一种用于制备nk细胞的试剂盒及其应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于制备NK细胞的试剂盒及其应用方法，该试剂盒包括：(1)NK细胞的纯化体系；(2)NK细胞的诱导分化体系；(3)NK细胞的诱导成熟体系；(4)NK细胞的诱导增殖体系；其中，IL?2的终浓度为10ng/ml，IL?15的终浓度为50ng/ml。本申请仅仅通过低剂量的IL?2和IL?15两种细胞因子组合，实现在体外可以高效稳定地扩增NK细胞，在NK细胞的培养过程中，不仅可以促进NK细胞的增殖分化，也可以促进NK细胞分泌IFN?γ、TNF?α等细胞因子，产生协同促进的作用，增强其抗瘤活性，而且体外扩增的NK细胞回输到体内后，延长NK细胞凋亡的时间，可显著提高肿瘤治疗的效果。
【专利说明】
一种用于制备NK细胞的试剂盒及其应用方法
技术领域
[0001]本发明属于细胞培养领域，具体地，涉及一种用于制备NK细胞的试剂盒及其应用方法。
【背景技术】
[0002]目前，癌症已超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2014年12月公布，根据报告预测，全球每年新增癌症患者数呈迅猛增长态势，由2012年的1400万名，将逐年增加到2025年的1900万人，2035年的2400万人。癌症是中国居民死亡的主要原因之一，据全国肿瘤登记中心发布的数据显示，2012年全世界癌症病例新增1400万癌症病例，约有820万人死亡。根据2012年全国登记年报，中国每年新增癌症患者350万例，占全球总数的两成，平均每天确诊9889人，全国每分钟有6人被诊断为癌症，约有250万人死于癌症。手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的三大常规方式。传统的治疗癌症的手段，虽然能在短时间内有效减轻肿瘤负荷，但因其不能有效得清除肿瘤细胞，手术后微小残存病灶、对化疗产生耐药及对放疗不敏感的患者肿瘤易发生转移，且副作用大等弊端，使得肿瘤的临床疗效不显著。肿瘤细胞免疫治疗作为一种全新的肿瘤全身治疗方式，能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，副反应小等良好的临床治疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭肿瘤细胞的第四大治疗肿瘤的新技术。
[0003]目前，肿瘤细胞免疫治疗应用于临床的细胞有DC细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞和NK细胞等。自然杀伤性细胞(Natural killer cells,NK cells)是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，无需抗原的预先致敏和活化即可发挥细胞毒效应，并可分泌多种细胞因子及趋化因子。NK细胞是一个非常安全的效应细胞，可以避免细胞因子风暴、肿瘤溶解综合症。活化的NK细胞能够表达多种共刺激因子，如⑶80、⑶86、⑶70、0X40L、2B4等，直接与T细胞相互作用而刺激获得性免疫应答;活化的NK细胞也可能具有APC样表型，直接行使抗原提呈功能从而促进T细胞免疫应答。人类NK细胞具有特有的标志CD56和CD16分子但缺乏T细胞抗原CD3XD16为免疫球蛋白Fe受体，介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)效应，⑶56分子为粘附分子。人类NK细胞定义为表型⑶3—OT16+⑶56+。爾细胞含有大量的NK穿孔素和颗粒酶B攻击靶细胞。同时，NK细胞分泌IFN-γ、TNF-a、GM-CSF和IL-3等细胞因子间接杀伤肿瘤。K562是人体外周血NK细胞敏感的靶细胞，对其杀伤功能的检测可作为NK细胞功能检测的主要指标之一。
[0004]目前，NK细胞制备技术中存在以下问题:
[0005](I)经体外扩增回输到病人体内有效的NK细胞效应细胞数量少，作用于肿瘤靶细胞的杀伤功能较低，且浸润到肿瘤组织的NK细胞数量非常少。因而限制了肿瘤治疗的效果，不能显著的提高肿瘤患者尤其是晚期患者的生存期。(2)正常人体外周血中的NK细胞数量较少，仅占外周血的淋巴细胞的10%?20%。
[0006]因此，NK细胞培养扩增后提高细胞的数量和细胞的杀伤功能是两大关键因素。如何提高上述两大关键因素是目前肿瘤细胞免疫治疗技术亟需解决的问题。
