，收 集280nm检测线的出峰(洗脱峰），共3个。分别收集至Ij3个洗脱峰，命名为峰1、峰2和峰3。将峰 1、峰2和峰3分别装入透析袋，4°C过夜透析脱盐(透析过夜的时间为8-12h，需要进行流水透 析），冻干成粉末备用。
[0070] 通过测定体外胆酸结合率，来确认有效洗脱峰，也即绿豆纯化蛋白。
[0071] 结果表明（如图3和表3所示）：在3个洗脱峰中，峰1的体外胆酸结合率最低，为 12.85% ;峰2的体外胆酸结合率为42.27，而峰3的体外胆酸结合率最高，可达达到56.30%。
[0072] 夫3为水溶忡蛋白对化酸盐的吸附能力。
[0073]
[0074] 上述的结果表明，峰3与体外胆酸的结合率最高，是本发明的目的蛋白。峰1和峰2 可通过进一步纯化，获得更高的体外胆酸结合率，从而使峰1和峰2得到进一步的利用，实现 绿豆资源的利益最大化。
[0075] 虽然本发明已W实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人 员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范 围由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，包括以下步骤： 1) 取清洗干净的绿豆，粉碎过筛，浸泡除脂，烘干，磷酸盐缓冲液提取，离心收集上清， 盐析，得绿豆蛋白粗提液； 2) 将步骤1)得到的绿豆蛋白粗提液进行阴离子交换层析，分别收集280nm检测线的洗 脱峰； 3) 将步骤2)得到的洗脱峰分别进行体外胆酸结合率测定，收集结合率最高的目的峰， 即为目的蛋白。2. 根据权利要求1所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，所述制 备方法包括以下步骤： 1) 取清洗干净的绿豆，粉碎过筛，石油醚浸泡除脂，烘干，加入pH7. O磷酸盐缓冲液提 取，离心收集上清，硫酸铵盐溶液盐析，得绿豆蛋白粗提液； 2) 将步骤1)得到的绿豆蛋白粗提液进行阴离子交换层析，分别收集280nm检测线的洗 脱峰，透析脱盐，冻干成粉末； 3) 将步骤2)得到的粉末分别进行体外胆酸结合率测定，收集结合率最高的目的峰，BP 为目的蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，所 述步骤1)具体为： 11) 将清洗干净的绿豆粉碎，过80目筛，按固液比1:2加入石油醚，浸泡24h除脂； 12) 烘干后，按料液比1:4-1:10加入pH7.0磷酸盐缓冲液，提取，温度为40-70 °C，搅拌 30-120min，离心后收集上清液； 13) 用浓度多50%的硫酸铵盐溶液进行盐析，至不产生沉淀为止，得绿豆蛋白粗提液。4. 根据权利要求1或2所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，所 述步骤2)的纯化方法包括： 21) 选用DEAE-琼脂糖凝胶FF作为阴离子交换层析的柱填料，对填料进行预处理； 22) 将绿豆粗提物溶解，12000r离心，得蛋白溶液，上柱，以pH7.5磷酸盐缓冲溶液洗脱1 倍柱体积，再以0-2M氯化钠溶液梯度洗脱2-3倍柱体积； 23) 在氯化钠溶液梯度洗脱过程中，收集280nm检测线的多个洗脱峰，分别装入透析袋， 4°C过夜透析脱盐，冷冻干燥成粉末； 24) 将步骤23)得到的洗脱峰的粉末分别进行体外胆酸结合率测定，其中结合率最高的 粉末，即为具有降血脂功效的绿豆蛋白。5. 根据权利要求3所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，步骤 12) 的料液比为1:8;提取时间为90min;提取温度40°C ;离心条件为:3500r、15min、4°C离心。6. 根据权利要求3所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，步骤 13) 中，用80%硫酸铵盐溶液进行盐析，至不产生沉淀为止，得绿豆蛋白粗提物。7. 根据权利要求3所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，所述硫 酸铵盐溶液，是在已知上清液的体积后添加一定质量的硫酸铵，从而形成已知硫酸铵盐溶 液。8. 根据权利要求4所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，步骤 21)的预处理的方法为:将填料装柱后，用pH7.5磷酸盐缓冲溶液洗脱，流速为0.5ml/min，洗 脱过夜直至检测线平衡。9. 根据权利要求4所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，步骤 22) 的洗脱流速为:2ml/min，洗脱液4ml/瓶;所述磷酸盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合 溶液。10. 根据权利要求4所述的具有降血脂功效的绿豆蛋白的制备方法，其特征在于，步骤 23) 中，透析过夜的时间为8-12h，所述透析袋4°C过夜透析脱盐需要进行流水透析;所述冷 冻干燥的温度为_40°C，真空力200mTorr。
【文档编号】C07K1/18GK105924498SQ201610524319
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】任贵兴, 么杨, 桑伟
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所