一种细菌纤维素/nbsk气凝胶球的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，包括：将木醋杆菌接种在液体种子培养基中，静态培养，得到种子液；将NBSK和液体发酵培养基加入锥形瓶中，pH调节至5.6～7.0，进行灭菌处理；将种子液接种到锥形瓶中，加盖无菌海绵塞并于摇床中进行动态培养，得到细菌纤维素/NBSK水凝胶球，用氢氧化钠溶液处理，洗涤，干燥，得到细菌纤维素/NBSK气凝胶球。本发明制备方法简单，环保，不使用特殊成球设备和污染性化学试剂，且细菌纤维素/NBSK球不会在干燥后发生结构塌陷，气凝胶球吸水后可以恢复到干燥前的状态；在吸附，隔热，药物缓释，以及制备各种功能化气凝胶球上有广泛的应用前景。
【专利说明】
一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于纤维利用与微生物发酵领域，特别涉及一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法。
【背景技术】
[0002]纤维素微球是用纤维素制备的球形颗粒，可应用于色谱分析、固体载体合成、蛋白质固定、药物缓释等领域。现有的纤维素微球制备技术是先将纤维素溶解，再将纤维素多糖溶液塑造成球形颗粒，然后进行溶胶凝胶转换和颗粒固化成微球。这种制备工艺操作复杂，需要使用特殊成球设备，并使用了污染性的化学试剂。
[0003]NBSK(Northern bleached softwood kraft)是一种由白云杉，花旗松，落叶松等软木制得的纤维浆，主要产于加拿大和北欧国家。其化学成分以纤维素和半纤维素为主，含水率为97 %。
[0004]细菌纤维素是微生物在一定条件下发酵产生的柔性天然高分子材料，其纤维素含量高达99%，结晶度高，力学强度高，孔隙率高，比表面积大，持水性高，且具有三维纳米网络结构，是用于制备纤维素气凝胶的理想材料。目前已知能够合成细菌纤维素的共有9个菌属，其中产率最高的是木醋杆菌。细菌纤维素的发酵方式有动态培养和静态培养两种。静态培养条件下，细菌纤维素在液体培养基表面形成凝胶状膜;在动态培养的条件下，细菌纤维素以星形、球状等凝胶颗粒的形式分散在液体培养基里。在含有NBSK的培养基中动态培养细菌纤维素，细菌纤维素与NBSK中的纤维会通过氢键迅速复合在一起，特定培养条件下，可形成形状规则，大小均匀的细菌纤维素/NBSK水凝胶球，经过冷冻干燥或超临界为二氧化碳干燥可得到细菌纤维素/NBSK气凝胶球。纯细菌纤维素水凝胶球不能用于制备气凝胶球，这是因为纯细菌纤维素水凝胶球由于在干燥过程中会发生严重的结构塌陷而难以制备气凝胶球。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，该方法操作简单、不需要使用特殊的成球设备、环保，在吸附、隔热、药物缓释、以及制备各种功能化气凝胶球上有广泛的应用前景。
[0006]本发明的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，包括:
[0007](I)将活化好的木醋杆菌接种在液体种子培养基中，在培养箱中静态培养，得到种子液；
[0008](2)将NBSK或改性NBSK和液体发酵培养基加入到锥形瓶中，pH调节至5.6?7.0，进行灭菌处理；
[0009](3)将步骤(I)中的种子液接种到步骤(2)中灭菌处理后的锥形瓶中，加盖无菌海绵塞并于摇床中进行动态培养，得到细菌纤维素/NBSK水凝胶球；
[0010](4)将步骤(3)中的细菌纤维素/NBSK水凝胶球用氢氧化钠溶液处理，去除残留的菌体;再用去离子水把水凝胶球洗涤至PH值7.0左右，干燥，得到细菌纤维素/NBSK气凝胶球。
