免疫共刺激分子vsig4激活性表位肽、单克隆抗体及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肽、单克隆抗体及其制备方法和应用，其表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示，将表位肽重组表达后免疫小鼠能够发生免疫反应，表明表位肽具有免疫原性，利用表位肽的免疫原性制备杂交瘤细胞，然后获得单克隆抗体，获得的单克隆抗体具有刺激效应，能活化巨噬细胞，为肝脏相关性疾病的潜在药物。CCTCC NO：C20163120160421
【专利说明】
免疫共刺激分子VSIG4激活性表位化、单克隆抗体及其制备方 法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤、单克隆 抗体，还设及单克隆抗体的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肝脏是一个特殊的免疫器官，它既接受自胃肠道汇流入口静脉的静脉血，又接受 来自肝动脉的循环血，运使得肝脏所接触的抗原种类丰富多样，其中包括消化吸收的食物 成分，部分自身代谢产物，还可能含有自胃肠道入侵的病原微生物。运些抗原物质均可被肝 脏局部的抗原递呈细胞递呈给肝脏内的T细胞，导致免疫应答或者免疫耐受的产生。研究表 明，肝脏局部易发生针对某种抗原的免疫耐受，因此不会对食物成分和自身代谢组分产生 免疫应答，避免了自身免疫性疾病的发生。然而，一些病原体也正是利用了肝脏的运一特 性，使肝脏局部T细胞不能有效将其清除，导致感染慢性化，如慢性皿V和HCV感染。
[0003] 肝脏局部特殊的微环境是肝脏易发生免疫耐受的根本原因。肝脏有其独特的细胞 组成，如肝脏内含有丰富的肝血窦内皮细胞化SEC)、Kupffer细胞、星形细胞等特殊的细胞 群体，运些细胞除了自身的功能外均可作为抗原递呈细胞参与肝脏局部的细胞免疫应答。 研究表明，运些具有抗原递呈潜能的细胞群体并不是激发T细胞产生免疫应答而是倾向于 诱导其产生免疫耐受。其具体的机制有多篇报道，有研究认为是因为运些抗原递呈细胞表 面表达的共刺激分子和MHC分子水平低下，有些认为是因为细胞内合成了可抑制免疫应答 的物质如N0、PGE2等，还有研究认为运些抗原递呈细胞可表达大量共抑制信号，导致与其相 互作用的T细胞功能受抑。近来，共抑制信号在其中所起的作用越来越受到人们的关注。
[0004] 在T细胞活化机制中，共信号的作用一直是人们关注的热点。共信号分子是一类细 胞膜表面分子，可为T细胞的活化提供辅助信号，从而调节细胞增殖、活化及分化。而缺乏共 信号的抗原刺激易引起T细胞的耐受（To Ierance )、无反应性（Anergic)和细胞调亡 (Apoptosis)。根据介导的效应可W将共信号分子分为共刺激信号和共抑制信号，其中 CD28/B7-l(B7-2)、IC0S/GL50、4-lBB/4-lB化等共刺激信号介导的正向信号能促进T细胞应 答，协同活化T细胞，而CTLA-4/B7-1 (B7-2)、PD-1/PD-L1 (PD-L2)和BTLA/HVEM等共抑制信号 则介导负性信号，可抑制T细胞过度活化W造成病理损伤。前面提到，肝脏的免疫耐受特性 部分源于共抑制信号作用过强，特别是在皿V、HCV等肝脏慢性感染性疾病中。研究表明，在 慢性皿V感染患者肝组织内存在大量PD-I阳性的T细胞，而LSEC、Kupffer细胞W及肝脏内的 DC等抗原递呈细胞表面可表达大量的PD-Ll，二者结合后为T细胞提供抑制信号，使其不能 有效清除病毒，体外实验提示阻断PD-1/PD-L1途径则可逆转T细胞的免疫耐受状态。说明共 抑制信号在诱导肝脏的免疫耐受中发挥重要作用。
[0005] VSIG4是新近鉴定的对T细胞的活化及存活有重要调节作用的B7家族共刺激分子， 又称补体受体 Ig超家族分子（Complement receptor of the immunoglobul in 3啡6打过111。7，〔民1容）或1容超家族蛋白-39(之391容）。￥5164为单链1型跨膜糖蛋白，膜外区有 IgV及IgC2结构并存在25个氨基酸组成的跨膜区及细胞质尾。人VSIG4mRNA主要表达于肺 部、胎盘组织及关节滑膜，而VSIG4蛋白则在肝脏中高表达。功能研究证实，VSIG4可作为补 体C3b/iC3b的受体。肝脏kupffer细胞表达Z39Ig可有效地吞隧经补体C3b调理的病原体如 单核细胞增多性李司式（氏）菌化isteria monoc^ytogenes)及葡萄球菌（Staphylococcus aureus)。最近的研究显示，可溶性Z39Ig分子可交联其尚未知的受体分子抑制T细胞活化， 发挥共抑制分子配体的功能，且其对T细胞的抑制作用强于PD-Ls/PD-1途径。