猪tlr4多克隆抗体的制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，将重组TLR4蛋白(抗原)与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；其中，重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。试验表明，本发明制备的抗体反应性和特异性良好，由于TLR4基因是针对固有免疫应答的重要模式识别受体Toll样受体家族的成员，其在抗细菌性和病毒性感染疾病中发挥重要的作用，因此本发明可应用于猪TLR4蛋白的检测及相关研究，为研究猪细菌性和病毒性感染疾病与TLR4的相互作用机理以及病毒免疫逃避机制的打下良好基础，为新型疫苗和药物的研制提供新的靶标。同时，本发明构建的原核表达载体表达重组蛋白效率高，分离纯化方法简单易操作。
【专利说明】
猪TLR4多克隆抗体的制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于多克隆抗体制备技术领域，尤其设及一种猪化R4多克隆抗体的制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 化R4属于I型跨膜蛋白，是化R家族中极为重要的成员，是固有免疫系统识别病原 微生物的主要受体。TLR4可识别革兰氏阴性菌的脂多糖而在细菌感染性疾病的发生中起重 要作用。近年来越来越多的研究发现，TLR4还广泛参与病毒感染性疾病的发生和病毒的免 疫逃逸。TLR4是化R家族中唯--个能利用四种接头分子(MyD88、MAL/TIRAP、TRIF和TRAM) 传递级联信号的受体，通过下游IRAKW及TAF3和TRAF6,活化转录调节因子，如NF-kB、AP-1 和一系列的干扰素调节因子，引起炎性因子和I型干扰素的产生，启动固有免疫和获得性免 疫应答。
[0003] 近年来，抗病毒固有免疫研究已经取得了重要进展，针对固有免疫应答的重要模 式识别受体--Tol 1样受体(Tol 1-1 ike receptor,化R)所研制的新型疫苗和治疗药物已 经在临床上用于HIV、皿V和肥V的防治。在研究猪细菌性W及病毒性疾病与化R4(猪Toll样 受体4,TolI-Uke receptors 4)相互作用过程中，需要运用到Western-blot、IFA、Co-IPW 及FCM等多种实验方法，而运些研究方法无一不需要抗猪化R4多克隆抗体作为支撑，生物市 场上猪源抗体的缺乏严重制约着猪TLR4的相关研究。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种猪化R4多克隆抗体的制备方法，用于研究猪 细菌性和病毒性疾病的感染机制，并通过掲示该蛋白抗细菌及病毒的机制，为开发新型疫 苗或药物提供依据。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案:猪化R4多克隆抗体的制备方法， 将重组化R4蛋白（抗原）与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清;重组化R4蛋白具 有序列表SEQ. ID. No. 1氨基酸序列。
[0006] 免疫动物按W下操作进行:采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式免疫8只 4周龄昆明小白鼠；首免时，重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，每只小鼠蛋白免疫 量约50化g;后续免疫则采用等量的弗氏不完全佐剂与重组蛋白进行乳化每只小鼠蛋白免 疫量约300-50化邑。
[0007] 重组化R4蛋白是由IPTG诱导基因工程菌表达目的蛋白，并通过低浓度尿素溶液多 次洗涂包涵体获得(纯度较高的重组TLR4蛋白）。
[000引基因工程菌由化R4原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)获得;TLR4原核表 达载体是由RT-PCR获得并构建含有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的重组载体，通过PCR获得 序列表SEQ. ID.No.2碱基序列连接至原核表达质粒祀T-32a( + )构建而成。
[0009]上述制备方法获得的猪TLR4多克隆抗体。
[0010] 猪TLR4多克隆抗体在制备抗猪攝病毒疫苗或药物方面的应用。
[0011] 针对目前缺乏抗猪化R4多克隆抗体用于研究猪细菌性W及病毒性疾病的现状，发 明人建立了一种猪化R4多克隆抗体的制备方法，将重组化R4蛋白（抗原)与弗氏佐剂乳化后 免疫动物获得多克隆抗体血清;其中，重组化R4蛋白具有序列表SEQ. ID.No. 1氨基酸序列。 试验表明，本发明制备的抗体反应性和特异性良好，由于化R4基因是针对固有免疫应答的 重要模式识别受体Toll样受体家族的成员，其在抗细菌性和病毒性感染疾病中发挥重要的 作用，因此本发明可应用于猪化R4蛋白的检测及相关研究，为研究猪细菌性和病毒性感染 疾病与化R4的相互作用机理W及病毒免疫逃避机制的打下良好基础，为新型疫苗和药物的 研制提供新的祀标。同时，本发明构建的原核表达载体表达重组蛋白效率高，分离纯化方法 简单易操作。
