高转移胰腺癌细胞株及其构建方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种高转移胰腺癌细胞株及其构建方法和应用。胰腺癌细胞株，命名为人胰腺癌细胞系BxPC?3M8，保藏号为：CCTCC NO：C2016119。本发明通过将胰腺癌细胞株BxPC?3反复8次进行Transwell穿膜实验，筛选得到了BxPC?3M8细胞系，该细胞系具有高转移性和侵袭性，能够被用于制备哺乳动物胰腺癌模型，研究胰腺癌细胞转移机制，提取胰腺癌转移和复发的标志物，筛选和评估治疗胰腺癌药物，开发胰腺癌复发检测试剂盒等用途，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。CCTCC NO：C201611920160603
【专利说明】
高转移膜腺癌细胞株及其构建方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物学和肿瘤学领域，特别是设及一种高转移膜腺癌细胞株及其构建 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是严重威胁我国人民生命健康的第一大"杀手"，已成为亟待解决的公共健康 问题!最新研究提示我国癌症新发病例和死亡病例逐年增加，其中2015年约有429.2万新发 浸润性癌症病例，平均每天新发约12000例;有281.4万癌症死亡病例，平均每天约7500人死 于癌症。膜腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一。膜腺癌发病率在全球范围内呈逐年上升趋 势，年轻化、病程短、进展快、预后差、死亡率高是膜腺癌的临床及生物学特征。我国膜腺癌 的年发病率为5.1/10万，较20年前大幅升高。由于缺乏早期诊断和有效的治疗方法，中晚期 膜腺癌的中位生存期仅有3~4个月，膜腺癌患者5年生存率低于5%，又被成为"癌症之王"。
[0003] 研究已经证实肿瘤转移是膜腺癌患者的主要死因。对膜腺癌侵袭、转移机制的研 究一直都是热点问题，而建立良好的细胞实验模型是研究膜腺癌侵袭转移机制的重要方 法。但目前缺少理想的体外研究细胞模型，制约科研工作者进一步深入研究膜腺癌转移，亟 需建立和鉴定合适的高转移膜腺癌细胞模型。
[0004] 肿瘤细胞具有异质性。由生物学特性和侵袭转移力不完全相同的肿瘤细胞亚群组 成。而肿瘤的侵袭转移能力取决于异质性的母系群体中少数高转移能力的细胞，通过多次 筛选，某些高转移亚系细胞可W稳定下来。同时，不适应和不稳定亚系被去除，获得的是较 稳定的具有较强侵袭转移能力的亚系。运为研究肿瘤侵袭转移机制提供了理想的细胞模 型。W往大部分研究者都是通过动物体内筛选的方法筛选出肿瘤细胞亚系。但运种方法耗 时长，操作难度大，重复性差，成功率较低。
[0005] 但目前缺少理想的体外研究细胞模型，制约科研工作者进一步深入研究膜腺癌转 移。建立和鉴定合适的高转移膜腺癌细胞模型，有助于筛选膜腺癌复发转移的关键祀点，为 成功开发抗复发转移的临床治疗手段提供新策略，有着重要的科学意义和临床价值！
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种具有高转移性和侵袭性的膜腺癌细胞株。
[0007] 一种膜腺癌细胞株，命名为人膜腺癌细胞系BXPC-3M8,保藏于位于中国武汉武汉 大学的中国典型培养物保藏中屯、，保藏日期为2016年6月3日，保藏号为：CCTCC NO: C2016119。
[000引本发明又提供了所述膜腺癌细胞株的子代细胞。所述子代细胞基本或全部保留了 亲代膜腺癌细胞系BXPC-3M8的特性，也是具有高转移性和侵袭性的。
[0009] 本发明还提供了一种所述膜腺癌细胞株的构建方法，所述构建方法为Transwell 迁移试验法，起始细胞株为膜腺癌细胞BxPC-3，试验重复次数为8次。
[0010] 将化answel 1小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上 层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液W聚碳酸醋膜相隔，将细胞种在上室内， 由于聚碳酸醋膜有通透性，下层培养液中的成分可W影响到上室内的细胞，从而可W研究 下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。通过将亲代膜腺癌细胞多次重复 Transwe 11迁移试验，能够筛选驯化得到高转移的膜腺癌细胞。
