猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白及其应用
【专利摘要】本发明提供猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白及其应用，尤其涉及猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白作为猪囊尾蚴病检测抗原的应用和猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用。本发明的猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白能够特异性诊断猪囊尾蚴病，而与猪细颈囊尾蚴、旋毛虫等寄生虫病无任何交叉反应。
【专利说明】
猪带练虫TsSerpin B6重组蛋白及其应用
技术领域
[0001 ] 本发明设及猪带缘虫TsSe巧in B6重组蛋白及其应用，尤其设及TsSe巧in B6重组 蛋白作为猪囊尾蝴检测抗原的应用和TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蝴病检测试剂盒 中的应用。
【背景技术】
[0002] 囊虫病(Cysticercosis)是由猪带缘虫(Taenia solium)幼虫寄生在人和猪的皮 下、肌肉和脑等部位引起的一种食源性的人兽共患寄生虫病。该病不但对养猪业造成巨大 经济损失，而且严重威胁着食品安全和人类健康。研究发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂在蠕虫寄 生宿主免疫调节中扮演着重要角色，病原体的丝氨酸蛋白酶抑制剂通过干扰宿主免疫调节 信号来抑制宿主免疫系统的激活。因此，研究猪带缘虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的免疫调节功 能，无疑将为阐明猪带缘虫在感染宿主过程中的免疫逃避机制和探索新的诊断和疫苗抗原 具有指导意义。
[0003] 丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)是一类重要的结构相似、功能多样的球状蛋白酶抑 制剂超家族，真核生物、细菌、病毒、古细菌中都发现存在Se巧in基因。Serpins参与很多重 要的生理活动，例如信号传导，血凝、纤维蛋白溶解、炎症反应W及补体激活等，在调节内源 性蛋白酶和外源性蛋白酶中均发挥着重要作用。不仅如此，Se巧ins还在寄生虫入侵宿主过 程中也发挥着重要作用。寄生蠕虫的Serpins通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶活性，使其免受宿 主体内蛋白水解酶类的降解，从而逃避宿主的免疫攻击。已有研究表明，从咖虫、钩虫等寄 生虫分离的丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制膜蛋白酶、糜蛋白酶等肠道消化酶活性。埃及血吸 虫通过虫体表面丝氨酸蛋白酶抑制剂因子与人的膜蛋白酶相结合来降低自身的免疫原性， 从而逃脱宿主的免疫攻击。Mercke化ach等在多房棘球缘虫发现经原核表达的丝氨酸蛋白 酶抑制剂能抑制膜蛋白酶，糜蛋白酶及弹性蛋白酶活性，推测多房棘球缘虫能够抵抗宿主 肠道消化酶对虫体的损伤，W此逃避宿主的免疫攻击。因此，Serpin有望成为重要的疫苗和 诊断抗原候选分子。开展猪带缘虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的相关研究将有助于阐明猪带缘虫 免疫逃避机制，为研发新型疫苗、诊断制剂和药物提供理论基础。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有猪囊尾蝴病诊断技术中存在的交叉反应问题，本发明提供了猪带缘 虫TsSe巧in B6重组蛋白及其应用，尤其设及TsSe巧in B6重组蛋白作为猪带缘虫/囊尾蝴 检测抗原的应用和TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蝴病检测试剂盒中的应用。
[0005] 本发明提供猪带缘虫TsSe巧in B6重组蛋白，所述猪带缘虫TsSe巧in B6重组蛋白 的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
[0006] 本发明还提供猪带缘虫TsSerpin B6重组蛋白作为猪带缘虫/囊尾蝴检测抗原的 应用;所述猪带缘虫TsSe巧in B6重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
