一种假单胞菌及其应用
【专利摘要】本发明涉及假单胞菌技术领域，特别涉及一种摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12222。其对水稻稻瘟病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病的病原菌具有抑菌效果。CGMCC No. 1222220160317
【专利说明】
-种假单胞菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及假单胞菌（Pseudomonas)技术领域，特别设及一种摩氏假单胞菌 (Pseudomonas mosselii)。
【背景技术】
[0002] 真菌病害严重危及全球粮食安全，植物病害中有70%-80%是病原真菌的侵染所 导致。水稻稻攝病(Magnaporthe cxryzae)在全球85个国家中的爆发，造成了10%-35%的粮 食损失，甚至一些真菌类病害还导致了严重的动植物死亡和灭绝。化学防治是目前防治真 菌病害最有效的措施，我国每年化学农药的使用量为50-60万吨，对环境和生态带来了严重 的污染和危害，在一些国家和地区化学杀菌剂已经被限制使用。而生物防治因其见效快、杀 菌谱广、环境友好和不易产生抗性等特点，具有广阔的应用前景。
[0003] 用于生物防治的微生物种类主要有细菌、真菌、放线菌和病毒。然而，近年来，随着 生防细菌的发掘和研究，寻找新的具有病原真菌括抗作用的细菌难度越来越大，但是筛选 新的具有病原真菌括抗作用的细菌仍然具有重要的科学价值的实用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足之处，结合我国的种植资源，从云南丽江中分离得到 了众多细菌菌株，并对运些细菌的16S rDNA进行测序分析，W确定运些细菌种属分类关系。 并利用其对病原真菌括抗能力等进行检测分析，旨在获得高效广谱的生防菌，W期为植物 真菌病害的防治提供材料。
[0005] 因此，本发明提供了 一种假单胞菌(Pseudomonas )，其保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCC No. 1 2222。具体地该假单胞菌 (Pseudomonas)为摩氏假单胞菌（Pseudomonas mosselii)。
[0006] 一种如本发明的假单胞菌CGMCC No. 12222的应用。
[0007] 在一个【具体实施方式】中，所述假单胞菌用于防治水稻稻攝病、水稻恶苗病、水稻纹 枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一种。
[000引在一个【具体实施方式】中，所述假单胞菌用于保护植物;所述植物主要指的是农作 物;所述农作物可W为水稻。
[0009] 一种对本发明的假单胞菌CGMCC No. 12222进行遗传改良后得到的工程菌。其中， 由于该工程菌是W本发明的假单胞菌CGMCC No. 12222为祀标，而且采取的手段一般是向其 中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，该工程菌仍然为假单胞菌，特别是应为摩 氏假单胞菌。另外，该工程菌可W为提高了对上述病害活性的工程菌。还可W为兼具其他病 虫害活性W及获得了其他特性的工程菌株。
[0010] 一种如本发明的工程菌的应用。
[0011] 在一个【具体实施方式】中，所述工程菌用于防治水稻稻攝病、水稻恶苗病、水稻纹枯 病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一种。
[0012] 在一个【具体实施方式】中，所述工程菌用于保护植物;所述植物主要指的是农作物； 所述农作物可W为水稻。
[0013] -种包含如本发明的假单胞菌的组合物。其中的假单胞菌可W包括本发明的野生 菌株CGMCC No. 12222,也可W包括对本发明的野生菌株CGMCC No. 12222进行遗传改良后得 到的工程菌。所述组合物可W为固态形式，也可W为液态形式。所述组合物还可W包含与本 发明的假单胞菌具有增效作用的其他物质，所述其他物质可W是微生物来源抑菌活性物 质，也可W是抑菌化合物。所述组合物进一步可W包括与本发明的假单胞菌相配合的辅剂、 增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可W选自棉子油、藍麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、 邻苯二甲酸二甲醋、邻苯二甲酸二下醋等;增稠剂有膨润上、硬脂酸侣、QH凝胶、龙胶粉、F1、 黄原胶等:分散剂有拉开粉、NNO、LFS、Bl、碳黑等。
[0014] -种如本发明的组合物的应用。
[0015] -种如本发明所述的组合物在防治水稻稻攝病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻立 枯病和水稻稻曲病中的至少一种中的应用。
[0016] -种如本发明所述的组合物在保护植物中的应用;所述植物主要指的是农作物； 所述农作物可W为水稻。