[0011 ]所述步骤(I)中静态培养的条件为:液体种子培养基20mL-30mL，温度28-32°C，培养时间36-50h。
[0012]所述步骤(I)中液体种子培养基和步骤(2)中液体发酵培养基的成分相同，组成为:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水梓檬酸1.15g/L。
[0013]所述步骤(2)中改性NBSK包括:羧基改性NBSK或醛基等改性NBSK。
[0014]所述步骤(2)中所使用的锥形瓶的体积为150mL、250mL、300mL、500mL(其他容积锥形瓶不能成球)。锥形瓶中所加入的液体体积总量占锥形瓶容积的50%-60%，其中包括发酵培养基，种子液和NBSK中的水(NBSK含水率为97% );即发酵培养基，种子液和NBSK中的水(NBSK含水率为97% )的体积总量占所使用锥形瓶体积的50%~60%；NBSK用量的计算方法为，NBSK中纤维干重占液体总量的为0.8%-1.2%。
[0015]所述步骤(2)中灭菌处理的方式为:紫外线灭菌l_3h或121°C条件下高压蒸汽灭菌(198.64kPa)50min-120min。
[0016]所述步骤(2)中所使用的调节培养基pH值的试剂为0.l-2mol/L的盐酸和0.1-2mol/L的氢氧化钠。
[0017]所述步骤(3)中摇床温度为28-36°C，培养时间为72?120h;种子液的加入量为5?25mL0
[0018]所述步骤(3)中，摇床转速需要根据锥形瓶容积进行选择，150mL的锥形瓶，转速设置
[0019]为(200± 1) rpm; 250mL_500mL 锥形瓶，转速设置为(150 ± 1) rpm。
[°02°]所述步骤(4)中处理为在摇床中进行，温度为80 °C ；氢氧化钠溶液的浓度为0.lmol/L0
[0021 ]所述步骤(4)中干燥的方式为冷冻干燥、液氮冷冻干燥或超临界二氧化碳干燥。
[0022]所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的操作条件均为无菌条件。
[0023]木醋杆菌购买即可得到。
[0024]本发明为克服现有技术的缺点，使用细菌纤维素和NBSK(Northernbleachedsoftwood kraft)制备纤维素微球。
[0025]有益效果
[0026](I)本发明制备的细菌纤维素/NBSK气凝胶球有效的解决了纯细菌纤维素球在干燥过程中发生结构塌陷的问题；
[0027](2)本发明制备的细菌纤维素/NBSK气凝胶球吸水后可以恢复到干燥前的状态；
[0028](3)本发明制备的细菌纤维素/NBSK气凝胶球粒径均匀，形态规则，不需要使用成形模具，也不需要后续的切割成形等处理；
[0029](4)本发明制备的细菌纤维素/NBSK气凝胶球及其发酵过程对环境没有污染；
[0030](5)本发明提供了一种在发酵过程中纤维与细菌纤维素结合，并且使纤维在细菌纤维素中均匀分布的方法；
[0031](6)本发明的动态发酵生产效率高，可以在短时间内制备大量的细菌纤维素/NBSK气凝胶球。
【附图说明】
[0032]图1为实施例1中细菌纤维素/NBSK水凝胶球(左)和对比例I中细菌纤维素水凝胶球(右)；其中，培养皿的直径为15cm;
[0033]图2为实施例1中细菌纤维素/NBSK气凝胶球(左)和对比例I中细菌纤维素气凝胶球(右)；其中，培养皿的直径为5cm;
[0034]图3为实施例2中细菌纤维素/NBSK气凝胶球(左)和对比例2中细菌纤维素气凝胶球(右)；
[0035]图4为实施例1中再次吸水后的细菌纤维素/NBSK凝胶球(左)和对比例I中再次吸水后的细菌纤维素凝胶球(右)；培养皿的直径为1cm.