[0007] 本发明还提供猪带缘虫TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蝴病检测试剂盒中的 应用;所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
[0008] 本发明还提供一种猪囊尾蝴病化ISA检测试剂盒，所述试剂盒中包被抗原为猪带 缘虫TsSerpin B6重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。
[0009] 作为优选，所述试剂盒中还包括HRP标记的兔抗猪IgG。
[0010] 本发明还提供一种猪带缘虫化ISA检测方法，所述方法不W专利法规定的疾病的 诊断和治疗为目的，W纯化的TsSe巧in B6重组蛋白化g于37°C包被酶标反应板化，封闭液 为1 % BSA，用PBST充分洗涂后分别加入待测样品和猪阴性血清，37 °C解育Ih，PBST洗涂S次 后，加入1: 5000倍稀释的皿P标记的兔抗猪IgG，充分洗涂后再加入DAB显色，用浓硫酸终止 反应后测定吸光度，P(阳性VN(阴性)〉2时，为阳性血清，反之，为阴性血清。
[0011] 本发明利用猪带缘虫基因组和转录组数据设计TsSerpin B6特异引物，W猪囊尾 蝴总RNA为模板，RT-PCR扩增TsSe巧in B6基因，并通过生物信息学分析进行鉴定。构建祀T- 30a-TsSerpin B6重组表达载体，在大肠杆菌化2UDE3)中进行诱导表达。纯化的目的蛋白 进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果为：TsSe巧in B6的ORF由1131个核巧酸组成， 编码376个氨基酸残基；其编码氨基酸具有Se巧ins较为保守的反应中屯、环(R化)和特征性 结构域，并且存在9个潜在的线性B淋己细胞抗原表位。TsSe巧in B6的表达产物主要W包涵 体形式存在，且可与猪囊尾蝴阳性血清发生反应，在53kDa处产生特异条带。W纯化的 TsSe巧in B6重组蛋白化g作为间接化ISA的诊断抗原，可特异性检测猪囊尾蝴阳性血清，而 与猪细颈囊尾蝴、猪旋毛虫、弓形虫无任何交叉反应。结论：所克隆的片段即为TsSerpin B6,其表达产物可作为猪囊尾蝴病化ISA诊断的特异性抗原。
【附图说明】
[0012] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[OOU]图1为猪囊尾蝴的SerpinBS基因的PCR扩增结果；其中，M: DNA分子质量标准； 1.SerpinB6;
[0014] 图2为TsSe巧in B6的S级结构预测；
[0015] 图3为TsSerpin B6部分序列与其他寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列对比；
[0016] 图4为不同物种Se巧ins的系统进化分析；
[0017]图5为TsSe巧in B6融合蛋白纯化结果；其中，M:蛋白质分子质量标准；l:50mM咪 挫；2:200mM咪挫；3:300mM咪挫；4:400mM咪挫；5: SOOmM咪挫；
[001引图6为TsSe;rpin B6融合蛋白Western-blotting结果，其中，M:蛋白质分子质量标 准；1:猪阴性血清;2:猪阳性血清。
【具体实施方式】
[0019] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0020] 实施例1
[0021 ] 1材料与方法
[0022] 1.1虫株与血清
[0023] 猪囊尾蝴、猪囊尾蝴阳性和阴性血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所蠕虫病 课题组保存。
[0024] 1.2 试剂
[00巧]质粒小量提取试剂盒、TRIzol Reagent、DNA胶回收试剂盒、pMD-T-19(simple) Vector、限制性内切酶Ba恤I、Hind III、T4DNA连接酶、均购自Takara公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、Prestained Protein Ladder均购自Hiermo公 司；大肠杆菌感受态细胞、pET-30a、异丙基-e-D-硫代半乳糖巧（IPTG)、X-Gal、5 X蛋白上样 缓冲液均购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗猪IgG(HRP)购自Sigma公司；Ni S巧harose 6化St Flow蛋白纯化试剂盒购自GE公司。
[0026] 1.3总RNA的提取及CDNA合成