[0017] -种包含如本发明的假单胞菌的农药制剂。其中的假单胞菌可W包括本发明的野 生菌株CGMCC No. 12222,也可W包括对本发明的野生菌株CGMCC No. 12222进行遗传改良后 得到的工程菌。所述农药制剂可W为固态形式，也可W为液态形式。所述农药制剂还可W包 含与本发明的假单胞菌具有增效作用的其他物质，该物质可W是微生物来源抑菌活性物 质，也可W是抑菌化合物。所述农药制剂进一步可W包括与本发明的假单胞菌相配合的辅 剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可W选自棉子油、藍麻油、桐油、液体石蜡、豆油、AU A2、邻苯二甲酸二甲醋、邻苯二甲酸二下醋等;增稠剂有膨润±、硬脂酸侣、QH凝胶、龙胶粉、 Fl、黄原胶等:分散剂有拉开粉、NNO、LFS、Bl、碳黑等。
[0018] -种如本发明的农药制剂的应用。
[0019] -种如本发明所述的农药制剂在防治水稻稻攝病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻 立枯病和水稻稻曲病中的至少一种中的应用。
[0020] -种如本发明所述的农药制剂在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作 物;所述农作物可W为水稻。
[0021] 在本发明中，术语"保护"的意思是通过预防和/或治疗祀标生物产生的病虫害等， 从而使祀标生物免于或减轻遭受所述病虫害的为害。例如通过使用所述假单胞菌预防和/ 或治疗水稻的稻攝病。
【附图说明】
[0022] 图1为假单胞菌BSOll对時培养法抑制水稻稻攝病的效果图。其中，A为空白对照，B 为BSOll的抑菌实验。
[0023] 图2为假单胞菌BSOll对時培养法抑制水稻恶苗病的效果图。其中，A为空白对照，B 为BSOll的抑菌实验。
[0024] 图3为假单胞菌BSOll的16S rDNA构建的系统发育树。
【具体实施方式】
[0025] W下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不 构成对本发明的限制。
[0026] 本发明筛选的一株假单胞菌被定名为BSOll，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCC No. 12222，保藏日期为2016年3月17日，保 藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为摩氏 假单胞菌（Pseudomonas mosselii)。
[0027] 病原菌：5种供试病原真菌水稻稻攝病（Magnapo;rthe oryzae)、水稻恶苗病 (Fusarium moniliforme)、水稻纹枯病（Rhizoctonia solani Kiihn)、水稻立枯病 (F'usarium graminearum Schw.)和水稻稻曲病（Ustilaginoidea Oiyzae)由本实验室保 藏。
[002引邸固体培养基配方:蛋白腺20g，K2HP04 15g，甘油10g，MgS04 15g，琼脂15g，蒸馈水 1000ml，抑7.2。常规灭菌后使用。
[0029] PDA固体培养基配方:马铃馨200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馈水1000毫升，自然 pH。常规灭菌后使用。
[0030] 相对抑菌率（％ )=(对照菌落半径一处理菌落半径)/对照菌落半
[0031] 实施例1
[0032] 1、±壤样品的采集
[0033] 从云南丽江涛源山区随机采取±样。去除表面±壤，采集5-20cm深处的±样约 SOOg，分装标记后带回实验室。
[0034] 2、菌株的分离
[0035] 采用±壤稀释法分离，称取IOgi壤倒入装有玻璃珠的90ml无菌水=角瓶中，此为 1〇-1的稀释液，振荡IOmin后，吸取Iml至新的装有90ml无菌水的=角瓶中，振荡混匀，此为 1〇-2的稀释液，按此方法继续稀释成1〇-4，1〇-5，1〇- 6的稀释液。吸取1〇-4、1〇-哺1〇-6稀释液100 加入到KB固体培养基平板上，每个梯度3次重复，涂布均匀，倒置于28°C培养箱中培养 2地，然后将典型菌落在KB培养基平板上划线纯化2-3次后得到单菌落。将纯化后的单一菌 株接种KB培养基斜面上，4 °C保存，供生测试验使用。最后获得的其中一株菌定名为BSO11。
[0036] 3、菌株BSOll的抑菌谱
[0037] 1)采用平板对時法，将水稻稻攝病菌在PDA固体培养基上活化后，用6mm打孔器沿 着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指 示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的假单胞菌菌株(划线长度3cm)，接S个平板作为重 复，同时W不接假单胞菌而只接稻攝病菌的平板为对照。28°C进行对時培养，分别在第5天 和第7天后观察并记录，抑菌情况见图1。
[003引第五天测量受BSOll括抗生长的稻攝病菌的生长半径分别为0.72cm，0.65cm和 0.7畑1，对照稻攝病菌的生长半径为2.7畑1，2.7cm和2.75cm，S次重复取平均值后根据上述 相对抑菌率（％ )公式计算得到BSOll对稻攝病菌的相对抑菌率为74.8%。
[0039] 2)采用平板对時法，将水稻恶苗病菌在固体PDA培养基上活化后，同样用6mm打孔 器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在 离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的菌株BSOll(划线长度3cm)，接S个平板作为 重复，同时W不接假单胞菌而只接指示菌的平板为对照。28°C进行对時培养，5天后观察并 记录，抑菌情况见图2。
