一种分离培养动物胚胎肝干细胞方法
【专利摘要】本发明提供了一种分离培养动物胚胎肝干细胞方法。所述方法中，通过将动物胚胎肝脏取出，再进行培养离心纯化，再进一步加入酶除去成纤维细胞，并重复纯化培养，从而能够简单便捷的得到具有高纯度的肝干细胞，进而解决了现有技术中分离纯化培养胚胎肝干细胞操作复杂、成本高的技术问题。本发明方法具有操作简便、效率高，培养得到的肝干细胞纯度高、活性好、增殖速度快、性状稳定等优点。同时也能够为肝脏疾病的基础研究和临床应用提供大量的细胞来源。
【专利说明】
一种分离培养动物胚胎肝干细胞方法
技术领域
[0001]本发明涉及细胞分离技术领域，具体而言，本发明涉及一种分离动物胚胎肝干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]肝脏是维持人体正常新陈代谢的重要器官。在我国，肝脏疾病是危害人们健康的常见疾病。目前，对于各种因素导致的急、慢性肝功能衰竭，晚期肝硬化及肝癌，现有药物的治疗效果并不明显。肝移植是目前最常见的有效手段，但由于移植供体肝源短缺，移植后免疫排斥反应，以及移植和抗排异过程中会产生高额的费用等问题，在很大程度上限制了肝移植在临床上的广泛开展和应用，而这也就使得肝移植的方法很难成为常规的治疗手段。
[0003]近年来，随着细胞治疗研究的深入，干细胞移植被认为是急性肝损伤、肝功能衰竭及各种终末期肝病较为有效的治疗方法，而这为各种终末期肝病治疗带来了新的希望。肝干细胞(hepatic stem cells，HSCs)，是胚胎干细胞定向增殖的结果。据报道肝干细胞主要来源于胚胎，由于肝干细胞本身缺乏特异性标记物，因而人们主要是通过肝干细胞的分化潜能对肝干细胞作进一步的鉴定。目前已筛选出一些具有高表达性的标记物，如0A6、CK7、CK8、CK18、CK19、AFP 等。
[0004]当前，研究较多的观点就是胚胎肝干细胞用于终末期肝病的治疗。胚胎肝干细胞(Fetal liver stem cells ,FLSCs)是从早期囊胚的内胚层中分离出来的一类原始未分化的干细胞，具有强大的自我增殖及双向分化的潜能，能够被诱导分化为肝细胞、胆管细胞，并且分化的肝细胞具有肝细胞的功能。而用胚胎肝干细胞治疗急性肝损伤，可以降低肝干细胞向非肝细胞的分化，这一突出性能使得肝干细胞比骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞等非肝源性干细胞相比，在细胞分化过程中需要更少的诱导因子。同时，肝源性的胚胎肝干细胞在肝脏中的免疫原性相对较低，这无疑是有利于干细胞移植的。
[0005]目前，国外学者多采用流式分选和磁珠分选等方法分离纯化胚胎肝干细胞，但这些方法仪器贵重、价格昂贵，所以应用受到相应的限制。
[0006]因此，开发出一种新的，且能够较为方便、快捷的分离纯化胚胎肝干细胞的方法就成了目前亟待解决的技术问题。
[0007]有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0008]本发明的第一个目的在于提供一种分离培养动物胚胎肝干细胞方法。本发明方法中，通过将动物胚胎肝脏取出，再进行培养离心纯化，再进一步加入酶除去成纤维细胞，并重复纯化培养，从而能够简单便捷的得到具有高纯度的肝干细胞，进而解决了现有技术中分离纯化培养胚胎肝干细胞操作复杂、成本高的技术问题。本发明方法具有操作简便、效率高，培养得到的肝干细胞纯度高、活性好、增殖速度快、性状稳定等优点。同时也能够为肝脏疾病的基础研究和临床应用提供大量的细胞来源。
[0009]为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案:
