专一性产γ-环糊精的γ-环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种专一性产γ?环糊精的γ?环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，将菌株Alkalophilic Bacillus sp.G?825?6的γ?环糊精葡萄糖基转移酶第211位的酪氨酸突变为亮氨酸，得到突变体Y211L；其制备方法为：(1)设计突变引物，进行突变PCR；(2)将PCR后的质粒进行DpnI酶切后转化至超级感受态细胞XL?10?Gold中；(3)挑取阳性克隆进行培养提取质粒DNA；(4)测序确定突变完成。本发明所构建的突变体Y211L，催化淀粉不产生α?环糊精，产生β?环糊精的相对含量为3％，产生γ?环糊精的相对含量为97％，具有较强的γ?环糊精制备专一性，为γ?环糊精的规模化生产提供有效保障。
【专利说明】
专一性产丫-环糊精的丫-环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及 其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其是设及一种通过对丫-环糊精葡萄糖基转移酶进 行定点突变W提高丫-环糊精专一性的方法。
【背景技术】
[0002] 环糊精葡萄糖基转移酶即CG化se，是一种将淀粉转化为环糊精的酶，目前大多数 的CGTase作用淀粉生成的产物均为a、e、丫 S种环糊精的混合物，为提高产物的专一性，现 有技术多采用基因工程的方法，通过对CG化Se的基因序列进行改造和突变，实现产物专一 性的相对提高。例如，Goetz Parsiegla等人将来源于Bacillus circulans ShainS的0- CGT酶在区域（146-151)处的氨基酸残基用一个Asp取代，丫-CD的产率明显提高（Substrate binding to a cyclodextrin glycosyItransferase and mutations increasing the y- cyclodextrin production[J].European Journal of Biochemistry.1998,255(3):710- 717.) ;van der Veen等人将来源于B.circulans 251 的P-CGhse中的Arg47突变为Gln后， 酶的产物专一性向生成大环糊精的方向移动（Engineering of cyclodextrin glycosyI transferase reaction and product specificityl[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology.2000,1543(2): 336-360.)O
[0003] 然而，目前由于酶法合成的专一性较差，且大多数酶主要是生产e-CD的CG化Se，其 中主要生产丫-CD的CGhse未见报道。嗜碱芽抱杆菌A化alo地ilic Bacillus sp.G-825-6 的丫 -CGhse能够催化淀粉产生e-CD及丫 -CD,不产生a-CD，且e-CD与丫 -CD的比例为I: I左 右，将其用于丫 -CD的生产，比其他菌株来源的CG化Se具有选择优势，然而，为进一步提高其 产丫 -CD的选择性，将其改造为主要生产丫 -CD的CG化Se，需要对原始菌株所产CG化Se进行 突变。至今，尚未发现对来自菌株A]_kalophilic Bacillus sp.G-825-6的丫-CGhse进行突 变从而进一步提高其催化专一性的报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的上述问题，本发明人提供了一种专一性产丫 -环糊精的丫- CG化Se突变体Y21IL，该突变体能够催化淀粉制备丫 -环糊精使其相对含量达到97 %，进而 扩大其应用范围。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 本发明提供了一种专一性产丫 -环糊精的丫 -环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，具 体是将来自于A化alo地ilic Bacillus sp.G-825-6菌株的丫-环糊精葡萄糖基转移酶（丫- CG化Se)第211位的酪氨酸突变为亮氨酸，得到突变体Y211L。
[0007] 本发明还提供了上述突变体Y211L的制备方法，包括W下步骤：
[000引（1)选择含有丫-CG化Se的基因序列SEQ ID NO: 1作为模板，设计突变引物，进行突 变 PCR;
[0009] (2)将PCR后的质粒进行化nl酶切，转化至感受态细胞中；
[0010] (3)挑取阳性克隆进行培养，提取质粒DNA进行测序W确定突变完成。
[0011] 进一步地，本发明所提供的制备突变体Y211L的方法如下所述：
[0012] 步骤（1)中的模板是来自于大肠杆菌的重组质粒(pET-20b( + )/丫-CGT)，具体地， 是通过W下步骤获得：
[001引 a. WSEQ ID NO: 1为模板，设计引物为SEQ ID NO:2所示的核巧酸序列，进行PCR， 得到删除NdeI的序列；