[0011] BxPC-3细胞源自一个日本女性膜腺癌活检标本，由化n MH等人在1982年建立的人 膜腺癌细胞系，是目前膜腺癌研究中常用的细胞模型。STR(短串联重复序列)是广泛分布在 真核生物基因组中的简单重复序列，通常采用PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小 分离等位基因进行检测。通过STR检测分析发现，BXPC-3M8与亲代BxPC-3完全同源，不存在 其他细胞的交叉污染，细胞形态和增殖速度没有显著区别。但是BXPC-3M8的迁移和侵袭能 力显著强于BxPC-3细胞。
[0012] 本发明还提供了所述的膜腺癌细胞株在制备哺乳动物膜腺癌模型中的应用。所述 的哺乳动物为裸小鼠或裸大鼠。通过将一定细胞数量的所述膜腺癌细胞BXPC-3M8接种于裸 小鼠或裸大鼠的皮下、腹腔或者尾静脉等部位，获得高转移性膜腺癌的动物模型。
[0013] 本发明还提供了所述的膜腺癌细胞株在提取膜腺癌转移和复发的标志物中的应 用。通过与低转移性膜腺癌细胞进行比较研究，可W发现高转移膜腺癌的分子标记，针对该 分子标记可W进行后续的药物开发等应用。
[0014] 本发明还提供了所述的膜腺癌细胞株在筛选和评估治疗膜腺癌药物中的应用。首 先，通过向所述膜腺癌细胞化PC-3M8培养基中添加不同药物，观察细胞状态变化，获得初步 有效的候选药物。然后，将候选药物施药于上述高转移性膜腺癌动物模型，观察与未施药组 动物的存活期、肿瘤大小、转移情况等，筛选获得潜在治疗膜腺癌的药物。
[0015] 本发明还提供了所述的膜腺癌细胞株在开发膜腺癌复发检测试剂盒中的应用。可 W采用蛋白组学技术，分析比较亲代BxPC-3细胞和高转移膜腺癌细胞系BXPC-3M8分泌蛋白 质的差异表达，筛选出与膜腺癌肝转移相关的分泌蛋白质，开发出检测高转移膜腺癌特定 分泌蛋白表达情况的检测试剂盒，该试剂盒可用于检测膜腺癌转移和复发情况。
[0016] 本发明通过将膜腺癌细胞株BxPC-3反复8次进行化answe 11穿膜实验，筛选得到了 BXPC-3M8细胞系，该细胞系具有高转移性和侵袭性，能够被用于制备哺乳动物膜腺癌模型， 研究膜腺癌细胞转移机制，提取膜腺癌转移和复发的标志物，筛选和评估治疗膜腺癌药物， 开发膜腺癌复发检测试剂盒等用途，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好 的科研、经济和社会效益。
【附图说明】
[0017] 图1为实施例2中BxPC-3和BXPC-3M8细胞形态检测图；
[001引图2为实施例4中BxPC-3和BXPC-3M8细胞的生长曲线检测结果图；
[0019] 图3为实施例5中BxPC-3和BXPC-3M8细胞的划痕实验结果比较图；
[0020] 图4为实施例6中BxPC-3和BXPC-3M8细胞的迁移实验结果比较图；
[0021] 图5为实施例7中BxPC-3和BXPC-3M8细胞的侵袭实验结果比较图。
【具体实施方式】
[0022] 实验材料；
[0023] 细胞株:膜腺癌细胞株BxPC-3，膜腺癌细胞BxPC-3M8。
[0024] 试剂耗材:1640培养液(杭州吉诺生物医药技术有限公司）、0.25%膜酶(杭州吉诺 生物医药技术有限公司）、胎牛血清(G化CO公司KGiemsa染色试剂盒(南京建成生物科技有 限公司）、60mm和1 OOmm培养皿(Corning公司）、6孔和24孔Transwe 11小室(孔径祉m，corning 公司）、基质胶(Matrigel)。
[00巧]基础培养液:含10 %胎牛血清的1640培养液。
[00%]无血清培养液：1640培养液。
[0027]仪器:正置显微镜、倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、血球细胞计数器。
[002引实施例1 BXPC-3M8细胞系建立
[0029] 将膜腺癌细胞株BxPC-3用1640培养液（无血清培养基）制备1 X lOVmL单细胞悬 液，然后在孔径为祉m的6孔板Transwell小室的上室加 ImL所述单细胞悬液，下室加 2血基础 培养液，培养4她后，收集穿过化answell小室隔膜的细胞，扩增培养。重复上述操作8次后， 获得BXPC-3M8细胞。
[0030] 实施例2细胞形态学检测
[0031] 将10万个BxPC-3和BXPC-3M8细胞接种于60mm培养皿，培养基为基础培养液，培养 72小时，至60 %~70 %贴壁率，去培养液，PBS洗涂2次，Gi emsa染色(完全按照试剂盒操作说 明），正置显微镜下观察，拍照。
[0032] 如图1所示，与亲代细胞BxPC-3比较，BXPC-3M8的细胞大小、细胞轮廓等差异不大， 但是细胞克隆相对松散，细胞间隙较大。
[0033] 实施例3 BXPC-3M8细胞STR检测分析
[0034] 委托中国典型培养物保藏中屯、对BXPC-3M8细胞进行STR检测分析，检测方法如下： 提取待检细胞的DNA，采用Golden巧e? 20A STR复合扩增试剂盒进行扩增，在ABI 3100型遗 传分析仪上连续对20个已知的STR位点和性别基因 Amelogenin进行检测分析，W确定待检 测细胞的种属来源，判断其细胞是否存在交叉污染，检测结果如表1所示。