[0010]一种分离培养动物胚胎肝干细胞的方法，所述方法包括如下步骤:
[0011](I)取出动物胚胎的肝脏，并用冷PBS溶液充分洗涤后，剪碎，得到肝脏组织块，并对所述肝脏组织块进行洗涤;然后，向清洗后的肝脏组织块中加入胶原酶溶液进行细胞消化，接着加入培养液终止消化，并过滤得到单细胞悬浮液;将所述单细胞悬浮液离心后，收集上清液;然后，将离心所得沉淀细胞制成悬浮液，并二次离心，然后收集二次离心上清液；然后，将两次收集的上清混合后，并三次离心然后收集沉淀细胞，即为三次离心沉淀细胞，然后将三次离心细胞制成悬浮液后，再次离心除去悬浮液中的上清液后，在沉淀细胞中加入含有生长因子的培养基，并接种于培养皿中进行培养；
[0012](2)培养一段时间后，向培养基中加入胰酶，并通过消化除去培养中产生的成纤维细胞，然后除去胰酶，并继续培养，从而得到纯化的肝干细胞。
[0013]本发明中，通过将动物胚胎肝脏取出，再进行培养离心纯化，再进一步加入酶除去成纤维细胞，并重复纯化培养，从而能够简单便捷的得到具有高纯度的肝干细胞。具有操作简单、所得肝干细胞纯度高、活性好、增殖速度快、性状稳定等优点。
[0014]可选的，本发明中，所述动物胚胎为哺乳动物胚胎，例如可以为但不限于老鼠、兔子、猫、狗、牛、马、猪等动物胚胎;优选的，本发明中，所述动物胚胎为灵长类动物胚胎，例如可以为但不限于人胚胎、猩猩胚胎或者猴类胚胎等。
[0015]可选的，本发明中，所述剪碎为以眼科剪剪碎洗涤后的动物胚胎肝脏。
[0016]可选的，本发明中，所述PBS溶液为磷酸缓冲盐溶液;进一步的，本发明中，所述PBS溶液是由0.2g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4以及0.2g KH2PO4,混合后，再加三蒸水至IL所制成的。
[0017]可选的，本发明中，所述肝脏组织块进行洗涤为以冷PBS溶液对肝脏组织块进行洗涤;进一步的，所述冷PBS溶液的温度为I?5°C，例如可以但不限于2、3、4°C。
[0018]可选的，本发明中，所述第三次离心为以220Xg的离心力，并离心时间为5?15min0
[0019]可选的，本发明中，所述将三次离心细胞制成悬浮液为向三次离心细胞加入PBS溶液，并制成悬浮体系。
[0020]可选的，本发明中，所述再次离心为以220 X g的离心力离心5min。
[0021]可选的，本发明中，所述培养一段时间后为细胞在培养基中大于80%长满后，再加入胰酶。
[0022]可选的，本发明中，还进一步包括在纯化的肝干细胞长到一定程度后，进行传代培养的步骤。
[0023]可选的，本发明中，还进一步包括将再次离心后所收集的沉淀细胞再次制成悬浮液，然后离心再次收集沉淀细胞，并向再次收集的沉淀细胞中加入含有生长基的培养液中的步骤。进一步的，所述离心再次收集沉淀细胞为在220 X g的离心力离心5min后，再次收集沉淀细胞。
[0024]可选的，本发明中，所述配样品为0.2%明胶处理过的塑料培养瓶。
[0025]可选的，本发明中，步骤(I)中所述冷PBS溶液的温度为I?5°C;优选的，本发明中，步骤(I)中所述冷PBS溶液的温度为2?4°C，例如可以为但不限于2°C、3°C、3.5°C、4°C。
[0026]本发明中，通过对所用PBS溶液温度的进一步选择以及调整，从而在保证对肝脏组织块充分洗涤的同时，还能够保证在洗涤过程中不会破坏肝脏细胞。
[0027]可选的，本发明中，步骤(I)中所述胶原酶溶液为IV型胶原酶溶液;其中，所述胶原酶溶液的浓度为0.0I %?0.1O % ;优选的，本发明中，所述胶原酶溶液的浓度为0.0 3 %?