[0014] b. W步骤a中PCR后的产物为模板，设计引物分别为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所 示的两对核巧酸序列，进行PCR，得到删除BamHI的序列；
[0015] C. W步骤b中PCR后的产物为模板，设计引物为SEQ ID N0:5所示的核巧酸序列，进 行PCR，得到两端重新携带NdeI和BamHI的序列；
[0016] d.将上述步骤C中PCR后的产物序列和购自上海生工的载体pET-20b( + )进行NdeI 和BamHI双酶切后，用连接酶进行连接，即得重组质粒(pET-2化( + )/ 丫 -CGT);
[0017] 优选地，双酶切的条件如下：DNA扣L，限制性内切酶NdeI和BamHI各IiiUfast digestion buffer化L，水12化，维持反应溫度38°C，20min，之后在75°C的条件下维持 IOmin使其灭活;连接条件如下:经双酶切后的祀T-20b( + )载体及模板序列各1.扣L，T4连接 酶化L，水15化，22°C维持过夜。上述限制性内切酶购自化ermo Scientific公司，型号是 fast digestion。
[0018] 更进一步地，步骤（I)中设计的突变引物为SEQ ID N0:6所示的核巧酸序列，具体 如下：
[0019] 正向引物：5 ' -CATCTATCGCAATCTGCTTGATCTGGCCAGCC-3 '
[0020] 反向引物:5 ' -GGCTGGCCAGATCAAGCAGATTGCGATAGATG-3 '
[0021] 下划线为突变基因；
[0022] 突变PCR的反应体系为:DNA模板10~10化g，IOiiM正向突变引物化L，IOiiM反向突变 引物luL，l〇mM的dNTPs ljiL，5Xreaction buffe;rl0iiL，2.5U/iiL的reaction DNA Polymerasel. 5化，用灭菌的双蒸水补充至50化。所述buffer和DNA Polymerase均为定点突 变试剂盒提供，购买公司是T'hermo Scientific,型号是如；LkChange Lighting。
[00剖步骤(1)中突变PCR的反应条件如下：
[0024] 预变性:95~98°C，2~5min;
[0025] 变性:95 ~98°C，20 ~40s;
[0026] 退火：55 ~60°C，20 ~40s;
[0027] 延伸：68~72°C，2~5min;
[0028] 上述变性、退火、延伸共进行25~35个循环；
[0029] 延伸68 ~72°C，3 ~8min;
[0030] 冷却至2~6°C。
[0031] 优选地，步骤(1)突变PCR的反应条件如下：
[0032] 预变性:95°C，3min;变性:95°C，30s;退火:55°C，30s;延伸：72°C，3min;上述变性、 退火、延伸共进行30个循环;延伸:72°C，5min;冷却至4°C。
[0033] 步骤(2)中的感受态细胞是超级感受态细胞XklO-Gold;
[0034] 上述步骤(2)的步骤如下：
[0035] 取PCR产物50化加入20UAiL的限制性内切酶化nl化L，充分混匀后将该酶切体系 于37°C条件下消化化；
[0036] 将酶切后的消化产物转化至宿主菌中，具体步骤如下：
[0037] a.从-80 r冰箱中取出感受态细胞化-10-Go Id置于冰上解冻；
[0038] b.取45化刚刚解冻好的感受态细胞和扣L化nl消化产物放于提前预冷好的2mL无 菌离屯、管中，用枪头轻柔吹打混匀，继续冰浴30min;
[0039] C.将试管放到42°C水浴锅中，准确热激60s，立即置于冰上5min;
[0040] d.加入SOOiiL预热的不含氨节青霉素的无菌LB培养基，混匀后置于37°C摇床W 20化/min振荡培养1.化，使菌体复苏；
[0041 ] e.培养结束后，500化/min离屯、5min，去掉上清液40化L，将余下的感受态细胞涂布 在含有氨节青霉素的LB固体琼脂培养基上，将平板置于室溫直至液体被吸收，倒置平板，37 °C培养12~16h。
[0042] 其中，步骤(3)中的操作步骤如下：
[0043] 挑取步骤e中培养后LB平板上的单菌落接种至含有10化g/mL氨节青霉素的LB液体 培养基中，置于37°C恒溫摇床中W2(K)r/min振荡培养lOh，然后提取质粒进行测序鉴定;将 测序正确的质粒转化至E.COli化2UDE3K购于南京百斯凯科技有限公司），挑取单菌落接 种至含有10化g/血氨节青霉素钢的LB液体培养基中，置于37°C恒溫摇床中W2(K)r/min振荡 培养过夜，保藏菌种即得到含有突变质粒的基因工程菌，将该基因工程菌置于-80°C冰箱中 保藏。
[0044] 本发明有益的技术效果在于：
[0045] 获得效果更好的环糊精葡萄糖基转移酶突变体、从而进一步提高环糊精产物的产 率和专一性一直是本领域的研究热点，本发明利用基因工程改造的方法制备获得 A化alophilic Bacillus sp.G-825-6菌株的丫-环糊精葡萄糖基转移酶突变体Y211L，催化 淀粉制备丫-环糊精，产物专一性可提高至97 %，运为丫 -环糊精的工业化生产提供了可靠 的酶的来源，能够促进我国环糊精产业突破丫 -环糊精的生产工艺，实现丫-环糊精的自主 研发生产。