与其他共抑制 分子不同的是，VSIG4特异表达于组织的巨隧细胞表面，特别是肝脏Kupffer细胞表面，而外 周血细胞表达缺如。研究发现VSIG4可能通过促使巨隧细胞表达炎症相关基因，从而参与了 炎症性疾病如动脉粥样硬化和类风湿性关节炎的发病。此外，我们最近的研究发现VSIG4参 与了肝脏免疫耐受的形成，在皿V感染介导的肝炎中可能发挥关键作用。基于此，针对VSIG4 设计激活性抗体，所获得的抗体可通过VSIG4向巨隧细胞传递激活信号，从而活化巨隧细 胞，因此有可能可打破肝脏免疫耐受状态，为清除病毒感染、肝癌的发生及进展等肝脏相关 性疾病提供了新的治疗手段及策略。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤，采用 DNAstar软件结合IEDB网站上有关于B细胞表位预测工具获得;本发明的目的之二在于提供 所述的免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤制备的单克隆抗体，具备激活效应;本发明的目 的之S在于提供免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤制备的杂交瘤细胞，能够分泌单克隆 抗体;本发明的目的之四在于提供所述杂交瘤细胞的制备方法;本发明的目的之五在于提 供免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤制备的单克隆抗体在制备巨隧细胞免疫共刺激分子 中的应用;本发明的目的之六在于提供免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤制备的单克隆 抗体在制备特异检测VSIG4蛋白的试剂中的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[000引1、免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤，所述表位肤的氨基酸序列如SEQ ID N0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、WQIDN0.5、WQIDN0.6、SEQIDN0.7、SEQIDN0.8、 沈Q ID NO.9、SEQ ID NO. 10、沈Q ID NO. 11、沈Q ID NO. 12或沈Q ID NO. 13所示。
[0009] 优选的，所述表位肤的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO.4、 沈910備.5、56910備.6、56910備.8、56910備.9或沈910備.12所示。
[0010] 优选的，所述表位肤的氨基酸序列如沈Q ID NO. 12所示。
[0011] 2、所述的免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤制备的单克隆抗体。
[0012] 优选的，所述单克隆抗体为SEQ ID NO. 12所示表位肤制备的单克隆抗体VSIG4- 11。
[OOU] 3、利用所述免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤制备的杂交瘤细胞。
[0014] 优选的，所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC NO:C201631。
[0015] 4、所述杂交瘤细胞的制备方法，包括如下步骤:将免疫共刺激分子VSIG4激活性表 位肤通过重组表达，经纯化后免疫鼠龄为8~12周的雌性BALB/c健康小鼠，然后取免疫反应 小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合后的细胞经过稀释，分置于96孔培养板中 培养，培养10-14天后进行化ISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆，获 得杂交瘤细胞。
[0016] 5、所述免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤制备的单克隆抗体在制备巨隧细胞免 疫共刺激分子中的应用。
[0017] 6、所述免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤制备的单克隆抗体在制备特异检测 VSIG4蛋白的试剂中的应用。
[0018] 优选的，所述试剂为化ISA、蛋白印迹(western-blot)或免疫巧光检测试剂。