[0007]NK细胞是先天免疫中一类重要的细胞，通过细胞毒作用和分泌细胞因子参与集体抗感染和抗肿瘤免疫。NK细胞根据CD56分子表达密度的不同可将NK细胞分为CD56bl:1ght和⑶56dim两个亚群，人正常PBMC中约90%NK细胞是⑶56dim，同时表达⑶16分子，主要参与NK细胞毒作用；约10 %NK细胞是⑶56biight亚群，不表达或低表达⑶16分子，主要参与NK细胞分泌细胞因子的作用。静止的NK细胞只表达IL-2亲和力受体，低剂量IL-2不能有效促进NK细胞的杀伤水平，可能是低剂量的IL-2不能诱导高亲和力受体的表达，当加入IL-15后，促进IL-2高亲和力IL-2R表达，从而促进NK细胞杀伤功能。IL-2是第一个被批准用来治疗肿瘤的细胞因子。体内和体外的实验表明IL-2能增加NK细胞的数量，提高NK细胞的杀伤力能力。对于临床而言，体内注射细胞因子IL-2扩增NK细胞的效果有限，对患者毒副作用大，临床上体内大剂量IL-2，会引起严重的毛细血管渗漏综合症。目前体外扩增NK细胞后回输给患者是临床常用的方法。体外NK细胞扩增单独使用IL-2，虽然可刺激T细胞增殖、调节B细胞的增殖与分化，但IL-15对NK细胞的发育和分化的调节作用十分明显。研究表明，IL-15能够促进CD34+造血干细胞定向分化为NK细胞，并对NK细胞的发育分化及维持长期体外存活等方面有显著作用。因此本研究采用的IL-2和IL-15联合使用，扩增NK细胞。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种解决上述技术问题的用于制备NK细胞的试剂盒及其应用方法。
[0009]本发明通过下述技术方案实现:
[0010]一种用于制备NK细胞的试剂盒，包括:
[0011](I)NK细胞的纯化体系；
[0012](2)NK细胞的诱导分化体系，包括:1L-2以及IL-15;
[0013](3)NK细胞的诱导成熟体系，包括:NK细胞扩增剂、IL-2以及IL-15;
[0014](4)NK细胞的诱导增殖体系，包括:1L-2以及IL-15;
[0015]其中，各体系中，IL-2的终浓度为10ng/ml，IL-15的终浓度为50ng/ml。
[0016]本申请中所说的IL-2的低剂量具体是指IL-2的终浓度为10ng/ml、大剂量具体是指IL-2的终浓度为100ng/ml。
[0017]为解决现有技术中扩增培养NK细胞时使用大剂量的IL-2，易引起严重的毛细血管渗漏综合症等副作用的问题，本申请降低IL-2的剂量，避免上述问题的发生，提高临床使用安全性，另一方面，低剂量IL-2的使用，会导致由其培养的NK细胞的扩增数量及其杀伤力能力降低(相对大剂量的IL-2来说)，而为了保持优良的NK细胞的扩增数量及其杀伤力能力，本申请仅仅通过低剂量的IL-2和IL-15两种细胞因子组合，实现在体外可以高效稳定地扩增NK细胞，而且在NK细胞的培养过程中，不仅可以促进NK细胞的增殖分化，同时也可以促进NK细胞分泌IFN-γ、TNF_a等细胞因子，产生协同促进的作用，增强其抗瘤活性，而且体外扩增的NK细胞回输到体内后，延长NK细胞凋亡的时间，可显著提高肿瘤治疗的效果。
[0018]IL-2和IL-15具有相似的空间结构，其相应受体共用况、γ c亚单位，但在功能上两者并不相同。IL-15对NK细胞的发育和分化的调节作用十分明显。研究表明，IL-15能够促进CD34+造血干细胞定向分化为NK细胞。IL-2和IL-15对PBMC和同种异体抗原活化，能免疫上调NK细胞的比例。低剂量IL-15和低剂量IL-2具有协同刺激NK细胞杀伤功能的作用，低剂量IL-2不能诱导高亲和力受体的表达，加入IL-15后，促进IL-2高亲和力受体的表达，从而促进NK细胞杀伤活性。
[0019]所述NK细胞扩增剂中主要含有IFN-γ、TNF-a、TNF-0、GM_CSF等。其联合细胞因子IL-2和IL-15，可以增加IL-2R和IL-15R的表达。同时，能够体内外显著地扩增DC，刺激T细胞和NK细胞增殖。
[0020]其中，所述(I)NK细胞的纯化体系包括:Perco 11分离液。将Perco 11分离液配制成分布在37.5 %-50 %区间的6个密度梯度，且每个梯度相差2.5 %，S卩，6个密度梯度分别为:37.5%、40%、42.5%、45%、47.5%、50%。通过将获得的PBMC铺于该密度梯度的上层并低速离心，以去除⑶3+细胞，获得纯化的NK细胞。
[0021]其中，所述(2)NK细胞的诱导分化体系还包括:含有5%自体血清的NK细胞扩增培养基。
[0022]其中，所述(3)NK细胞的诱导成熟体系还包括:抗⑶3单克隆抗体、重组人纤维连接蛋白和含5%自体血清的NK细胞扩增培养基。其中，所述抗CD3单克隆抗体的终浓度为50ng/ml，所述重组人纤维连接蛋白的终浓度为lyg/ml。
[0023]其中，所述(4)NK细胞的诱导增殖体系还包括:含有5%自体血清的NK细胞扩增培养基。
[0024]其中，NK细胞扩增剂包括以下成分:GM-CSF、IL_4和TNF-a;