【附图说明】
[0046] 图1为突变前对比例的丫 -CG化Se催化淀粉产生环糊精的示意图；
[0047] 图2为实施例3的Y211L 丫 -CG化Se突变体催化淀粉产生环糊精的示意图。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合说明书附图，对本发明进行具体描述。
[0049] 实施例1
[0050] Y21IL 丫-CGhse的制备
[0化1] (1)突变 PCR
[0052] a. WSEQ ID NO: 1为模板，设计引物为SEQ ID NO:2所示的核巧酸序列，进行PCR， 得到删除NdeI的序列；
[0化3] b. W步骤a中PCR后的产物为模板，设计引物分别为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所 示的两对核巧酸序列，进行PCR，得到删除BamHI的序列；
[0054] C. W步骤b中PCR后的产物为模板，设计引物为SEQ ID N0:5所示的核巧酸序列，进 行PCR，得到两端重新携带NdeI和BamHI的序列；
[0化日]d.将上述步骤C中PCR后的产物序列和购自上海生工的载体pET-20b( + )进行NdeI 和BamHI双酶切，具体为：DNA扣L，限制性内切酶Nde巧日BamHI各1化，fast digestion buf fer化L，水12化，维持反应溫度38°C，20min，之后在75°C的条件下维持IOmin使其灭活； 选择经双酶切后的祀T-20b( + )载体及模板序列各1.扣L，T4连接酶化L，水15化，22 °C维持过 夜;完成上述连接酶的连接过程，即得重组质粒(pET-2化( + Vy-CGT);
[0化6] W该重组质粒(pET-2化( + )/丫-CGT)为模板，设计突变引物为SEQ ID N0:6所示的 核巧酸序列，进行突变PCR;
[0化7] 突变PCR的反应体系为:DNA模板10~10化g，IOiiM正向突变引物化L，IOiiM反向突变 引物luL，l〇mM的dNTPs ljiL，5Xreaction buffe;rl0iiL，2.5U/iiL的reaction DNA Polymerasel. 5化，用灭菌的双蒸水补充至50化。所述buffer和DNA Polymerase均为定点突 变试剂盒提供，购买公司是化ermo Scientific,型号是如化化ange Lighting;
[0化引突变PCR的反应条件为：预变性:95 r，3min;变性：95 r，30s ;退火：55 r，30s;延 伸:72°C，3min;上述变性、退火、延伸共进行30个循环;延伸:72°C，5min;冷却至4°C。
[0059] (2)酶切、转化
[0060] 取上述步骤（1)中的PCR产物50化加入20UAiL的限制性内切酶化nl化L，充分混匀 后将该酶切体系于37°C条件下消化化；
[0061 ]将酶切后的消化产物转化至宿主菌中，具体步骤如下：
[0062] a.从-80°C冰箱中取出感受态细胞化-10-Go Id置于冰上解冻；
[0063] b.取45化刚刚解冻好的感受态细胞和扣L化nl消化产物放于提前预冷好的2mL无 菌离屯、管中，用枪头轻柔吹打混匀，继续冰浴30min;
[0064] C.将试管放到42°C水浴锅中，准确热激60s，立即置于冰上5min;
[0065] d.加入SOOiiL预热的不含氨节青霉素的无菌LB培养基，混匀后置于37°C摇床W 20化/min振荡培养1.化，使菌体复苏；
[0066] e.培养结束后，500化/min离屯、5min，去掉上清液40化L，将余下的感受态细胞涂布 在含有氨节青霉素的LB固体琼脂培养基上，将平板置于室溫直至液体被吸收，倒置平板，37 °C培养12~16h。
[0067] (3)挑取阳性克隆、测序确定突变完成
[0068] 挑取上述步骤(2)中培养后LB平板上的单菌落接种至含有10化g/血氨节青霉素的 LB液体培养基中，置于37°C恒溫摇床中W20化/min振荡培养lOh，然后提取质粒进行测序鉴 定;将测序正确的质粒转化至E. COli化2UDE3)，挑取单菌落接种至含有10化g/mL氨节青 霉素钢的LB液体培养基中，置于37°C恒溫摇床中W2(K)r/min振荡培养过夜，保藏菌种即得 到含有突变质粒的基因工程菌，将该基因工程菌置于-80°C冰箱中保藏。
[0069] 实施例2
[0070] (1)将玉米淀粉溶于50ml的PH8.5的浓度为50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液中，制成 I %的溶液，微波加热2-3min使其糊化。
[0071] (2)取（1)中配置好的溶液1ml，加入0.抓/g淀粉的Y211L 丫-CG化Se在50°C下反应 1化。
[0072] (3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
[0073] (4)取步骤(3)中的反应液50化1和50化1 0.2M pH4.2的醋酸钢缓冲溶液混合，并 向其中加入〇.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38°C下反应16h。