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0037]实施例1
[0038]将木醋杆菌接种在30mL的液体种子培养基中(培养基成分:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水柠檬酸1.15g/L)，在32°C的培养箱中静态培养48h。取250mL带海绵塞子的锥形瓶，加入1.25g NBSK，10mL液体发酵培养基(与种子培养基成分相同)，调节pH值至6.0(调节试剂为0.lmol/L的盐酸和0.lmol/L的氢氧化钠)，121°C下灭菌501^11(198.641^&)。待培养基冷却后加入251^木醋杆菌种子液，置于转速为150印111，温度为32°C的摇床中动态培养72小时，获得细菌纤维素/NBSK水凝胶球。把制得的水凝胶球用0.lmol/L的氢氧化钠溶液处理，此处理在摇床中进行，温度为80°C，转速lOOrpm。用去离子水冲洗水凝胶球，直至其pH值达到7，冷冻干燥24h，制得细菌纤维素/NBSK气凝胶球。
[0039]实施例2
[0040]将木醋杆菌接种在30mL的液体种子培养基中(培养基成分:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水柠檬酸1.15g/L)，在32°C的培养箱中静态培养48h。取150mL带海绵塞子的锥形瓶，加入0.9g NBSK，75mL液体发酵培养基(与种子培养基成分相同)，调节pH值至6.7(调节试剂为0.lmol/L的盐酸和0.1moI/L的氢氧化钠)，121°C下灭菌50min( 198.64kPa)。待培养基冷却后加入25mL木醋杆菌种子液，置于转速为200rpm，温度为32°C的摇床中动态培养72小时，获得细菌纤维素/NBSK水凝胶球。把制得的水凝胶球用0.lmol/L的氢氧化钠溶液处理，此处理在摇床中进行，温度为80°C，转速lOOrpm。用去离子水冲洗水凝胶球。直至其pH值达到7，冷冻干燥24h，制得细菌纤维素/NBSK气凝胶球。
[0041 ] 实施例3
[0042]将木醋杆菌接种在30mL的液体种子培养基中(培养基成分:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水柠檬酸1.15g/L)，在32°C的培养箱中静态培养48h。取150mL带海绵塞子的锥形瓶，加入0.9g NBSK，75mL液体发酵培养基(与种子培养基成分相同)，调节pH值至7.0(调节试剂为0.lmol/L的盐酸和0.1moI/L的氢氧化钠)，121°C下灭菌50min( 198.64kPa)。待培养基冷却后加入25mL木醋杆菌种子液，置于转速为200rpm，温度为32°C的摇床中动态培养90小时，获得细菌纤维素/NBSK水凝胶球。把制得的水凝胶球用
0.lmol/L的氢氧化钠溶液处理，此处理在摇床中进行，温度为80°C，转速lOOrpm。用去离子水冲洗水凝胶球。直至其PH值达到7，液氮冷冻干燥制得细菌纤维素/NBSK气凝胶球。
[0043]实施例4
[0044]将木醋杆菌接种在30mL的液体种子培养基中(培养基成分:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水柠檬酸1.15g/L)，在32°C的培养箱中静态培养48h。取150mL带海绵塞子的锥形瓶，加入0.9g NBSK，75mL液体发酵培养基(与种子培养基成分相同)，121°(:下灭菌5011^11(198.64kPa)待培养基冷却后加入25mL木醋杆菌种子液，置于转速为200rpm，温度为32°C的摇床中动态培养80小时，获得细菌纤维素/NBSK水凝胶球。把制得的水凝胶球用0.lmol/L的氢氧化钠溶液处理，此处理在摇床中进行，温度为80°C，转速lOOrpm。用去离子水冲洗水凝胶球，直至其pH值达到7，液氮冷冻干燥制得细菌纤维素/NBSK气凝胶球。
[0045]对比例I
[0046]将木醋杆菌接种在30mL的液体种子培养基中(培养基成分:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水柠檬酸1.15g/L)，在32°C的培养箱中静态培养48h。取250mL带海绵塞子的锥形瓶，10mL液体发酵培养基(与种子培养基成分相同)，调节pH值至6.0(调节试剂为0.lmol/L的盐酸和0.lmol/L的氢氧化钠)，121 °C下灭菌50min(198.64kPa)。待培养基冷却后加入25mL木醋杆菌种子液，置于转速为150rpm，温度为32°C的摇床中动态培养72小时，获得细菌纤维素水凝胶球。把制得的水凝胶球用0.lmol/L的氢氧化钠溶液处理，此处理在摇床中进行，温度为80°C，转速lOOrpm。用去离子水冲洗水凝胶球。直至其PH值达到7，冷冻干燥24h，制得细菌纤维素气凝胶颗粒。