[0025]其中，本申请中所述的NK细胞扩增培养基包括:无血清培养基、2mmol/L左旋谷氨酰胺、100U/ml青霉素以及I OOU/ml链霉素。本申请所述的NK细胞扩增培养基由于加入了左旋谷氨酰胺、青霉素以及链霉素，能够有效防止/抑制培养基中细菌的生长。
[0026]一种应用上述试剂盒制备NK细胞的方法，包括以下步骤:
[0027](I )NK细胞的纯化:将获得的PBMC去除⑶3+细胞，获得纯化的NK细胞；
[0028](2)NK细胞的诱导分化:将经过上述步骤(I)获得的纯化后的NK细胞用培养基重悬，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15进行培养，第3天，离心后，再用培养基重悬NK细胞，加入终浓度为10ng/ml的IL-2以及终浓度为50ng/ml的IL-15，并调整NK细胞浓度，继续培养并根据培养基颜色半量补充IL-2、IL-15和培养基，每天记录NK细胞浓度；
[0029](3 )NK细胞的诱导成熟:第7天，将悬浮的NK细胞转移至经抗⑶3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，加入培养基、终浓度为10ng/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15和NK细胞扩增剂，继续培养；
[0030](4)NK细胞的诱导增殖:第8-13天，根据培养基颜色补充培养基，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15，继续培养至NK细胞生长到所需数量即可。
[0031 ]其中，上述步骤(I )NK细胞的纯化可以为:
[0032]先用PBS将？6代011分离液渗透压调至28508/1^ H2O,再用pH7.2的PBS将PercolI分离液配成37.5%?50%区间的6个梯度，每个梯度相差2.5%，按照密度从高到低的添加顺序依次加入试管中，将获得的PBMC铺于该试管上层，低速(在2000rpm下离心30min)离心，去除⑶3+细胞，获得纯化的NK细胞。纯化后的NK细胞主要分布于(42.5?47.5)%的梯度层，以42.5%梯度层的NK细胞含量最高。
[0033]其中，上述步骤(2)NK细胞的诱导分化可以为:用含有5%自体血清的NK细胞扩增培养基重悬NK细胞，NK细胞浓度为1.0 X 16个/ml，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15，置于37°C、5 %CO2培养箱中培养，第3天，离心后，再用含有5 %自体血清的NK细胞扩增培养基重悬NK细胞，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15 ， 并调整 NK 细胞浓度为1.0?2.0 X 16个/ml，置于37°C、5%C02培养箱中继续培养。根据培养基颜色，半量补充IL-2、IL-15和培养基，每天记录NK细胞浓度。
[0034]将NK细胞浓度调整为1.0?2.0 X 16个/ml保证细胞后续培养正常，不调整细胞数量的话，后续扩增就会出现问题，导致细胞增长不起来，或提前凋亡。
[0035]其中，上述步骤(3)NK细胞的诱导成熟可以为:第7天，将悬浮的NK细胞转移至经终浓度为50ng/ml的抗CD3单克隆抗体和终浓度为lyg/ml的重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并加入含有5 %自体血清的NK细胞扩增培养基，终浓度为10ng/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15和4ml NK细胞扩增剂，置于37°C,5%CO2培养箱中培养，以后根据培养基颜色半量补充含5%自体血清的NK细胞扩增培养基。
[0036]其中，上述步骤(4)NK细胞的诱导增殖可以为:第8-13天，根据培养基颜色补充含5%自体血清的NK细胞扩增培养基，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15 ，置于 37°C 、5%C02 培养箱中继续培养 ，第14天，当NK细胞生长到所需数量即可。
[0037]其中，上述NK细胞的制备方法中，所述PBMC通过以下方式获得:
[0038]采集肿瘤患者外周血50ml，肝素抗凝，加入等量PBS至血细胞中以稀释血细胞，2000印111，离心101^11，将稀释的外周血缓慢加入比重为1.077的人淋巴细胞分离液层上，二者比例为1:1。离心20min，将呈白雾状的单个核细胞层轻轻吸出，移入另一离心管中。用PBS稀释，2000rpm，离心5min，洗涤3次低速离心后得到PBMC，并用NK细胞扩增培养基调整PBMC密度为1.0 X 16个/ml。分离血清:另取30ml血液，37°C凝固I?2h，当血清自然析出后，4°C，30000rpm离心1min，得到血清，备用。