[0035] 表 1 「nnoi： 1
[0037] 检测报告的结论为：
[0038] l、BxPC-3M8细胞系在各基因座均未出现S等位基因现象，细胞中没有发现人类细 胞交叉污染。
[0039] 2、BXPC-3M8细胞系STR数据与美国ATCC、德国和日本JCRB的STR数据库中数据相对 比，在JCRB、DSMZ细胞库中均找到与其细胞分型100%相匹配的细胞，细胞名称为BxPC-3。
[0040] 实施例4细胞生长曲线检测
[0041 ] 分别将5万个BxPC-3和BXPC-3M8细胞接种于IOOmm培养皿，培养基为基础培养液， 培养72~96小时，至70 %~90 %贴壁率，更换新鲜培养液，0.25 %膜酶消化，收集细胞，细胞 计数，配制10000个ZmL浓度的单细胞悬液，分别每孔接种SmL单细胞悬液至30个60mm培养 皿，每总细胞数为50000个。依据情况更换培养液，保证充足的营养成分，分别在24、48、72、 96、120、144、168、196小时，消化3皿细胞计数，取平均值，绘制生长曲线。
[0042] 结果如图2所示，BXPC-3M8与BxPC-3生长曲线大致重合，BXPC-3M8与BxPC-3体外增 殖速度没有显著性区别。
[0043] 实施例5划痕实验
[0044] 在6孔板中接种50万个BxPC-3和BXPC-3M8细胞，培养基为基础培养液，长至100% 融合度时，换无血清培养液，用无菌的20化L枪头划痕，洗涂2遍，去除悬浮细胞，换无血清培 养液培养，选取划痕宽度合适，边界规整的区域标记，每隔24小时显微镜下观察拍照，比较 两种细胞水平移动能力的差异。
[0045] 结果如图3所示，无血清培养24小时后，BXPC-3M8细胞的划痕间隙宽度明显小于 BxPC-3细胞，说明BXPC-3M8细胞的水平方向的运动能力显著强于BxPC-3细胞。
[0046] 实施例6细胞迁移实验
[0047] 消化BxPC-3和BXPC-3M8细胞，用无血清培养液制取5 X lOVmL单细胞悬液，在24孔 板Transwell (孔径为祉m)上室加 2(K)化单细胞悬液，下室加 60化L基础培养液。24小时去除 Transwell上室细胞，Gimsa染色，割取Transwell隔膜，封片后正置显微镜下观察，并拍照。 [004引结果如图4所示，同样条件下，BXPC-3M8细胞穿过化answell隔膜的细胞显著多于 BxPC-3细胞，说明BXPC-3M8细胞的迁移能力显著强于BxPC-3细胞。
[0049]实施例7细胞侵袭实验
[0化0]用基质胶(matrigel)和无血清培养液按1:5混合，每个化answell小室（24孔板，孔 径为祉m)加3化L混合液，均匀覆盖隔膜，37 °C解化包被4小时，备用。消化BxPC-3和化PC-3M8 细胞，用1640培养液制取5 XioVmL单细胞悬液，在已经用基质胶（matrigel)包被好的 Transwel I上室加2(K)化单细胞悬液，下室加6(K)化基础培养液。48小时后，去除Transwel I上 室细胞，Gimsa染色，割取化answell隔膜，封片后正置显微镜下观察，并拍照。
[0化1] 结果如图5所示，同样条件下，BxPC-3M8细胞穿过Tr an swell隔膜（基质胶 (matrigel)包被）的数目显著多于BxPC-3细胞。说明BXPC-3M8细胞的侵袭能力显著强于 BxPC-3 细胞。
【主权项】
1. 胰腺癌细胞株，其特征在于，命名为人胰腺癌细胞系BXPC-3M8，保藏号为:CCTCC NO: C2016119。2. 如权利要求1所述的胰腺癌细胞株的子代细胞。3. 如权利要求1所述胰腺癌细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法为 Transwel 1迀移试验法，起始细胞株为胰腺癌细胞BxPC-3，试验重复次数为8次。4. 如权利要求1所述的胰腺癌细胞株在建立哺乳动物胰腺癌模型中的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的哺乳动物为裸小鼠或裸大鼠。6. 如权利要求1所述的胰腺癌细胞株在提取胰腺癌转移和复发的标志物中的应用。7. 如权利要求1所述的胰腺癌细胞株在筛选或评估治疗胰腺癌药物中的应用。8. 如权利要求1所述的胰腺癌细胞株在开发胰腺癌复发检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105925530SQ201610435135
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】蒋东海, 陈炳洁, 谢海洋, 周琳, 郑树森
【申请人】浙江大学