[0047]除是否添加NBSK外，实施例1与对比例I采用相同的发酵条件制备凝胶颗粒。实施例I制得水凝胶球的直径为3mm，对比例I制得水凝胶球的直径为1mm。即使用NBSK纤维后，在其他发酵培养条件完全相同的情况下，获得的水凝胶颗粒直径更大，且加入纤维素纤维后，水凝胶颗粒仍然保持粒径均匀、规则的球状外观，如图1所示。
[0048]冷冻干燥后，得到气凝胶颗粒;其中，实施例1制得的气凝胶颗粒是直径为3mm的规则球形，对比例I制得的气凝胶颗粒发生严重塌陷，体积严重收缩，不能保持规则的球形，如图2所示。
[0049]实施例1制得的气凝胶颗粒吸水后可以恢复到直径为3mm的球状水凝胶的状态;对比例I制球状气凝胶颗粒吸水后仍然处于塌陷状态，直径只有0.5mm，如图4所示。
[0050]对比例2
[0051 ]将木醋杆菌接种在30mL的液体种子培养基中(培养基成分:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水柠檬酸1.15g/L)，在32°C的培养箱中静态培养48h。取250mL带海绵塞子的锥形瓶，175mL液体发酵培养基(与种子培养基成分相同)，调节pH值至6.7(调节试剂为0.lmol/L的盐酸和0.lmol/L的氢氧化钠)，121 °C下灭菌50min(198.64kPa)。待培养基冷却后加入25mL木醋杆菌种子液，置于转速为150rpm，温度为32°C的摇床中动态培养72小时，获得细菌纤维素水凝胶球。把制得的水凝胶球用0.lmol/L的氢氧化钠溶液处理，此处理在摇床中进行，温度为80°C，转速lOOrpm。用去离子水冲洗水凝胶球。直至其pH值达到7，冷冻干燥24h，制得细菌纤维素气凝胶颗粒。
[0052]实施例2与对比例2采用不同发酵条件制备球状纤维素凝胶颗粒，制得的纤维素水凝胶球的直径都为4mm。冷冻干燥后，实施例2中的气凝胶颗粒是直径为4mm的规则球形，对比例2制得的气凝胶发生严重塌陷，体积严重收缩，不能保持规则的球状，如图3所示。
[0053]实施例2制得的气凝胶颗粒吸水后可以恢复到直径为4mm的水凝胶状态;对比例2制得的气凝胶颗粒吸水后仍然处于塌陷状态，直径只有2mm。
[0054]对比例3
[0055]将木醋杆菌接种在30mL的液体种子培养基中(培养基成分:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水柠檬酸1.15g/L)，在32°C的培养箱中静态培养48h。取250mL带海绵塞子的锥形瓶，175mL液体发酵培养基(与种子培养基成分相同)，调节pH值至7.0(调节试剂为0.lmol/L的盐酸和0.lmol/L的氢氧化钠)，121 °C下灭菌50min(198.64kPa)。待培养基冷却后加入25mL木醋杆菌种子液，置于转速为150rpm，温度为32°C的摇床中动态培养90小时，获得细菌纤维素水凝胶球。把制得的水凝胶球用0.lmol/L的氢氧化钠溶液处理，此处理在摇床中进行，温度为80°C，转速lOOrpm。用去离子水冲洗水凝胶颗粒。直至其PH值达到7，液氮冷冻干燥制得细菌纤维素气凝胶颗粒。
[0056]实施例3与对比例3采用不同发酵条件制备气凝颗粒，制得的水凝胶的直径相同，都为5mm。干燥后，实施例3中的气凝胶球的直径仍为5_，对比例3制得的气凝胶颗粒发生严重塌陷。
[0057]实施例3制得的气凝胶球吸水后可以恢复到与干燥前水凝胶相同的状态，直径为5mm;对比例3制得的气凝胶颗粒洗水后无法恢复成球状。
[0058]对比例4
[0059]将木醋杆菌接种在30mL的液体种子培养基中(培养基成分:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水柠檬酸1.15g/L)，在32°C的培养箱中静态培养48h。取150mL带海绵塞子的锥形瓶，10mL液体发酵培养基(与种子培养基成分相同)，调节pH值至6.0(调节试剂为0.lmol/L的盐酸和0.lmol/L的氢氧化钠)，121 °C下灭菌50min((198.64kPa)。待培养基冷却后加入25mL木醋杆菌种子液，置于转速为200rpm，温度为32°C的摇床中动态培养80小时，获得细菌纤维素水凝胶球。把制得的水凝胶球用0.lmol/L的氢氧化钠溶液处理，此处理在摇床中进行，温度为80°C，转速lOOrpm。用去离子水冲洗水凝胶球。直至其PH值达到7，液氮冷冻干燥制得细菌纤维素气凝胶颗粒。