[0074] (5)将步骤(4)所得的反应液煮沸IOmin灭酶，灭酶后ISOOOg离屯、5min。
[0075] (6)对上述步骤离屯、后的产物进行册LC测定，测定条件为：色谱柱Hyper si 1畑2 (4.6mmX250mm，5mAPS-2Hypersil微粒），示差折光检测器(RID-10A);流动相为70%乙腊水 溶液，流速为ImL/min，柱溫40°C。经测定，丫 -环糊精相对含量为94.21 %。
[0076] 实施例3
[0077] (1)将玉米淀粉溶于50ml的PH8.5的浓度为50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液中，制成 1 %的溶液，微波加热2-3min使其糊化。
[007引 （2)取（1)中配置好的溶液Iml，加入0.5U/g淀粉Y21IL 丫 -CGTase在50°C下反应 2地。
[0079] (3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
[0080] (4)取步骤(3)中的反应液50化1和50化1 0.2M pH4.2的醋酸钢缓冲溶液混合，并 向其中加入〇.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38°C下反应16h。
[0081 ] (5)将步骤(4)所得的反应液煮沸IOmin灭酶，灭酶后ISOOOg离屯、5min。
[0082] (6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定，丫-环糊精的相对含量为96.45%。
[0083] 实施例4
[0084] (1)将玉米淀粉溶于50ml的PH8.5的浓度为50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液中，制成 1 %的溶液，微波加热2-3min使其糊化。
[00化](2)取（1)中配置好的溶液1ml，加入0.抓/g淀粉的Y211L 丫-CG化Se在50°C下反应 3化。
[0086] (3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
[0087] (4)取步骤(3)中的反应液50化1和50化1 0.2M pH4.2的醋酸钢缓冲溶液混合，并 向其中加入〇.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38°C下反应16h。
[008引（5)将步骤(4)所得的反应液煮沸IOmin灭酶，灭酶后ISOOOg离屯、5min。
[0089] (6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定，丫-环糊精的相对含量为95.14%。
[0090] 对比例
[00川 （1)将玉米淀粉溶于50ml的PH8.5的浓度为50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液中，制成 1 %的溶液，微波加热2-3min使其糊化。
[0092] (2)取（1)中配置好的溶液1ml，加入0.抓/g淀粉的丫-CGhse在50°C下反应2地。
[0093] (3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
[0094] (4)取步骤(3)中的反应液50化1和50化1 0.2M pH4.2的醋酸钢缓冲溶液混合，并 向其中加入〇.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38°C下反应16h。
[0095] (5)将步骤(4)所得的反应液煮沸IOmin灭酶，灭酶后ISOOOg离屯、5min。
[0096] (6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定，丫-环糊精的相对含量为55.12%。
[0097] 将上述对比例和实施例3中得到的产物分别进行测定，具体是采用HPLC测定酶催 化产物，结果如图1和图2所示，其中，图1对应的是对比例的产物测定结果，图2对应的实施 例3的产物测定结果。
[0098] 测定条件为：色谱柱Hypersi 1 畑2(4.6mm X 250mm，5mAPS-2Hypersi 1微粒），示差 折光检测器(RID-IOA);流动相为70%乙腊水溶液，流速为ImL/min，柱溫40°C。
[0099] 分析图1和图2可W看出，采用本发明的突变体Y211L 丫-CG化Se催化玉米淀粉的环 糊精广物，能够使丫 -环糊精的专一性得到极大地提局；丫-环糊精的含量大大提局，而0-环 糊精的含量则显著降低，表明本发明专利所设及的突变体具有较好的产物专一性。
【主权项】