[0039]本发明具有如下的优点和有益效果:
[0040](I)本发明细胞制备得到的NK细胞，其主要效应细胞为⑶3-⑶56+T细胞，且具有很高的纯度和活性，经流式细胞仪分析检测CD3-CD56+T细胞的含量约占异质性细胞群体的30%?70%以上。
[0041](2)本发明细胞制备的NK细胞增殖速度快，经检测，NK细胞在培养第14天数量可达(5.0±0.2)Χ109，活率达90% 以上。
[0042](3)本发明培养的⑶3-⑶56+细胞比例高，经检测培养14天后⑶3-⑶56+细胞产率可达(89.40±2.65)%;当效靶比为40:1时，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性平均为(65.27土3.52) %。表明本发明所制备的NK细胞具有很好靶向杀伤肿瘤细胞的临床效应。
【附图说明】
[0043]此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中:
[0044]图1为采用本发明方法培养的NK细胞含量的流式细胞仪分析图。
【具体实施方式】
[0045]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例及附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0046]本发明中提到的各英文缩写分别为:
[0047]DC:树突状细胞；
[0048]CIK:细胞因子诱导的杀伤细胞；
[0049]GM-CSF:粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；
[0050]PBMC:外周血单个核细胞；
[0051 ] TNF-α:肿瘤坏死因子-α;
[0052]TNF-β:肿瘤坏死因子-β;
[0053]IFN-γ:干扰素-γ;
[0054]IL-2:白细胞介素-2;
[0055]IL-15:白细胞介素-15;
[0056]IL-3:白细胞介素-3。
[0057]实施例1
[0058]1、卩81(:的制备:
[0059]采集肿瘤患者外周血50ml，肝素抗凝，加入等量PBS至血细胞中，混匀，稀释血细胞，2000印111，离心101^11。将稀释的外周血缓慢加入比重为1.077的人淋巴细胞分离液层上，二者比例为1:1 AOOg，离心20min，将呈白雾状的单个核细胞层轻轻吸出，移入另一离心管中。用I3BS稀释，2000rpm，离心5min，洗涤3次低速离心后得到PBMC，并用NK细胞扩增培养基调整PBMC密度为1.0 X 16个/ml。分离血清:另取30ml血液37 °C凝固I?2h，当血清自然析出后，4°C，30000rpm离心lOmin，得到血清，备用。
[0060]2、NK细胞纯化:
[0061 ] 先用PBS将？6代011原液渗透压调至28508/1^ H2O,用pH7.2的PBS将PercolI配成37.5 %?50 % 6个密度梯度，每个梯度相差2.5%,按密度由高到低依次缓缓加于20ml试管中，将得到的PBMC铺于上层，低速离心，去除⑶3阳性细胞，获得纯化的NK细胞。NK细胞主要分布于(42.5?47.5) %梯度层，以42.5 %梯度层含量最高。
[0062]3、NK细胞的诱导分化:
[0063]用含有5%自体血清的NK细胞扩增培养基重悬NK细胞浓度为1.0 X 16个/ml，加入终浓度为10ng/ml IL-2、50ng/ml IL-15，混匀后加入到75cm2培养瓶中，置于37°C、5%C02培养箱常规培养。第3天，离心后，用含有5 %自体血清的NK细胞扩增培养基重悬细胞，加入终浓度为10ng/ml IL-2、50ng/ml IL-15，混匀后，调整NK细胞浓度为I.0?2.0 X 16个/ml，置于37°C、5 % CO2培养箱中培养。第4-6天，继续观察培养基颜色，半量换液，加入所需的刺激因子和培养液，每天记录NK细胞浓度。
[0064]4、NK细胞的诱导成熟:
[0065]第7天，将悬浮的NK细胞转移至经抗⑶3单克隆抗体(终浓度50ng/ml)和重组人纤维连接蛋白(终浓度lyg/ml)包被的175cm2培养瓶中，并加入含有5%自体血清NK细胞扩增培养基，终浓度为10ng/ml IL-2、50ng/ml IL-15和4mlNK细胞扩增剂，置于37°C、5%C02培养箱中培养。以后根据培养液颜色，半量补充含5 %自体血清NK细胞扩增培养基。
[0066]5、NK细胞的诱导增殖:
[0067]第8-13天，观察培养基颜色变化，补充5%自体血清的NK细胞扩增培养基，加入终浓度为10ng/ml IL-2、50ng/ml IL-15，置于37°C、5%C02培养箱中培养。第14天，当细胞生长到所需数量即可收集使用或冻存。