[0027] 用TRIzol法提取猪带缘虫囊尾蝴的总RNA，WReve;rt Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第一链。
[002引1.4引物设计合成
[0029] 根据本课题组完成的猪带缘虫全基因组测序注释信息及转录组分析，并结合 GeneDB数据库公布的猪带缘虫SerpinBG的开放阅读框序列，利用软件Primer 5.0设计一对 特异性引物，上游引物加入B a m H I酶切位点，其序列为：5 ' - CGCGGATCCATGCTAGATGAATATTACTTTAATCACC-3' ;下游引物加入Hind III酶切位点，其序列 为：5 ' -CCCAAGCTTGGCAGGCCAGGGGAITGAC-3 '。引物送至江苏金唯智生物技术有限公司合成。
[0030] 1.5基因克隆和转化
[0031] W反转录的CDNA为模板，用TsSerpin B6基因特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体 系为：cDNA 0.5XPS Buffer IOiiUdNTP Mix 化L，上下游引物各化UEasy Taq酶化L， 补水至50化。PCR扩增程序如下：951：5111111;941：4〇3,671：4〇3,72°(：1111111，30个循环；721： IOmiriDPCR产物纯化后克隆入pMD-T-19simple载体，转化大肠杆菌D册a感受态细胞。选择单 克隆菌株进行PCR和酶切鉴定，阳性克隆送江苏金唯智生物技术有限公司测序。该扩增产物 的核巧酸序列为：
[0032] ATGCTAGATGAATATTACTTTAATCACCTGGTACTGTTCCCTCGAGGCTCGAAAAAAAACTGCTTCGTC TCACCACTGAGCATTTACTGCGGCTTGTCTTTGGCCCTCTCTGGGAGCTCCGGCAGATCACTTCATGAGATCGCTCA GGTCTTGCAGGTTCCTAAGCAGCAATTCAAGGATTACGACAGCATTTTAGCACATTTGGGTAGTCATCTGGATGCTG TTTCTGATGGAGATACCGGCAAAACCTTGGTTCTGGCAAACGGCCTTTTTTTGGAATCCACCATCGAGGTTAAGCAG CTCTTTAAAAAAGCCCTAGAAAAGCATTTCCATACAGATTTACATATGGTCGATTTCGCGTCAAACGCTGAGAAGGC CAGAAAGCAAATCAACGCCTGGGTCTCTGATCACACCTGCAAGAAGATCTCCGACCTCATGACTCGTGAATCCATCG ACAGTCAAACCCGCCTCGTTTTGGCTAATGCAATTTACTTTAAAGGTACTTGGAAGAATGTGTTTCACCGCGACGCA ACAACGGATTGGCCTTTTCAAACCCTTCATGACGGAGAGGTTCAGGTTCCAATGATGAATGACAATGGGGTCTATGA GATGTCTCGTTTCGATGAACTTAGCGCAACGGCACTAAAGATTCCCTTTAAATTCCATGAGATGCTTATCGTGTTAC CCGACGCAAAAGACGGTTTGATGGAGTTGTTGGAAAAGATATTCGACCCCAACCACATTTTGCGCTTCAAGGAGCTC TTCGACAAGAGCAAATACGACCCGAGCAGAGTGGAACTGCATCTACCCAAATTCAAACTTGGGGGTGTTGAAAGCCT GAATATGGAGAAACCGCTGTCTGCTATGGGTCTGGAGACTGTTTTTAACCATGATCACGCTGATTTCTCCCGCATTA CCAAGAAGGAAAAGTTGCACATCTCGAGTGTGGTTCATCAGGCTGTGATTGAGGTTAATGAGGAAGGAGCGGAGGCA GCAGCAGCAACTGGAATGGCCATTGCGCCCATGTGTCTGTGCCCAGATTTTACCGTAGATCATCCCTTTCTGTTCTT TATTGTCACCGAAACTGGTGTGCCCGCTTTCATAGGATATGTGGTCAATCCCCTGGCCTGA
[0033] 1.6 TsSe巧in B6基因的生物信息学分析
[0034] 利用在线软件预测并分析蛋白质的理论分子质量、氨基酸组成、信号肤、二级和= 级结构、B细胞抗原表位、结构域等。
[00巧]1.7 TsSe巧inB6蛋白的序列比对及系统进化分析