[0019] 本发明的有益效果在于:免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肤、单克隆抗体及其制 备方法和应用，免疫共刺激分子VSKM激活性表位肤采用DNAstar软件结合IEDB网站上有关 于B细胞表位预测工具，对其胞外区进行表位预测，获得12个具有潜在活性的B细胞功能表 位肤;然后使用全基因合成方法合成表位肤的DNA序，构建质粒并经大肠杆菌合成表位肤， Ni2+亲和层析柱和SP离子交换柱纯化，最后过S邱hadexG200分子筛纯化获得大量的得到蛋 白抗原用于免疫;将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8~12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。 取免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，融合后的细胞经过适当 稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行化ISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进 行有限稀释法亚克隆，获得杂交瘤细胞;对杂交瘤分泌的单克隆抗体进行功能鉴定，获得第 11号单克隆抗体(命名为VSIG4-11)其可应用于化ISA、蛋白印迹(western-blot)、免疫巧光 检测。将验证该抗体具备刺激活性，其可促进表达VSIG4的RAW264.7细胞IL-6的分泌，该抗 体为首次获得了具有刺激效应的VSIG4单克隆抗体VSIG4-11，可W应用于化ISA、蛋白印迹 (western-blot)及免疫巧光检测等其他领域，可应用于商业化开发。
【附图说明】
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0021] 图1为小鼠腹水进行纯化的单克隆抗体VSIG4-11的Western-blot分析结果（其中 W)a为蛋白质分子量，泳道1为WT野生型小鼠脾脏蛋白组织标本，泳道2为蛋白质Marker,泳 道3为VSIG4K0小鼠肝蛋白组织标本，泳道4为WT野生型小鼠肝脏蛋白组织标本，泳道5为蛋 白质Marker,泳道6为VSIG4K0小鼠腹腔巨隧细胞蛋白组织标本，泳道7为WT小鼠腹腔巨隧细 胞蛋白组织标本）。
[0022] 图2为小鼠腹水进行纯化的单克隆抗体VSIG4-11的Western-blot分析结果（其中 泳道1为WT野生型小鼠骨髓来源的巨隧细胞MO蛋白组织标本，泳道2为WT野生型小鼠骨髓来 源的巨隧细胞Ml蛋白组织标本，泳道3为WT野生型小鼠骨髓来源的巨隧细胞M2蛋白组织标 本)。
[0023] 图3为单克隆抗体VSIG4-11的免疫巧光分析结果。
[0024] 图4为单克隆抗体VSIG4-11的细胞刺激活性分析(Ab20:抗体浓度为20iig/mL Ab40:抗体浓度为40μg/ml^;Control:对照小鼠 IgGl抗体）。
[00巧]图5为单克隆抗体VSIG4-11刺激RAW264.7细胞IL-6巧光定量结果。
[00%]生物材料保藏
[0027]本发明中杂交瘤细胞株VSIG4-11送中国典型培养物保藏中屯、保藏，保藏编号为 CCTCC N0:M 2012223,地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2016年4月21日，分类命名 为杂交瘤细胞株VSIG4-11。
【具体实施方式】
[0028] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第=版，J.萨姆布鲁克等著） 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0029] 实施例1、小鼠 VSIG4胞外区B细胞表位预测
[0030] 1)首先进入NCBI系统，获得小鼠 VSIG4基因的相关信息，结果显示小鼠 VSIG4NCBI 注册号为:GenBank: AA 肥 5105.1;
[0031] 2)获取小鼠 VSIG4细胞外区的蛋白质氨基酸序列，共203个氨基酸，具体序列如下： MEISSGLL 化 GHLIVLTYGHPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYD 化 RGYRQVLVKWLV 畑 GSDSVTI 化畑 STGDHI Qqakyrgrlkvshkvpgdvslqiwlqmddrnhytcevtwqtpdgnqviwkiielrvrkynpprinteapttlhss LEATTIMSSTSDLTTNGTGKL邸TIAGSG歴LPIFAIIFIISLCCIVAV(沈Q ID N0.1)。