【附图说明】
[0012] 图 1是IIJM-KZ大片段DNA PCR电泳图，图中：M:DNA Marker DL2000, IJLIM-KZ大 片段DNA PCR产物。
[OOK] 图2是原核表达质粒PCR(左）和EcoR I/Not I双酶切电泳图（右），图中：M:DNA Marker化2000/5000，1:原核表达质粒PCR产物，2:原核表达质粒双酶切产物。
[0014] 图3是SDS-PAGE分析重组菌pET-l'LIM(170)表达的化34结果，图中：M:非预染蛋白 Marker，1:未进行诱导的重组菌菌体2:0.05mM IPTG 30°C诱导重组菌化后收集的菌体，3和 4:分别为0.05mM IPTG 30°C诱导重组菌化后裂解菌体得到的上清和沉淀。
[001引图4是重组蛋白HIS标签的检测，图中：M:预染蛋白Marker。
[0016]图5是多克隆抗体与重组蛋白反应性的检测结果图，图中:M:预染蛋白Marker。 [0017]图6是多克隆抗体应用的检测结果图，图中:M:预染蛋白Marker,0-4化.p.i分别是 PK-15细胞感染猪攝病毒0、12、24、36和4她后收集的细胞总蛋白。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1构建TLR4原核表达载体和基因工程菌。
[0019] 根据 GenBank 中 Sus scrofa toll-like receptor A(^ra)IiiRNA(登录号： KF460453.1)氨基酸序列分析其亲疏水性及线性表位，确定原核表达基因序列为2043-2052 共510bp，核巧酸序列和氨基酸序列分别如S序列表SEQ.ID.No.3和序列表SEQ.ID.No.l所 示，并设计目的基因的克隆引物F1/R1和原核表达引物F2/R2。采集感染猪攝病毒的PK-15细 胞，抽提细胞总RNA并反转录，利用引物F1/R1扩增出TLR4-KZ大片段(621bp)(图1)，其核巧 酸序列如序列表SEQ. ID.No. 2所示。W化R4-KZ质粒为模板，利用引物F2/R2PCR扩增得到原 核表达序列化R4(170)，其核巧酸序列如序列表SEQ. ID.No. 3所示。反转录体系如下:RNA模 板 15]iL，01igo 肌化L，M-MLV反转录酶化L，5 Xfirst buffer 扣L，RNase inhibitor 化L， dNTP化L。反转录程序为42°Clh，95°C5min。PCR反应体系如下：模板化L，2XTaqPCR Mastermix 12.扣L，上游引物和下游引物各0.扣L，d地2〇 9.5化。PCR程序如下：95°C预变性 5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循环30次;72°C终延伸lOmin。反应结束后 进行DNA琼脂糖凝胶电泳分析，并回收目的基因片段，与PMD18-T载体连接，所获得质粒经华 大基因公司测序确认与GenBank中目的基因序列一致。
[0020] 设计的克隆引物：Fl: 5 ' -GCCGTCATTAGTGCGTCAGTT-3 '（ SEQ. ID. No . 4)，Rl: 5 ' - GGCTGTTGTATCATGCTGGTTGCT-3 '（沈Q. ID. No. 5)。
[0021] 原核表达引物：F2:5 ' -CGGAATTCTATGGCAGAGGTGAAAGC-3 '（沈Q. ID. No. 6)，R2:5 ' - CGGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGTGTATCATGCTGGTTGCT-3 '（沈Q. ID. No. 7)。（下划线分别为 核酸限制性内切酶EcoR I和Not I识别位点）
[0022] 将所获得的目的基因质粒和原核表达质粒pET-32a( + )同时用核酸限制性内切酶 EcoR I和Not I进行双酶切，纯化酶切产物后，通过T4DNA Iigase将目的基因片段与用祀T- 32a( + )连接，构建TLR4原核表达载体，并将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，利用氨节青霉 素鉴定筛选基因工程阳性菌(图2)。
[0023] 实施例2获取和纯化重组TLR4蛋白
[0024] 将阳性基因工程菌接种于含氨节青霉素的灭菌LB培养基中，37°C20化pm培养至菌 液光密度值(0D600)达0.6，加入IPTG至终浓度0.05mM，30 °C诱导表达化，4°C6000巧m离屯、 20min收集菌体，裂解缓冲液重悬菌体，超声波裂解破碎菌体，4°C eOOOrpm离屯、30min，分别 收集上清和沉淀。沉淀用PBS重悬后，与上清分别加入5 X上样缓冲液沸水煮5min，SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达量W及表达形式（图3)。