[0068]实施例1制得的NK细胞的生物学特性检测
[0069]1、细胞活性、细胞纯度、增殖力及免疫表型的检测
[0070]取培养14天ΙΟΟμΙ浓度为16个/ml的细胞，加入ΙΟΟμΙ 0.4%台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明制备的NK细胞活率可高达90 %以上，如图1所示。此外，用细胞计数板进行计数，培养第14天时，NK细胞扩增数量达到(1.5 ± 0.2) X19个/ml，细胞增殖倍数达到外周血分离得到的PBMC(89.60±57.17)倍。
[0071]分别收集培养第O、8、14天的细胞，调整细胞密度为1.0 X 15个/ml，加入抗体CD3PE-Cy5、CD4-PE、CD8-FITC 抗体标记 T 细胞亚群；加入 CD3-FITC、CD 16+56-PE 抗体标记 NK ；加入鼠抗人抗体FITC-1gGl、PE-1gGl作为对照进行免疫分型检测。上述抗体各10μ1，室温避光孵育30min，用I3BS洗涤2次，流式细胞仪检测。IL-2和IL-15组合培养，扩增后细胞总数、NK细胞、T细胞数均有明显变化，其中，本发明制备的NK细胞⑶3-⑶16+CD56+可达到(89.40 土2.65)%, T 细胞数量 CD4+T 细胞和 Treg 细胞(20.43 ± 4.86) %、( 26.89 ± 7.32)比例明显降低。
[0072]2、NK细胞对人红白血病K562杀伤力特性的检测
[0073]传代培养24?48h对数生长期的K562(经台盼蓝染色，活性大于95%)，调整细胞浓度为2 X 16个/ml，加入5lCr3.7MBq 37 °C、5 %CO2孵育I.5h，中间每隔15min晃动I次，标记完毕，洗涤3次，调整细胞数至I X 15个/ml，获取标记的K562为靶细胞。收集细胞因子刺激的PBMC，为效应细胞。按效靶比5:1,10:1,20:1,40:1各100μ1接种于96孔板。靶细胞最大释放孔，加10μ1裂解液，靶细胞、5%的胎牛血清RPMI1640各100μ1，各组均设3个平行孔，置于370C,5%⑶2培养箱中孵育4h，200g离心5min，吸取上清液50μ1，加入96孔平底酶标板中，加入50ylLDH底物反应液，室温下避光防止30min，每孔加50μ1反应终止液终止酶促反应。用酶标检测仪在490nm处测定已空白组为基准值A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算NK细胞对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性(％ )=(实验组平均值A-自然释平均值A)/(最大释放平均值A值-自然释平均值A) X 100%。
[0074]结果显示:本申请制备的NK细胞具有良好的杀伤活性，NK细胞对K562细胞的杀伤活性为(51.35±2.64)%，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性为(31.95 ± 5.43) %。其中，当本发明制备的NK细胞与K562细胞效靶比40:1时，NK的特异性杀伤活性最高，为(72.37 土3.96)%； NK细胞对CNE2细胞(效靶比40:1)杀伤活性为(54.67 ± 3.96) %。
[0075]单独使用IL-2制备的NK细胞方法相同，获得的NK细胞比例为(32.76±3.45) %。
[0076]以上所述的【具体实施方式】，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的【具体实施方式】而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种用于制备NK细胞的试剂盒，其特征在于，包括: (1)NK细胞的纯化体系； (2)NK细胞的诱导分化体系，包括:1L-2以及IL-15; (3)NK细胞的诱导成熟体系，包括:NK细胞扩增剂、IL-2以及IL-15; (4)NK细胞的诱导增殖体系，包括:1L-2以及IL-15; 其中，各体系中，IL-2的终浓度为10ng/ml，IL-15的终浓度为50ng/ml。2.根据权利要求1所述的一种用于制备NK细胞的试剂盒，其特征在于，所述(I)NK细胞的纯化体系包括:Perco 11分离液。3.根据权利要求1所述的一种用于制备NK细胞的试剂盒，其特征在于，所述(2)NK细胞的诱导分化体系还包括:含有5%自体血清的NK细胞扩增培养基。4.