[0032] 3)将去除信号肤后的小鼠 VSIG4胞外区氨基酸序列引入DNAstar软件结合IEDB网 站上有关于B细胞表位预测工具，针对VSIG4的胞外区预测B细胞抗原肤。根据评分结果，筛 选到12条获选的多肤，运些多肤有可能应用于抗体的生产，运些表位多肤的氨基酸序列如 表1所示：
[0033] 表UVSIG4预测的B细胞抗原肤 r〇034l
[0035] 实施例2、小鼠 VSIG4胞外区B细胞表位肤表达与纯化
[0036] 使用全基因合成方法合成编码SEQ ID NO. 2~SEQ ID NO. 13所示表位肤的DNA序 列，两端分别加入EcoR I和BamH I酶切位点，与PCDNA3.U + )构建重组表达质粒，并转化大 肠杆菌分别诱导表位肤表达，表达的表位肤用Ni2+亲和层析柱和SP离子交换柱纯化，然后过 S巧hadexG200分子筛纯化获得大量的蛋白抗原。
[0037] 将纯化获得的抗原混合后免疫鼠龄为8~12周的雌性BALB/c健康小鼠，取免疫反 应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分别 置于96孔培养板中培养，培养10~14天进行化ISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限 稀释法亚克隆，获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，使用隧菌体肤呈递技术，鉴定各杂交瘤 分泌抗体所识别的抗原肤。具体表位如表2所示。结果显示，获得的15株单克隆抗体均可进 行化ISA反应，并且抗体效价大于IOOK。
[0038] 表2、可进行化ISA反应的单克隆抗体记表位 「00901
L〇〇4〇」对所获得的单克隆抗体进行了功能鉴定，结果发现第11号表位肤产生的单克隆抗 体(命名为VSIG4-11)可应用于化ISA、蛋白印迹(western-blot)、免疫巧光检测，其对应的 杂交瘤细胞命名为:VSIG4-11。
[0041 ] 实施例3、单克隆抗体VSIG4-11的Western-blot分析及验证
[0042] 1)巨隧细胞蛋白质的提取(针对原代培养的巨隧细胞）：
[0043] (1)分别将V SIG 4 K 0小鼠和野生型小鼠原代培养的巨隧细胞去除培养基，W 1 m L PBS洗两次；
[0044] (2)加入I(K)化蛋白裂解液，用移液器吹打几下，使裂解液和细胞充分接触，其中蛋 白裂解液由RIPA裂解液(Radio-Immunoprecipitation Assay)与蛋白酶抑制按体积比为9: 1组成；
[0045] (3)轻轻摇匀5~IOmin后置于冰上静置裂解化；
[0046] (4)1400巧111、4°[离屯、15111；[]1，上清为蛋白质样品。
[0047] 2)肝组织蛋白质的提取：
[004引分别取VSIG4K0小鼠和野生型小鼠肝组织，破碎后，加入10化L蛋白裂解液，并使用 匀浆器对组织蛋白进行裂解，轻轻摇匀5~IOmin后置于冰上静置裂解比，140化pm、4°C离屯、 15min，上清为蛋白质样品，其中蛋白裂解液由RIPA裂解液(Radio-Immunoprecipitation Assay)与蛋白酶抑制按体积比为9:1组成。
[0049]按照相同的方法提取野生型小鼠的脾脏组织蛋白。
[00加]3)蛋白定量：
[0051] (I)WO.SmL蛋白标准品稀释液稀释蛋白标准品（20mg BSA)，使之终浓度为25mg/ mL;
[0052] (2)取10化的25mg/mL蛋白标准品用490化PBS稀释至终浓度为0.5mg/mL
[0053] (3)配置BCA工作液:取5mL BCA试剂A加100化BCA试剂B(50:1)，充分混匀；
[0化4] (4)将0.5mg/mL的标准品按化L，化L，化L，化L，祉L，12化，1化L，20化依次加入到96 孔板的标准品孔中，用PB巧h足体积至20化；
[0055] (5)将化L样品到96孔板的样品孔中，用PB巧h足体积至20化；
[0056] (6)每孔加入200化BCA工作液，37r放置20-30分钟；
[0057] (7)用酶标仪在A562波长测定OD值，利用标准曲线求出样品的蛋白浓度。
[005引 4)SDS-PAGE 电泳
[0化9] (1)取I(K)化蛋白质样品加入25化的5 X SDS上样缓冲液混匀，煮沸6min，冷却至室 溫；
[0060] (2)加样:按15]ig的蛋白上样，同时加化L的预染蛋白Marker;