[0025] 本发明获得的重组蛋白W包涵体形式表达，与Ni-NTA亲和层析柱亲和力差，故菌 体超声波破碎后收集的沉淀分别用含1M、2M、3M和4M尿素的包涵体洗涂液(NaCl 5.85邑， Tris 6.06g，EDTA O.SSSgJrition X-IOOSmL,水 1L，PH>8)多次洗涂，将杂蛋白溶解去除。 将洗涂后的沉淀置于包涵体溶解液(Na此P04*2出0 15.6g，Tris 0.121g，Urea 480.48g，水 1L，PH>8)中4°C变性溶解过夜，离屯、后，将上清置于透析袋中，采用梯度透析法，将透析袋 分别依次置于添加6、4、2和OM尿素的复性液(Tris 12.1g，EDTA 3.722g，精氨酸20g，甘油 IOOmUGSH 0.3073g，GSSH 0.1225g，水2L)中透析12h，对变性的重组蛋白进行复性。 Western-blot检测重组蛋白的化S标签，确定复性过程中重组蛋白未丢失（图4)。复性后的 重组蛋白若浓度较低则用PEG20000浓缩，测浓度后分装，-80°C保存备用。
[0026] 实施例3多克隆抗体的制备和获得
[0027] 采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式免疫8只4周龄昆明小白鼠。首免时， 重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量约50化g。后续免疫则采用 等量的弗氏不完全佐剂与重组蛋白进行乳化，每只小鼠蛋白免疫量约30化g。^免后第7天， 随机选一只小鼠断尾采血100-200化至EP管中，室溫静置化，4 °C 12，OOOrpm离屯、IOmin，分装 析出血清，Western-blot检测制备的多克隆抗体血清与重组蛋白的反应性，确定小鼠产生 特异性抗体，且多克隆抗体稀释度可达1:16000(图5)。四免后第7天采血，室溫静置化后4°C 12，00化pm离屯、1 Omin，分装析出血清，-80°C保存备用，即为所得小鼠抗猪TLR4多克隆抗体。
[0028] 实施例4Western Blot检测多克隆抗体的应用
[0029] PK-15细胞感染猪攝病毒后收集0、12、24、36、4化的蛋白样品，进行508斗46￡电泳， 通过半干转膜仪将蛋白转移到PVDF膜，5 %脱脂牛奶封闭，分别W抗CSFV E2单克隆抗体和 制备的小鼠抗猪化R4多克隆体作为一抗进行WeStern B101检测，确定所制备的小鼠抗猪 化R4多克隆抗体特异性良好，效价为1:1000,且能检测到感染猪攝病毒后化R4蛋白表达上 升（图6)。
【主权项】
1. 一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于将重组TLR4蛋白与弗氏佐剂乳化后 免疫动物获得多克隆抗体血清;所述重组TLR4蛋白具有序列表SEQ. ID. No. 1氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述免疫动物按 以下操作进行:采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式免疫8只4周龄昆明小白鼠；首 免时，重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量约500yg;后续免疫 则采用等量的弗氏不完全佐剂与重组蛋白进行乳化每只小鼠蛋白免疫量约300-500yg。3. 根据权利要求1所述的猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述重组TLR4蛋 白是由IPTG诱导基因工程菌表达目的蛋白，并通过低浓度尿素溶液多次洗涤包涵体获得。4. 根据权利要求3所述的猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于:所述基因工程菌 由TLR4原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta DE3获得;所述TLR4原核表达载体是由RT-PCR获得并构建含有序列表SEQ . ID . No . 2碱基序列的重组载体，通过PCR获得序列表 SEQ.ID.N0.3碱基序列连接至原核表达质粒pET-32a( + )构建而成。5. 权利要求1至4任一制备方法获得的猪TLR4多克隆抗体。6. 权利要求5所述猪TLR4多克隆抗体在制备抗猪瘟病毒疫苗或药物方面的应用。
【文档编号】A61K39/42GK105924525SQ201610310992
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】罗廷荣, 赵倩楠, 李晓宁, 李晓泉, 应雪, 陶倩, 姜炳星
【申请人】广西大学