Wtx稳定敲低人结肠癌细胞及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种WTX稳定敲低人结肠癌细胞及其制备方法，其中WTX稳定敲低人结肠癌细胞的制备方法，其包括以下步骤：1)构建沉默WTX的SHRNA的质粒载体；2)以步骤1)所得的沉默WTX的SHRNA的质粒载体转染人结肠癌细胞；3)以G418稳定步骤2)所得的人结肠癌细胞。本发明所述的WTX稳定敲低人结肠癌细胞能够更好的用于在结肠癌研究中。
【专利说明】
WTX稳定敲低人结肠癌细胞及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明设及生物领域，具体设及一种WTX稳定敲低SW480细胞及其制备方法。
【背景技术】
[0002] WTX(Wilm's tumor on X chromosome,又称。411238、41631、05〔5)，是首个被发现 定位于X染色体上的抑癌基因，于2007年首次在《Science》上被报道，其后，先后被证实在 Wilms瘤、合并有烦骨硬化症的条纹状骨病(OSCS)、白血病、肾上腺皮质瘤、肝癌、胃癌中存 在不同程度突变，提示WTX可能在多种肿瘤的发生发展中发挥作用，但其在结直肠癌中的作 用目前尚未见报道，其对结直肠癌发生、发展、患者预后的影响尚处于未知。本研究旨在通 过瞬时转染结合G418药物筛选的方法构建抑癌基因WTX稳定敲低结直肠癌SW480细胞系，为 进一步研究抑癌基因rrx对结直肠癌发生、进展的明确作用W及作用机制提供分子生物学 工具。
【发明内容】
[0003] 为了解决如前提到的问题，本发明一个方面提供了一种rrx稳定敲低人结肠癌细 胞的制备方法，其包括W下步骤：
[0004] 1)构建沉默WTX的ShRNA的质粒载体；
[0005] 2) W步骤1)所得的沉默WTX的ShRNA的质粒载体转染人结肠癌细胞；
[0006] 3) WG418稳定步骤2)所得的人结肠癌细胞。
[0007] 进一步地，步骤1)的质粒载体通过W下方法获得：
[000引 la)设计ShRNA序列为：
[0009] Ib)用特异性快切酶快速双酶切碱基序列(优选地，酶切条件:37°C摄氏度，0.5~ 化），露出BamHI/Agel粘性末端，与同步双酶切并纯化后的GV112真核表达载体用Iigase buffer特效连接(优选地，连接条件:22°C摄氏度，45min~化），连接产物转化D册a感受态细 菌，挑选阳性克隆菌，测序鉴定。
[0010] 进一步地，步骤2)的转染是通过W下步骤获得：
[0011] 2a)测序结果显示构建成功的阳性克隆菌，大量摇菌进行质粒中量提取；
[0012]化)步骤2a)提取得到的质粒用无菌DEPC7JC溶解，卵日离子脂质体法将质粒转染至 人直肠癌细胞中；
[0013] 优选地，阳离子脂质体法中所用的阳离子脂质体为lipofectimane2000。
[0014] 进一步地，步骤3)的稳定是通过W下步骤获得：
[0015] 3a)将步骤2)所得的转染后的结直肠癌SW480细胞，按50%~70%密度接种；
[0016] 3b)铺板2地后，加入G418,细胞生长达90%时可用含G418的培养基传代继续培养：
[0017] 3c)维持药物浓度持续培养10~14天，并在对照组细胞全部死亡时终止筛选，得到 慢病毒稳定感染的细胞株；
[001引优选地，步骤3b)的G418的浓度为lOOOng/ml。
[0019] 进一步地，所述的人结肠癌细胞为SW480细胞。
[0020] 本发明的另一个方面提供了如前所述制备方法获得的rrx稳定敲低人结肠癌细 胞。
[0021] 本发明的另一个方面提供了一种干扰或沉默WTX基因的RNA，其序列为：
[0022] SiRNA 为：
[0023] 日'-TGCCCTATATGAGTTCTAT-3';
[0024] 5'-CAATAGTGATGAAGGTTAT-3';或 [00巧]5'-CTGACTTTCCAATCCTATA-3';或
[0026] SiRNA为双链RNA，其序列为：
[0027] 5^-Ccggagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcacttttttg-3/ 和
[0028] 5^-曰曰ttc曰曰曰曰曰曰gtgccct曰t曰tg曰gttct曰tctcg曰g曰t曰g曰曰etc曰t曰t曰gggc曰Ct-S^ O