[0061 ] (3)在电泳槽中加入200mL的电泳缓冲液，1OOV电压开始电泳，待漠酪蓝到达底部 时结束；
[0062] (4)转膜(本实验用半干转法）：电泳结束后，将胶切角标记，浸泡在转膜缓冲液中， 在室溫（18~25°C )平衡15min; W100%甲醇活化PVDF膜30s，转入纯水中浸润3min，最后置 于转膜缓冲液中平衡15min;组装转膜=明治:从下到上依次放入2层滤纸、膜、凝胶、2层滤 纸(膜的面积要小于滤纸，大于胶）；按膜面积的80%设置电流，恒流转移蛋白60min;
[0063] (5)封闭：转膜结束后，取下PVDF膜，TBS洗2次，每次5min，加入5 %脱脂奶粉，室溫 (18~25°C)平缓摇动化(背景高则4°C封闭过夜）；
[0064] (6)抗体的解育：封闭结束后，W TBST清洗PVDF膜(慢速），每次1 Omin，共3次。加入 一抗工作液：用质量百分比为5 %的封闭奶粉按体积比为1: 500稀释一抗VSIG4-11，4°C过 夜，第二天WTBST清洗PVDF膜，每次IOmin，共3次；加入二抗工作液：用TBST 1:10000或1: 20000稀释二抗（山羊抗小鼠 IgGl-HRP),解育化后，WTBST清洗PVDF膜(快速），每次lOmin， 共3次；
[0(?日](7)加入ECL显色试剂，在凝胶成像仪上进行显色。
[0066] 实验结果如图1所示。结果显示，单克隆抗体VSIG4-11可与野生型小鼠肝脏组织及 原代培养的巨隧细胞进行Western-blot反应，分子量大小为50Kd，特异性好。表明单克隆抗 体VSIG4-11可W与WT野生小鼠的肝脏及腹腔巨隧细胞的VSIG4特异结合。
[0067] 将单克隆抗体VSIG4-11分别与WT野生型小鼠骨髓来源的巨隧细胞MO、M1和M2蛋白 组织标本进行Western-blot分析，结果如图2所示。结果显示，单克隆抗体VSIG4-11对WT野 生型小鼠骨髓来源的巨隧细胞M0、M1和M2蛋白组织标本都有阳性反应。表明单克隆抗体 VSIG4-11可W与骨髓来源的巨隧细胞的VSIG4特异结合。
[006引实施例4、单克隆抗体VSIG4-11的免疫巧光分析及验证
[0069] 1)细胞爬片免疫巧光检测分析：
[0070] (1)转染了 VSKM基因的Raw264.7细胞，在6孔培养板中培养。将已爬好细胞的玻片 用PBS浸洗3次，每次3min;
[0071] (2)用质量分数4%的多聚甲醒固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min;
[0072] (3)用体积分数为0.5%的Triton X-100(PBS配制)室溫（18~25°C)通透20min;
[0073] (4 )PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室 溫（18 ~25°C)封闭 30min;
[0074] (5)吸水纸吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量W体积比为1:100稀释的单克隆抗体 VSIG4-11并放入湿盒，4°C解育过夜；
[0075] (6)次日加入巧光二抗:PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体 后滴加1:200稀释好的二抗巧55-山羊抗小鼠 IgGl),湿盒中20~37°C解育化，PBST浸洗切片 3次，每次3min;
[0076] (7)复染核：滴加 DAPI避光解育5min，对标本进行染核，PBST 5minX4次洗去多余 的DAPI;
[0077] (8)用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗巧光泽灭剂的封片液封片，然后在巧光显 微镜下观察采集图像。
[0078] 结果如图3所示，结果显示，该单克隆抗体VSIG4-11可与转染了 VSIG4的Raw264.7 细胞进行特异性反应，且效果好。
[0079] 2)膜腺组织免疫巧光监测分析：
[0080] (1)小鼠膜腺组织经石蜡包埋，切片成2皿的切片；
[0081] (2)石蜡切片顺序乙醇脱水二甲苯脱蜡；
[0082] (3)抗原修复:使用IOiiM的瞩祿酸钢抗原修复液对标本进行抗原微波修复，修复时 间为IOmin;
[0083] (4)去除内源性过氧化物酶活性:使用体积分数为0.03%双氧水消除内源性过氧 化物酶活性，室溫（18~25 °C)解育IOmin;
[0084] (5)消除非特异性背景染色:滴加正常山羊血清封闭液(PBS稀释)室溫（18~25°C) 封闭20min，甩去液体，无需再洗片；