[0036] 用Bias巧软件将TsSe巧inB6的氨基酸序列与GenBank中的其他物种氨基酸序列进 行比对，利用MEGA 6.0软件中化St Maximum L化elihood Tree方法对选择的序列构建进化 树并分析。
[0037] 1.8重组表达载体构建及表达
[0038] 将鉴定正确的pMD19-T-TsSerpinB6及原核表达载体pET-30a质粒分别用BamH 1+ 化O I进行双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，对目的片段进行纯化回收。利用T4DNA连 接酶将目的片段与祀T-30a连接，并转化化2UDE3)感受态细胞，提取质粒进行PCR及酶切鉴 定，阳性克隆进行测序验证。
[0039] 取测序正确的阳性克隆菌液1:100接种于IOOmL LB(卡那抗性lOOmg/mL)液体培养 基中，37°C220r/min振荡培养至菌液ODs日血m=0.6-l时，加入100化500mmol/L的IPTG，37°C 22化/min振荡培养化。收集诱导表达的菌液进行SDS-PAGE分析。同时设置诱导前和祀T-30a 转化菌液的诱导表达产物作为对照。
[0040] 1.9重组蛋白的纯化及Western-blot分析
[0041 ] 取50mL诱导表达的菌液，800化/min离屯、15min，弃上清，加等体积的PBS重悬菌体 沉淀后，反复冻融3次。利用超声破碎仪处理菌体悬液20min，直至溶液澄清透亮。4°C， 1200化/min离屯、IOmin，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。利用儀NTA琼脂糖凝胶FF 在不同咪挫梯度下对目的蛋白进行纯化。纯化后的蛋白用猪囊尾蝴阳性血清进行Western- blotting 检测 。该纯化后的重组蛋 白的氨基酸序列为：
[0042] MLDEYYFNHLVLFPRGSKKNCFVSPLSIYCGLSLALSGSSGR 化肥 IAQVLQVPKQQFKDYDSILAHLGSHLDAVSD GDTGKTLVLANGLFLESTIEVKQLFKKALEKHFHTDLHMVDFASNAEKARKQINAWVSDHTCKKISDLMTRESIDSQ TRLVLANAIYFKGTWKNVFH 畑 ATTDWP 巧 TLHDGEVQVPMMNDNGVYEMSR 抑化 SATALIQPFKF 肥 MLIV …DA KDGLMELLEKI抑PNHILRFKELFDKSKYDPSRVEU1UKFKLGGVESLNMEKPLSAMGLETVFNHDHADFSRITKK 邸 UnSSVVHQAVKVNEEGAEAAAATGMAIAPMCLCPDFTVDHPFLFFIVTETGVPA門 GYVVNPLA*
[0043] 2 结果
[0044] 2.1 TsSe巧in B6基因的扩增及生物信息学分析
[0045] W猪囊尾蝴的CDNA为模板，通过PCR扩增，获得大小为113化P左右的片段，与预期 结果一致(图1)。
[0046] 2.2猪带缘虫TsSe巧in B6蛋白的生物信息学分析
[0047] TsSe巧in B6cDNA序列含有一个由113化P的开放阅读框，编码由376个氨基酸残基 组成的多肤，其理论分子质量为42.3kDa。亲水性分析表明，该蛋白为疏水性蛋白。 Predic巧rotein预测表明，在该蛋白二级结构中a螺旋占35.37%，巧斤叠25.27%，其余部分 为无规卷曲。螺旋结构和卷曲结构散布在整个蛋白分子中，构成了TsSerpin B6二级结构的 基本骨架。综合分析表明，TsSerpin B6蛋白的抗原表位可能主要位于氨基酸序列的第12~ 20、36~46、54~64、74~83、123~130、138~156、175~186、188~197、253~267位。 Motif Scan分析表明，TsSerpin B6可能存在1个潜在的cAMP和CGMP依赖性蛋白激酶憐酸化 位点、10个潜在的酪蛋白激酶憐酸化位点、5个潜在的N-豆違酷化位点、6个潜在的蛋白激酶 C憐酸化位点和1个潜在的酪氨酸蛋白激酶憐酸化位点。SMART分析显示，TsSerpin B6氨基 酸序列中7-343位为TsSe巧in B6结构域，具有Serpin蛋白的保守序列FXVDHP化FFI。 TsSerpin B6S级结构预测显示，该蛋白有13个a螺旋，15个0折叠，其余为无规卷曲（图2)。 其中 3276111，328617,32941曰，3306111;34743口，348曲6,349化'，350￥曰1，35143口，352化3， 353Pro是丝氨酸蛋白酶抑制剂均含有较为保守的反应中屯、环。
[004引2.3系统发育进化分析