[0029] 本发明另一个方面提供了如前所述RNA在干扰或沉默WTX基因中的用途。
【附图说明】
[0030] 图1为WQPCR筛选WTX最有效干扰片断结果图。
[0031] 图2为^Western Blotting筛选WTX最有效干扰片断结果图。
[0032] 图3为根据WTX SiRNA-I设计ShRNA载体序列
[0033] 其中，第一行中的CCgg为限制性内切酶AgeI酶切位点，第二行中的aattcaaaaa为 限制性内切酶EcoRI酶切位点。
[0034] 图4为^Western Blotting验证SW480细胞中WTX沉默效率结果图。
[00巧]图5为WQPCR验证SW480细胞WTX沉默效率结果图。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1WTX干扰S iRNA序列的设计
[0037] WTX的CDS区全长3405bp，编码1135AA，在CDS区散在选取3个位点作为SiRNA的目标 祀点。在各位点逐个碱基之间前后移动进行序列筛选，保证所选3条SiRNA祀序列长度19~ 2化P，GC含量在40%~50%左右，并逐条经过NCBI blast比对，检测序列的特异性，验证是 否为人类其它基因的同源序列。同时选用RNAi设计时公认的scramble序列作为对照，对照 序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT，使用前再次b 1 as t比对验证与WTX基因是否有同源性。将所选3 条SiRNA及1条scramble序列，联系广州维真生物技术公司进行化学合成。
[0038] 设计3条WTX干扰片段，序列如下：
[0039] ^乂干扰片段1序列（313臟1)5'-16〔(：口'41416461'1'押41'-3'
[0040] WTX干扰片段2序列（siRNA2)5' -CAATAGTGATGAAGGTTAT-3'
[0041 ] WTX干扰片段3序列（siRNA3)5' -CTGACTTTCCAATCCTATA-3'
[0042] Scramb 1 e 序列 5 ' -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 '
[0043] 实施例2WTX SiRNA片段转染结直肠癌SW480细胞
[0044] 将siRNAl-3及scramble片段按照Inmol :50ul DEPC水混匀稀释，配制成lOiiM/L的 工作液，-200°C储存备用。将生长状态良好的结直肠癌SW480细胞接种于6孔培养板，常规生 长24h后，待细胞密度约50%-70%时，使用lipofectamine2000阳离子脂质体法瞬时转染细 胞。获得Si-I、Si-2和Si-3细胞W及对照细胞(con化ol或NC)，其中Si-I是WsiRNAl进行干 扰后获得的细胞，Si-2是WsiRNA2进行干扰后获得的细胞，Si-3是WsiRNA3进行干扰后获 得的细胞，对照细胞是^scramble片断进行干扰的细胞。
[0045] 实施例3QPCRW及Western blotting检测并筛选最有效干扰片段
[0046] 细胞经过SiRNA瞬时转染后4她，收集六孔板内各组目的细胞与对照组细胞，用PBS 清洗目的细胞W及对照组细胞各2次，加入Trizol逐级提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA， QPCR分析目的细胞W及对照细胞中WTX相对表达量。QPCR的实验结果采用柱状图形式表示， 通过柱状图的高低直接反应细胞内mRNA的表达含量，我们选取柱状图结果最低的细胞组所 对应转染的SiRNA为WTX最有效干扰SiRNA,因此筛选得至IjWTX最有效干扰序列。QPCR实验W GAPDH做内参。所用引物序列：
[0047] WTX:sense:5' -GACCCAAAAGGATGAAGCT-3';
[0048] antisense:5'-CCCCTCCAAAGAAACTAGGC-3'，
[0049] GAP畑：sense: 5^TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3';
[0050] antisense:5' -CCATTGATGACAAGCTTCCCG-3'。
[0051 ] 实验结果参见附图1。通过数值的对比可知，siRNAl、siRNA2、siRNA3能够降低WTX 的表达，其中SiRNAl相比于对照组降低最多，能够达到40%左右。