[0085] (6)滴加一抗：1:100稀释的VSIG4-11抗体，4°C过夜，之后37°C复溫30min，37°C解 育化，PBS洗片3min;
[0086] (7)滴加巧光素标记的二抗(1:200稀释），37°C解育30min;
[0087] (S)PBS 洗片 3 次，每次 5min;
[0088] (9)甘油缓冲液封片、镜检。
[0089] 实验结果如图4所示，结果显示，单克隆抗体VSIG4-11可与小鼠膜腺组织的膜岛细 胞进行特异性反应，且效果好。
[0090] 实施例5、单克隆抗体VSIG4-11的细胞刺激功能分析及验证
[0091 ]转染了VSIG4的小鼠巨隧细胞系RAW264.7细胞培养于6孔板内，待细胞70%长满孔 底，使用浓度分别设20iig/mL及40iig/mL的小鼠 VSIG4-11抗体刺激细胞，同时W小鼠 IgGl同 型对照抗体作为阴性对照。刺激24h后进行qPCR实验，检测IL-6的转录水平，qPCR使用的引 物如下：
[0092]
[0093] 将qPCR所获得的CT值采用计算相对表达量，结果如图5所示。结果显示，单克 隆抗体VSIG4-11可刺激表达VSIG4的RAW264.7细胞上调表达IL-6特别是在抗体浓度为40y g/ml的条件下，其刺激效果更佳，表明单克隆抗体VSIG4-11具有激动效应。
[0094] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肽，其特征在于:所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQIDN0.9、SEQIDN0.10、SEQIDN0.11、SEQIDN0.12SSEQIDN0.13m*。2. 根据权利要求1所述免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肽，其特征在于:所述表位肽 的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDN0.8、SEQIDN0.9SSEQIDN0.12K*。3. 根据权利要求1所述免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肽，其特征在于:所述表位肽 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示。4. 权利要求1~3任一项所述的免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肽制备的单克隆抗 体。5. 根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于:所述单克隆抗体为SEQ ID NO. 12所 示表位肽制备的单克隆抗体VSIG4-11。6. 利用权利要求1~3任一项所述免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肽制备的杂交瘤细 胞。7. 根据权利要求6所述的杂交瘤细胞，其特征在于:所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为 CCTCC NO:C201631。8. 权利要求6或7所述杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:将免疫共刺 激分子VSIG4激活性表位肽通过重组表达，经纯化后免疫鼠龄为8~12周的雌性BALB/c健康 小鼠，然后取免疫反应小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合后的细胞经过稀 释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天后进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进 行有限稀释法亚克隆，获得杂交瘤细胞。9. 权利要求4或5所述免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肽制备的单克隆抗体在制备巨 噬细胞免疫共刺激分子中的应用。10. 权利要求4或5所述免疫共刺激分子VSIG4激活性表位肽制备的单克隆抗体在制备 特异检测VSIG4蛋白的试剂中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK105924515SQ201610259776
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】陈永文, 吴玉章, 郭晟, 杨承英
【申请人】中国人民解放军第三军医大学