[0049]通过同源序列相似性比较发现，TsSerpin B6与其他物种的Se巧ins拥有共同的活 性位点即Serpins反应中屯、环(R化），具有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员的特征性保守结 构:NAVYFKG 和DVNEEG (图 3)。
[0化0] 在图3中，红色下划线表示serpins特征性保守区序列，黑色方框表示serpins较为 保守的反应中屯、环。SMSchi Stosoma haematobium)，Emu(Echinococcus multilocularis)，SjB6(S.japonicum)，Smpi56and Sm2(S.mansoni)，Cs(Clonor chissinensis)，Pw(Paragonimus westermani)，He(Haemon chuscontortus)，Tv (Trichostrong ylusvitrinus)，Bml曰nd Bm2(Brugi曰 m曰I曰yi)。
[0051] 利用MEGA 6.0软件中Test Maximum Likelihood Tree方法构建系统进化树。结果 表明，TsSerpin B6与多房棘球缘虫的Serpin位于同一分支，亲缘关系最近，而与其他物种 的亲缘关系较远。结果如图4。化（Schi Stosoma haematobium) , EmiKEchinococcus multilocularis),SjB6(S.japonicum),Smpi56and Sm2(S.mansoni),Cs(Clonorchis sinensis),Pw(ParagonimuS westermani), He (Haemonchus contortus),Tv (TrichostrongyIus vitrinus),Bml曰nd Bm2(Brugi曰 m曰I曰yi)。
[0化2] 2.4重组菌株的表达与分析
[0化3] 重组质粒pET-30a-TsSe巧inB6经PCR鉴定和酶切鉴定均得到约113化P的片段，说 明成功构建了携带TsSe巧in B6基因的原核表达载体。用IPTG对祀T-30a-TsSe巧in B6重组 菌诱导表达，并经SDS-PAGE检测分析，在预期的53kDa附近出现蛋白目的条带，经超声破碎 后菌体SDS-PAGE分析结果表明，目的蛋白主要W包涵体形式存在。
[0化4] 2.5目的蛋白的Western-blot分析
[005日]8M尿素溶解包涵体沉淀，用Ni-NTA Purification System进行纯化。SDS-PAGE分 析表明，目的蛋白获得较好的纯化效果(结果如图5)。^纯化的TsSerpin B6重组蛋白为抗 原，进行Western-blot分析。结果显示，TsSerpin B6蛋白可与猪囊尾蝴阳性血清特异性反 应，说明TsSerpin B6蛋白具有良好的免疫反应性（图6)。
[0化6] 3讨论
[0057]丝氨酸蛋白酶抑制剂呈现构象多态性，功能多样性，它们大多数都属于非经典类 Kazal抑制剂家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂大多数为单链的糖蛋白，核屯、结构含有8-9个a-螺 旋和3个0折叠，主要标志性的结构是较为保守的反应中屯、环（reactive center loop , R化KR化结构是丝氨酸蛋白酶识别丝氨酸蛋白酶抑制的祀点，当RCL被丝氨酸蛋白酶识别 并被切开后，丝氨酸蛋白酶抑制剂的构象发生改变，从而引起丝氨酸蛋白酶的构象也发生 改变，导致酶的活性中屯、破坏，发挥抑制作用。同源序列比对显示，TsSerpin B6具有丝氨酸 蛋白酶抑制剂超家族成员的特征性保守结构:NAVYFKG和DVNEEG。系统进行分析也表明所获 得的序列与棘球缘虫Serp i n亲缘关系较近，说明本发明获得的序列即为猪带缘虫Serp i n B6基因。
[005引本发明利用生物信息学分析对TsSerpin B6蛋白进行预测，表明该蛋白N端不含信 号肤序列，可能为非分泌型蛋白。已有研究表明，Serpin基因家族成员既可胞内表达，也可 分泌到胞外。但仅仅根据TsSerpin B6缺乏信号肤序列就判定其为非分泌性蛋白可能不太 准确。因为已有研究表明，缘虫许多蛋白序列虽然缺乏信号肤序列，但在其囊液中都能检测 到该蛋白组分，说明运些蛋白即使没有信号肤仍然可分泌到细胞外。本发明在原核表达系 统中高效表达的TsSe巧in B6蛋白，虽然主要W包涵体形式存在，但可与猪囊尾蝴阳性血清 发生特异性反应，说明重组TsSe巧in B6具有良好的免疫反应性，而且该蛋白可能为分泌性 蛋白，可分泌到虫体外刺激宿主产生针对该组分的特异性抗体。W上结果表明TsSerpin B6 具有作为猪囊虫病血清学诊断候选分子的潜力。此外，通过对TsSerpin B6蛋白B淋己细胞 抗原表位的预测，表明该蛋白具有9个潜在的线性B细胞表位，说明TsSerpin B6还可能成为 新型疫苗研发的候选分子。