[0060]除是否添加NBSK外，实施例4与对比例4采用相同的发酵条件制备凝胶颗粒。实施例4制得水凝胶球的直径为3.5mm，对比例4制得水凝胶球的直径为I.5mm。即，使用NBSK后，在其他发酵培养条件完全相同的情况下，获得的水凝胶球直径更大，且水凝胶球仍然保持规则的球状外观。
[0061]实施例4制得的气凝胶球的直径仍为3.5mm，对比例4制得的细菌纤维素气凝胶发生严重塌陷，体积严重收缩，不能保持规则的球形。
[0062]实施例4制得的球状气凝胶颗粒吸水后可以恢复到直径为3.5mm的水凝胶的状态；对比例4φ忾凝胶颗粒吸水后仍然处于塌陷状态，直径只有0.5mm。
【主权项】
1.一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，包括: (1)将木醋杆菌接种在液体种子培养基中，静态培养，得到种子液； (2)将NBSK或改性NBSK和液体发酵培养基加入到锥形瓶中，pH调节至5.6?7.0，进行灭菌处理； (3)将步骤(I)中的种子液接种到经过步骤(2)灭菌处理的锥形瓶中，加盖无菌海绵塞并于摇床中进行动态培养，得到细菌纤维素/NBSK水凝胶球； (4)将经步骤(3)制备的的细菌纤维素/NBSK水凝胶球用氢氧化钠溶液处理，洗涤，干燥，得到细菌纤维素/NBSK气凝胶球。2.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中静态培养的条件为:液体种子培养基20mL-30mL，温度28-32 V，培养时间36-50ho3.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中液体种子培养基和步骤(2)中液体发酵培养基的成分相同，组成为:果糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，磷酸一氢钠2.6g/L，无水梓檬酸1.15g/L。4.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中改性NBSK包括羧基改性NBSK或醛基改性NBSK。5.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所使用的锥形瓶的体积为150mL、250mL、300mL、500mL;锥形瓶中所加入的液体体积总量占锥形瓶容积的50%-60% ;NBSK中纤维干重占液体总量的为0.8%-1.2%。6.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中灭菌处理的方式为:紫外线灭菌l-3h或121°C条件下高压198.64kPa蒸汽灭菌50min_120mino7.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中摇床温度为28-36°C，培养时间为72?120h;种子液的加入量为5?25mL;摇床转速为(200±10)印111对应15011^的锥形瓶；转速设为(150±10)印111对应25011^-50011^锥形瓶。8.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的操作条件均为无菌条件。9.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中处理为在摇床中进行，温度为80°C ;氢氧化钠溶液的浓度为0.lmol/L。10.根据权利要求1所述的一细菌纤维素/NBSK气凝胶球的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中干燥的方式为冷冻干燥、液氮冷冻干燥或超临界二氧化碳干燥。
【文档编号】C08L97/00GK105924668SQ201610363780
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】孟超然, 郁崇文, 杨建平, 张斌
【申请人】东华大学