0.05%。
[0028]本发明中，通过对所用胶原酶溶液的类型以及浓度的选择以及调整，从而在保证实现充分消化的同时，还能够保证消化效率，并进一步控制消化速度，避免消化过快对细胞的破坏。
[0029]可选的，本发明中，步骤(I)中所述细胞消化的时间为10?20min，温度为30?400C ；优选的，本发明中，步骤(I)中所述细胞消化的时间为15?20min，温度为35?37°C。
[0030]本发明中，通过对消化温度以及消化时间的选择和调整，从而能够保证消化酶的高效消化，同时也使得消化能够彻底、充分的进行。
[0031 ]可选的，本发明中，步骤(I)中所述过滤为采用孔径为100?450目的筛网进行的过滤;优选的，本发明中，所述过滤为采用孔径为200?300目的筛网进行的过滤。
[0032]可选的，本发明中，步骤(I)所述培养液为DMEM/F12完全培养液。
[0033]本发明中，通过对所用培养基的选择，使用具有较丰富的成分和较高浓度的营养成分的DMEM/F12完全培养液，从而可以使得消化反应能够较快的停止，并能够为细胞提供足够的营养成分。
[0034]本发明中，通过对过滤所用筛网孔径的选择和调整，从而可以将胚胎肝干细胞充分过滤得到。
[0035]可选的，本发明中，步骤(I)中所述单细胞悬浮液离心以及二次离心为以55Xg的离心力进行离心，并离心3?15min;优选的，本发明中，所述离心的时间为5-10min，可以例如但不限于6min、7min、8min或者9min。
[0036]本发明中，通过对离心时间以及离心力的选择和调整，从而可以使得离心能够充分进行，并能够将细胞与溶液充分分离开来，实现细胞的纯化。
[0037]可选的，本发明中，步骤(I)所述含有生长因子的培养基为DMEM/F12完全培养基；所述培养基中进一步包含表皮生长因子、谷氨酰胺0.2mol/L，胰岛素以及氢化可的松lug/ml;其中，所述表皮生长因子的浓度为10?30ng/mL，所述谷氨酰胺的浓度为0.1?0.3mol/L，所述胰岛素的浓度为I?I Oug/mL，所述氢化可的松的浓度为0.5?2ug/ml ；优选的，本发明中，所述表皮生长因子的浓度为15?25ng/mL，可以例如16、17、18、19、20、21、22、23、24叫/1^;所述谷氨酰胺的浓度为0.2?0.311101/1，可以例如但不限于0.21、0.23、0.25、
0.27、0.2911101凡;所述胰岛素的浓度为3?81^/1111^，可以例如但不限于4、5、6、71^/1111^所述氢化可的松的浓度为I?2ug/ml，可以例如但不限于1.1、1.3、1.5、1.7、1.9ug/ml。
[0038]本发明中，通过对所用培养基以及生长因子及其浓度的选择和调整，从而能够为分离得到的沉积细胞提供充足的营养成分，促进其快速生长和增殖。
[0039]可选的，本发明中，步骤(2)中所述胰酶的质量分数为0.05%?0.55 % ;优选的，本发明中，步骤(2)中所述胰酶的质量分数为0.25 %?0.35% ;进一步优选的，本发明中，步骤
(2)中所述胰酶的质量分数为0.25 %?0.30 %。
[0040]本发明中，通过对所用胰酶浓度的调整和优化，从而在能够在将成纤维细胞充分酶解除去的同时，还不会由于酶浓度过高而影响肝干细胞。
[0041]可选的，本发明中，步骤(2)中所述向培养基中加入胰酶，并通过消化除去培养中产生的成纤维细胞为向培养基中胰酶后，并观察培养所得细胞贴壁生长情况，当培养生成的纤维细胞大部分脱落，而肝干细胞仍然贴壁时，除去胰酶，继续培养;并重复上述步骤直至培养所得细胞为纯肝干细胞。
[0042]本发明中，通过对除去成纤维细胞步骤的调整和优化，并通过多次培养以及加入胰酶的方法除去成纤维细胞，从而能够充分的将成纤维细胞除去，提高所制得肝干细胞的纯度。
[0043]可选的，本发明中，所述重复上述步骤为重复1-2次上述步骤。具体的，所述重复步骤为:除去胰酶后，在继续培养一段时间，然后，再次加入胰酶，并观察培养所得细胞贴壁生长情况，当培养生成的纤维细胞大部分脱落，而肝干细胞仍然贴壁时，除去胰酶，继续培养，直至培养所得细胞形态较为单一，呈纤维状，即得到高纯度的肝干细胞。
[0044]可选的，本发明中，还进一步包括对所制得的肝干细胞进行鉴定的步骤。
[0045]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0046](I)本发明方法中，通过将动物胚胎肝脏取出，并反复分离、培养并进一步纯化，从而能够较为便捷的分离培养并得到具有高纯度的肝干细胞；
[0047](2)本发明方法中，通过对纯化分离条件以及所用试剂浓度等条件的进一步调整和优化，从而在对肝干细胞充分纯化的同时，还进一步提高了