[0052] 分别收集六孔板内经过SiRNA瞬时转染的各组目的细胞与对照组细胞，提取细胞 全蛋白，BCA法测定蛋白浓度，用lysis buffer调整各组样品浓度至相近水平，按比例加入 loading buffer，煮沸变性蛋白质;配置10%的SDS-PAGE胶，在胶内各泳道中，按顺序将处 理好的蛋白样品各30ug进行加样并分离电泳，电泳后切取目的条带湿法转至0.22um PVDF 膜，5 %的脱脂奶粉室溫封闭化，一抗4 °C解育过夜，PBST清洗5min巧次，辣根酶标记的二抗 室溫解育化，PBST清洗5min巧次，E化曝光观察，对比曝光条带，实验结果参见附图2。因为条 带的粗细W及密度可W直接反应内参齐平的条件下，细胞内目的蛋白的表达含量。我们选 取曝光条带最弱的泳道SiRNAl,对应得到该组样品所转染的SiRNA序列，该序列即为所有用 的SiRNA中，可W对WTX最有效干扰的序列。综上方法，我们选取得到干扰效果最强的SiRNAl 条带。WGAPDH做内参。
[0053] 实施例4shRNA质粒载体的构建与测序
[0054] 筛选最有效的SiRNA片段，W祀标序列为主链，根据碱基互补配对原则，设计SiRNA 序列所对应的"互补片段"。W此特异性SiRNA祀标序列W及其"互补片段"为环状RNA的两端 "枝干"，在片段中间插入构建环状RNA所特需的6碱基"茎环"结构，"茎环"结构碱基序列选 用结构稳定的乂 TCGAG"序列。设计好ShRNA茎环与枝干主体结构后，在枝干两端插入EcoRI/ AgeI限制性内切酶酶切位点序列，化学合成法逐个碱基合成设计好的的双链Oligo序列。 [0055] 其中ShRNA序列为:ShRNA为双链RNA，序列为：
[0056] 5^-Ccggagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcacttttttg-3/和
[0057] 5^-aattcaaaaaagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcact-3^
[OO5引用特异性快切酶快速双酶切碱基序列（酶切条件：37°C，0.5~Ih)，露出BamHI/ AgeI粘性末端，与同步双酶切并纯化后的GVl 12真核表达载体用Iigase buffer特效连接 (连接条件：22°C，45min~化），连接产物转化D册a感受态细菌，挑选阳性克隆菌，摇菌后菌 液测序鉴定。
[0059] 实施例5shRNA质粒载体转染结直肠癌SW480细胞
[0060] 将测序结果显示构建成功的阳性克隆菌，大量摇菌进行质粒中量提取，所提取质 粒用无菌DEPC水溶解，测定质粒浓度，用Iipof ectimane2000阳离子脂质体法转染结直肠癌 SW480细胞。
[0061 ] 实施例6G418筛选浓度测定W及筛选得到WTX感染稳定株
[0062] W未经转染的结直肠癌裸细胞SW480对G418最佳用药浓度进行筛选，将结直肠癌 细胞接种于24孔板，待次日细胞密度达50%~70%时，更换培养基并加入浓度分别为 500叫/1111，800雌/1111，1000叫/1111，2000叫/1111，3000叫/1111的6418开始筛选，^10~14天内细 胞全部死亡的最低浓度定为最佳筛选浓度。筛选结果确定G418最佳用药浓度为lOOOng/ml。
[0063] 将ShRNA转染后的结直肠癌SW480细胞，按50 %~70 %密度接种于六孔板，铺板24h 后，按比例加入浓度为lOOOng/ml的G418,细胞生长达90%时可用含G418的培养基传代继续 培养，维持药物浓度持续培养10~14天，并在对照组细胞全部死亡时可终止筛选。得到WTX 被稳定干扰的细胞株SW480. shW。
[0064] 实施例7QPCR验证细胞株mRNA水平表达变化
[0065] 细胞瞬时转染后4她，用PBS清洗目的细胞W及对照组细胞各2次，加入化izol逐级 提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA，QPCR分析目的细胞W及对照细胞中WTX相对表达量。 GAPDH做内参。所用引物序列：
[0066] WTX:sense:5' -GACCCAAAAGGATGAAGCT-3';
[0067] antisense:5'-CCCCTCCAAAGAAACTAGGC-3'，