[0059] 现已研究证实，在蠕虫、原生动物和其他寄生虫中都存在丝氨酸蛋白酶抑制剂， Se巧ins在寄生虫-宿主相互作用过程中起着十分重要的作用，通过调节内源性蛋白酶和外 源性蛋白酶的作用，使寄生虫成功逃避宿主的防御机制。寄生虫在感染宿主的过程中，其丝 氨酸蛋白酶抑制剂可通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶的活性，从而使自身的蛋白酶免遭宿主降 解，逃避宿主免疫攻击。因此，进一步研究猪带缘虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在虫体入侵及寄生 过程中的功能和作用，将为阐明猪带缘虫入侵和免疫逃避机制，W及猪带缘虫新型疫苗和 生物药物的研发提供理论基础。
[0060] 实施例2基于重组抗原TsSe巧inB6的猪囊尾蝴病化ISA检测
[0061 ] W纯化的TsSe巧inB6 Iiig于37°C包被酶标反应板化，包被缓冲液为抑9.6的碳酸 盐缓冲液，包被抗原浓度为lOμg/ml，封闭液为1 %BSA，用PBST充分洗涂后分别加入倍比稀 释的猪阴性血清及猪囊尾蝴、猪细颈囊尾蝴、猪旋毛虫和猪弓形虫阳性血清，37°C解育化， PBST洗涂S次后，加入1:5000倍稀释的皿P标记的兔抗猪IgG,充分洗涂后再加入DAB显色， 用浓硫酸终止反应后测定吸光度。检测结果如表1所示。
[0062] 表1 W重组TsSe巧inB6( Iiig)为抗原的化ISA检测结果
[0063]
[0064] 从表1可W看出，TsSerpinB6抗原与100倍稀释的猪囊尾蝴阳性血清反应的平均OD 值达0.93,而与同样倍数稀释的猪阴性血清、猪细颈囊尾蝴阳性血清、猪旋毛虫阳性血清、 猪弓形虫阳性血清反应的OD值均在0.4 W下，即P(阳性）/N(阴性）= 2.65〉2。说明W TsSerpinBS为抗原的ELISA方法，具有很好的检测特异性，克服了现有血清学检测方法易与 猪细颈囊尾蝴等存在交叉反应的缺点，是理想的猪囊尾蝴病特异性检测抗原。
[0065] 实施例3对猪带缘虫阳性血清的鉴定方法
[0066] 应用实施例2中的试剂盒及检测方法对待测血清进行检测并分析检测结果，当P (阳性VN(阴性)〉2时，检测结果可判为阳性，反之，则为阴性。
[0067] 最后应说明的是：W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白，其特征在于:所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表 SEQ ID No.2。2. 猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白作为猪带绦虫/囊尾蝴检测抗原的应用;所述猪带绦 虫TsSerpin B6重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。3. 猪带绦虫TsSerpin B6重组蛋白在制备猪囊尾蝴病检测试剂盒中的应用；所述重组 蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。4. 一种猪囊尾蝴病ELISA检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中包被抗原为猪带绦虫 TsSerpin B6重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还包括HRP标记的兔抗猪 IgG06. -种猪带绦虫ELISA检测方法，所述方法不以专利法规定的疾病的诊断和治疗为目 的，其特征在于：以纯化的TsSerpin B6重组蛋白Iyg于37°C包被酶标反应板lh，封闭液为 1%BSA，用PBST充分洗涤后分别加入待测样品和猪阴性血清，37°C孵育lh，PBST洗涤三次后， 加入1:5000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，充分洗涤后再加入DAB显色，用浓硫酸终止反应 后测定吸光度，P(阳性)/N(阴性)>2时，为阳性血清，反之，为阴性血清。
【文档编号】C07K14/81GK105924518SQ201610248978
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】骆学农, 刘光学, 梁盼红, 张少华, 侯俊玲, 郭爱疆, 郑亚东, 才学鹏
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所