[0048]了纯化以及培养效率，并保证了培养得到的肝干细胞的纯度以及活性。
【附图说明】
[0049]图1为细胞形态图，其中A为100X的接种24h细胞贴壁并伸展形态;B为100 X的细胞体积增大呈梭形或多角形形态;C为200 X的纯化肝干细胞形态；
[0050]图2为100 X、200 X以及400 X的原代培养细胞9d的细胞形态；
[0051 ] 图3为100 X、200 X以及400 X的Pl代细胞4d的细胞形态；
[0052]图4为100 X、200 X以及400 X的P2代细胞4d的细胞形态；
[0053]图5为100 X、200 X以及400 X的P3代细胞4d的细胞形态；
[0054]图6为100 X、200 X以及400 X的P4代细胞4d的细胞形态；
[0055]图7为CCK-8法绘制的P3代细胞的生长曲线；
[0056]图8为CCK-8法绘制的P4代细胞的生长曲线；
[0057]图9为100X的免疫细胞化学法对P3代细胞进行细胞爬片用于检测胎肝干细胞的AFP、CK18、AAT和CK19的表达情况:A为对照，B为取代对照，C为阳性对照，D为CK19，E为CK18，F 为AAT，G为AFP;
[0058]图10为200 X的肝干细胞免疫荧光细胞化学染色P3代细胞CK19、CK18和AFP的表达情况:A为CK19，B为CK18，C为AFP。
【具体实施方式】
[0059]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0060]实施例1
[0061]I)无菌条件下取出人胚胎的肝脏，并将胚胎肝脏组织置于培养皿中以4°C的冷PBS充分洗涤，然后用眼科剪剪碎肝脏成1_X 1_X Imm组织块，并再次以4°C的冷PBS清洗去除血细胞，并得到清洗后的肝脏组织块；
[0062 ] 2)向清洗后的肝脏组织块中滴加0.0 5 % IV型胶原酶液，并在3 7 °C水浴中消化15min;然后，再加入等量DMEM/F12完全培养液终止消化，并用吸管反复吹打混合液，并用200目筛网过滤，得到肝干单细胞悬浮液；
[0063]3)将步骤2)中所得肝干单细胞液在55Xg的离心力条件下，离心5min，并将离心后所得上清液转移至另一容器中，并将其置于冰上。
[0064]4)向步骤3)离心后所得沉淀细胞中再次加入PBS溶液，并制备悬浮溶液;然后，将所得悬浮溶液在55 X g离心力条件下离心5min，然后将离心所得上清液收集，并舍弃沉淀细胞；
[0065]5)将步骤3)和步骤4)中所得上清液在220Xg条件下离心5min，并收集离心后所得沉淀细胞;然后，向所得沉淀细胞中加入PBS溶液，并制备悬浮溶液，然后将悬浮溶液再在220 Xg条件下离心5min，并收集离心后所得沉淀细胞，并重复操作一次；
[0066]6)向步骤5)中最后一次离心后收集的沉淀细胞中，加入含10%胎牛血清20ng/mL表皮生长因子，0.2moI/L谷氨酰胺，5ug/mL胰岛素，Iug/ml氢化可的松的DMEM/F12培养液，以得到胚胎肝干细胞悬浮液，并接种于0.2%明胶处理的塑料培养瓶中进行培养；
[0067]7)观察肝干细胞的贴壁生长情况和形态变化，其过程中会出现如图1A所示接种24h细胞贴壁并伸展形态，以及图1B所示细胞体积增大呈梭形或多角形形态。待细胞在培养基中>80 %长满时，向培养基中加入质量分数0.25 %的胰酶，并进行消化；
[0068]8)由于成纤维细胞较肝干细胞对胰酶更为敏感，通过控制消化时间，待大部分成纤维细胞脱落，而肝干细胞仍然贴壁时，去除消化液，终止消化，继续培养，如此反复I?2次后，基本可以将成纤维细胞去除，得到较为实施例1的纯化的肝干细胞，纯化肝肝细胞形态如图1C所示，由图1C肝干细胞形态可知，纯化肝干细胞呈集落样生长边缘清晰且折光率强；
[0069]9)待细胞80 %长满以后，1:3消化传代。原代细胞及P1、P2、P3和P4代传代细胞形态分别如图2-6所示，P3、P4代传代细胞的生长曲线分别如图7、图8所示。
[0070]实验例I
[0071]I)实施例1的纯化的肝干细胞接种于预先用0.2%明胶处理的盖玻片上，然后置于24孔培养板中，并在37°C，5%C02条件下的孵箱中培养24h，至肝干细胞长成单层;然后，舍弃培养液，并用PBS溶液对培养细胞冲洗3次(5min/次)，然后加入4%多聚甲醛固定25min;
[0072]2)将固定后细胞用PBS洗涤，然后用0.3%TritonX-100透化细胞1min;
[0073]3)将透化后的细胞用PBS洗涤，并用山羊血清封闭50min;
[0074]4)向封闭后的细胞中分别加入抗AFP、CK18、AAT、CK19抗体(1:100)，并置于湿盒中，在4°C条件下过夜培养；