根据权利要求1所述的一种用于制备NK细胞的试剂盒，其特征在于，所述(3)NK细胞的诱导成熟体系还包括:抗CD3单克隆抗体、重组人纤维连接蛋白和含5%自体血清的NK细胞扩增培养基，其中，所述抗CD3单克隆抗体的终浓度为50ng/ml，所述重组人纤维连接蛋白的终浓度为lyg/ml。5.根据权利要求1所述的一种用于制备NK细胞的试剂盒，其特征在于，所述(4)NK细胞的诱导增殖体系还包括:含有5%自体血清的NK细胞扩增培养基。6.根据权利要求3至5中任一项所述的一种用于制备NK细胞的试剂盒，其特征在于，所述NK细胞扩增培养基包括:无血清培养基、2mmol/L左旋谷氨酰胺、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。7.应用如权利要求1至6中任一项所述的试剂盒制备NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: (I )NK细胞的纯化:将获得的PBMC去除⑶3+细胞，获得纯化的NK细胞； (2)NK细胞的诱导分化:将经过上述步骤(I)获得的纯化后的NK细胞用培养基重悬，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15进行培养，第3天，离心后，再用培养基重悬NK细胞，加入终浓度为10ng/ml的IL-2以及终浓度为50ng/ml的IL-15，并调整NK细胞浓度，继续培养并根据培养基颜色半量补充IL-2、IL-15和培养基，每天记录NK细胞浓度； (3 )NK细胞的诱导成熟:第7天，将悬浮的NK细胞转移至经抗⑶3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，加入培养基、终浓度为10ng/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15和NK细胞扩增剂，继续培养； (4)NK细胞的诱导增殖:第8-13天，根据培养基颜色补充培养基，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15，继续培养至NK细胞生长到所需数量即可。8.根据权利要求7所述的制备NK细胞的方法，其特征在于，所述步骤(I)NK细胞的纯化具体为: 先用PBS将?6^011分离液渗透压调至28508/1^ H2O,再用pH7.2的PBS将PercolI分离液配成37.5%?50%区间的6个梯度，每个梯度相差2.5%，按照密度从高到低的添加顺序依次加入试管中，将获得的PBMC铺于该试管上层，低速离心，去除CD3+细胞，获得纯化的NK细胞。9.根据权利要求7所述的制备NK细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)NK细胞的诱导分化具体为:用含有5 %自体血清的NK细胞扩增培养基重悬NK细胞，NK细胞浓度为1.0XlO6个/ml，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15，置于37 °C,5% CO2培养箱中培养，第3天，离心后，再用含有5%自体血清的NK细胞扩增培养基重悬NK细胞，加入终浓度为10即/1111的11^2和终浓度为501^/1111的11^15，并调整爾细胞浓度为1.0?2.0\106个/ml，置于37 °C、5 % CO2培养箱中继续培养，根据培养基颜色，半量补充IL_2、IL-15和培养基，每天记录NK细胞浓度。10.根据权利要求7所述的制备NK细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)NK细胞的诱导成熟具体为:第7天，将悬浮的NK细胞转移至经终浓度为50ng/ml的抗CD3单克隆抗体和终浓度为lyg/ml的重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并加入含有5%自体血清的NK细胞扩增培养基，终浓度为10ng/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的IL-15和4ml NK细胞扩增剂，置于37°C、5%C02培养箱中培养，以后根据培养基颜色半量补充含5%自体血清的NK细胞扩增培养基； 所述步骤(4)NK细胞的诱导增殖具体为:第8-13天，根据培养基颜色补充含5%自体血清的NK细胞扩增培养基，加入终浓度为10ng/ml的IL-2和终浓度为50ng/ml的IL-15，置于37°C、5%C02培养箱中继续培养，第14天，当NK细胞生长到所需数量即可。
【文档编号】C12N5/0783GK105925527SQ201610335200
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】赵西娟, 邓珍珍, 袁媛, 孟祥玲
【申请人】成都百赛泰科生物科技有限公司