1. 一种专一性产γ-环糊精的γ-环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，将来 自于Alkalophilic Bacillus sp .G-825-6菌株的γ -环糊精葡萄糖基转移酶（γ -CGTase) 第211位的酪氨酸突变为亮氨酸，得到突变体Υ211L。2. -种如权利要求1所述的突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 选择含有γ-CGTase的基因序列SEQ ID NO: 1作为模板，设计突变引物，进行突变 PCR ； (2) 将PCR后的质粒进行DpnI酶切，转化至感受态细胞中； (3) 挑取阳性克隆进行培养，提取质粒DNA进行测序以确定突变完成。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中的模板是来自于大肠杆菌 的重组质粒(pET-20b(+)/ γ -CGT)。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒的具体制备方法为： a. 以SEQ ID NO: 1为模板，设计引物为SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，进行PCR，得到 删除NdeI的序列； b. 以步骤a中PCR后的产物为模板，设计引物分别为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的 两对核苷酸序列，进行PCR，得到删除BamHI的序列； c. 以步骤b中PCR后的产物为模板，设计引物为SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，进行 PCR，得到两端重新携带NdeI和BamHI的序列； d. 将上述步骤c中PCR后的产物序列和载体pET-20b( + )进行NdeI和BamHI双酶切后，用 连接酶进行连接，即得重组质粒(pET-20b(+)/ γ -CGT)。5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中设计的突变引物为SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列，具体如下： 正向引物：5 ' -CATCTATCGCAATCTGCTTGATCTGGCCAGCC-3 ' 反向引物：5 ' -GGCTGGCCAGATCAAGCAGATTGCGATAGATG-3， 下划线为突变基因。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中突变PCR的反应条件如下： 预变性:95~98°C，2~5min; 变性:95 ~98°C，20 ~40s; 退火：55 ~60°C，20 ~40s; 延伸：68 ~72°C，2~5min; 上述变性、退火、延伸共进行25~35个循环； 延伸68~75°C，3~8min; 冷却至2~6°C。7. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的感受态细胞为超级感受 态细胞 XL-10-Gold。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的步骤如下： 取PCR产物50yL加入20U/yL的限制性内切酶DpnI lyL，充分混匀后将该酶切体系于37 °C条件下消化Ih; 将酶切后的消化产物转化至宿主菌中，具体步骤如下： a.从-80 °C冰箱中取出感受态细胞XL-IO-Gold置于冰上解冻； b. 取45yL刚刚解冻好的感受态细胞和5yL DpnI消化产物放于提前预冷好的2mL无菌离 心管中，用枪头轻柔吹打混匀，继续冰浴30min; c. 将无菌离心管放到42°C水浴锅中，准确热激60s，立即置于冰上5min; d. 加入500yL预热的不含氨苄青霉素的无菌LB培养基，混匀后置于37°C摇床以200r/ min振荡培养1.5h，使菌体复苏； e. 培养结束后，5000r/min离心5min，去掉上清液400yL，将余下的感受态细胞涂布在含 有氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37°C培 养12~16h〇9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的操作步骤如下:挑取步骤 e中培养后LB平板上的单菌落接种至含有lOOyg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37 °C恒温摇床中以200r/min振荡培养10h，然后提取质粒进行测序鉴定;将测序正确的质粒转 化至E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种至含有lOOyg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基 中，置于37°C恒温摇床中以200r/min振荡培养过夜，保藏菌种即得到含有突变质粒的基因 工程菌，将该基因工程菌置于_80°C冰箱中保藏。
【文档编号】C12P19/04GK105925547SQ201610511819
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】王金鹏, 范浩然, 张梦柯, 李林林, 金征宇, 谢正军, 赵建伟, 周星, 柏玉香, 田耀旗, 焦爱权, 孟令儒
【申请人】江南大学