[0075]5)免疫荧光细胞化学技术检测:将部分步骤4)过夜培养的细胞用PBS溶液进行洗涤，然后加入Alexa Fluor 488Con jugate二抗(1:200)，并在37°C孵育Ih后，用PBS溶液进行冲洗3次，每次冲洗5min;同时，在冲洗过程中注意避光，防止荧光淬灭，然后用荧光封片液封片，并在荧光显微镜观察，检测结果如图9所示；
[0076]6)免疫酶法检测:向步骤4)中过夜培养的细胞中滴加辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，并在37 °C孵育40min;然后滴加显色剂DAB工作液50uL，室温孵育1min，光镜下控制显色，显色完全后，用PBS冲洗终止显色；然后将Mayor，s苏木精滴加在实验标本上，待完全覆盖标本60s后，用PBS将其从标本上冲洗干净，然后将标本浸入饱和Na2HPO4溶液中2min，待标本颜色变蓝后即可洗涤，然后取出标本封片，观察，结果如图10所示。
[0077]本发明方法中，能够实现胚胎肝干细胞的便捷、快速的分离和提取，并能够进一步快速增殖培养得到性状稳定肝细胞，并为肝脏疾病的基础研究和临床应用提供大量的细胞来源。
[0078]尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1.一种分离培养动物胚胎肝干细胞的方法，特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)取出动物胚胎的肝脏，并用冷PBS溶液充分洗涤后，剪碎，得到肝脏组织块，并对所述肝脏组织块进行洗涤;然后，向清洗后的肝脏组织块中加入胶原酶溶液进行细胞消化，接着加入培养液终止消化，并过滤得到单细胞悬浮液； 将所述单细胞悬浮液离心后，收集上清液;然后，将离心所得沉淀细胞制成悬浮液，并二次离心，然后收集二次离心上清液;然后，将两次收集的上清混合后，并三次离心然后收集沉淀细胞，即为三次离心沉淀细胞，然后将三次离心细胞制成悬浮液后，再次离心除去悬浮液中的上清液后，在沉淀细胞中加入含有生长因子的培养基，并接种于培养皿中进行培养； (2)培养一段时间后，向培养基中加入胰酶，并通过消化除去培养中产生的成纤维细胞，然后除去胰酶，并继续培养，从而得到纯化的肝干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述冷PBS溶液的温度为I?5Γ。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述胶原酶溶液为IV型胶原酶溶液； 其中，所述胶原酶溶液的浓度为0.0I %?0.10 %。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述细胞消化的时间为10?20min，温度为 30 ?40°C。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述过滤为采用孔径为100?450目的筛网进行的过滤。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述培养液为DMEM/F12完全培养液。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述单细胞悬浮液离心以及二次离心为以55 Xg的离心力进行离心，并离心3?15min。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述含有生长因子的培养基为DMEM/F12完全培养基； 其中，所述培养基中进一步包含表皮生长因子、谷氨酰胺0.2mol/L，胰岛素以及氢化可的松 lug/ml; 其中，所述表皮生长因子的浓度为10?30ng/mL，所述谷氨酰胺的浓度为0.1?0.3mol/L，所述胰岛素的浓度为I?I Oug/ mL，所述氢化可的松的浓度为0.5?2ug/ml。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述胰酶的质量分数为0.05%?0.55%。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述向培养基中加入胰酶，并通过消化除去培养中产生的成纤维细胞为向培养基中胰酶后，并观察培养所得细胞贴壁生长情况，当培养生成的纤维细胞大部分脱落，而肝干细胞仍然贴壁时，除去胰酶，继续培养；并重复上述步骤直至培养所得细胞为纯肝干细胞。
【文档编号】C12N5/0735GK105925525SQ201610504748
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】石毅, 董欣, 熊丽东
【申请人】吉林省中科生物工程股份有限公司