[0068] GAP畑：sense: 5' -TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3';
[0069] antisense:5' -CCATTGATGACAAGCTTCCCG-3'。
[0070] 实验结果参见附图5
[0071] 实施例SWestern blotting验证细胞株蛋白水平表达变化
[0072] 细胞瞬时转染后72h，收集目的W及对照组细胞，提取细胞蛋白质，western blotting检测验证目的细胞W及对照细胞株中WTX的相对表达量，GAPDH做内参。实验结果 参见附图4,对比两条泳道内电泳条带，根据条带的粗细W及密度，可W得到在内参齐平的 条件下，SW480. ShW细胞内WTX蛋白表达丰度明显低于未经过处理的细胞，条带明显变淡、变 细、密度减低。结果表明本发明的细胞株W T X的相对表达量相比于对照组有明显降低， SW480. ShW细胞系中几乎不含有WTX。
[0073] 实现在WTX内源性表达较高的结直肠癌SW480细胞内，稳定敲低抑癌基因WTX，构建 SW480. ShW细胞系，为后续研究WTX生物学功能提供分子工具。
【主权项】
1. 一种WTX稳定敲低人结肠癌细胞的制备方法，其包括以下步骤： 1) 构建沉默WTX的ShRNA的质粒载体； 2) 以步骤1)所得的沉默WTX的shRNA的质粒载体转染人结肠癌细胞； 3) 以G418稳定步骤2)所得的人结肠癌细胞。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤1)的质粒载体通过以下方法获得： la) 设计shRNA序列为： lb) 用特异性快切酶快速双酶切碱基序列（优选地，酶切条件：37°C摄氏度，0.5~Ih)， 露出BamHI/Agel粘性末端，与同步双酶切并纯化后的GV112真核表达载体用ligase buffer 特效连接(优选地，连接条件：22°C摄氏度，45min~Ih)，连接产物转化DH5a感受态细菌，挑 选阳性克隆菌，测序鉴定。3. 根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其中，步骤2)的转染是通过以下步骤获 得： 2a)测序结果显示构建成功的阳性克隆菌，大量摇菌进行质粒中量提取； 2b)步骤2a)提取得到的质粒用无菌DEPC水溶解，以阳离子脂质体法将质粒转染至人直 肠癌细胞中； 优选地，阳离子脂质体法中所用的阳离子脂质体为lip〇fectimane2000。4. 根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其中，步骤3)的稳定是通过以下步骤获 得： 3a)将步骤2)所得的转染后的结直肠癌SW480细胞，按50 %~70 %密度接种； 3b)铺板24h后，加入G418，细胞生长达90 %时可用含G418的培养基传代继续培养： 3c)维持药物浓度持续培养10~14天，并在对照组细胞全部死亡时终止筛选，得到慢病 毒稳定感染的细胞株； 优选地，步骤3b)的G418的浓度为1000ng/ml。5. 根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其中，所述的人结肠癌细胞为SW480细胞。6. 根据权利要求1-5任一项所述制备方法获得的WTX稳定敲低人结肠癌细胞。7. -种干扰或沉默WTX基因的RNA，其序列为： si RNA 为： 57-TGCCCTATATGAGTTCTAT-37 ； Y-CAATAGTGATGAAGGTTAT-3';或 5'-CTGACTTTCCAATCCTATA-3';或 shRNA 为： 57-Ccggagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcacttttttg-3 7 和 57-aattcaaaaaagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcact-3 7 〇8. 根据权利要求7所述的RNA在干扰或沉默WTX基因中的用途。
【文档编号】C12N15/113GK105925529SQ201610421093
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】张庆玲, 马文霞, 刘霞
【申请人】南方医科大学