[0040] 测量受BSOll括抗生长的稻攝病菌的生长半径分别为1.65cm，1.64cm和1.65畑1，对 照稻攝病菌的生长半径为3. Ocm，2.95cm和3. Ocm，S次重复取平均值后根据上述相对抑菌 率（％ )公式计算得到BS014对稻攝病菌的相对抑菌率为45.2%。
[0041] 3)采用平板对時法，将水稻纹枯病菌在固体PDA培养基上活化后，同样用6mm打孔 器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在 离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的菌株BSOll(划线长度3cm)，接S个平板作为 重复，同时W不接假单胞菌而只接指示菌的平板为对照。28°C进行对時培养，5天后观察并 记录。结果表明本发明细菌菌株BSOll对水稻纹枯病菌具有一定抑菌效果。
[0042] 4)采用平板对時法，将水稻立枯病菌在固体PDA培养基上活化后，同样用6mm打孔 器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在 离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的菌株BSOll(划线长度3cm)，接S个平板作为 重复，同时W不接假单胞菌而只接指示菌的平板为对照。28°C进行对時培养，5天后观察并 记录。结果表明本发明细菌菌株BSOll对水稻立枯病菌具有一定抑菌效果。
[0043] 5)采用平板对時法，将水稻稻曲病菌在固体PDA培养基上活化后，同样用6mm打孔 器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在 离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的菌株BSOll(划线长度3cm)，接S个平板作为 重复，同时W不接假单胞菌而只接指示菌的平板为对照。28°C进行对時培养，5天后观察并 记录。结果表明本发明细菌菌株BSOll对水稻稻曲病菌具有一定抑菌效果。
[0044] 4.菌株BSOll的16S rDNA测序及序列分析
[0045] 参照分子克隆中提取革兰氏阴性细菌的所述方法提取BSOll基因组DNA。用细菌 16S rDNA通用引物：27F:5'_agagtttgatcctggctcag-3'（如SEQ ID No.l所示）和 1492R: 5'-。旨旨1:1曰。。1:1旨1:1:曰。旨曰。1:1：-3'（如沈〇10齡.2所示）扩增85011的168扣臟序列。50山的反 应体系包括：10 X PCR缓冲液扣1，dNTP(2.5mM)4 山，27F(20皿）化1，1492R(20皿）1山，TaqDNA 聚合酶（5IU)0.2扣1，DNA模板(50ng/iil)化1，d地2〇补充至SOiil ePCR扩增条件：94度3min预 变性，94度45sec，58度45sec，72度90sec，共30个循环，72度IOmin终延伸。得到的1.4kb左右 多片段，经试剂盒纯化进行TA克隆，转化大肠杆菌得到的克隆子，经过菌液PC閲金证正确后 送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列为1408bp(如SEQ ID No.3所示）。所测 序列提交EzBioCloud网站进行同源性比较，采用MEGA6.0构建系统发育树（图3)。根据图3的 系统发育树可知，本发明的BSOll的系统分类为摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。
【主权项】
1. 一种假单胞菌(Pseudomonas)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCC No. 12222。2. -种对权利要求1所述的假单胞菌进行遗传改良后得到的工程菌。3. -种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的假单胞菌和/或如权利要求2所述 的工程菌。4. 一种农药制剂，所述农药制剂包含如权利要求1所述的假单胞菌和/或如权利要求2 所述的工程菌。5. 如权利要求1所述的假单胞菌、如权利要求2所述的工程菌、如权利要求3所述的组合 物以及如权利要求4所述的农药制剂中的至少一种的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述假单胞菌用于防治水稻稻瘟病、水稻 恶苗病、水稻纹枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一种。7. 根据权利要求5或6的应用，其特征在于，所述假单胞菌用于保护植物。8. 根据权利要求7的应用，其特征在于，所述植物为农作物。9. 根据权利要求8的应用，其特征在于，所述农作物为水稻。
【文档编号】C12N1/20GK105925501SQ201610302453
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】冯国忠, 吴丽娟, 陈国庆, 严清
【申请人】中国水稻研究所