基于葡萄糖转苷反应制备混合物高效生产纤维素酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于葡萄糖转苷反应制备混合物高效生产纤维素酶的方法；包括利用葡萄糖或含葡萄糖的糖浆，通过β?糖苷酶催化的转苷反应制备含槐糖混合物，并以其为碳源和诱导物，培养里氏木霉(Trichoderma reesei)，高效生产纤维素酶。发酵罐培养过程通过该混合物批式流加控制发酵液中葡萄糖浓度在0.05?0.30g/L，有利菌丝生长而不抑制纤维素酶生物合成，培养144h时发酵液中纤维素酶活性超过90.0FPU/mL，发酵罐纤维素酶生产强度超过625.0FPU/L/h。高纤维素酶活性和生产强度，显著节省纤维素酶生产设备投资和发酵过程能耗，降低纤维素酶生产成本。
【专利说明】
基于葡萄糖转昔反应制备混合物高效生产纤维素酶的方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物工程与技术领域，具体设及一种基于葡萄糖转巧反应制备混合物 高效生产纤维素酶的方法。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素类生物质是地球上最丰富的可再生资源，通过生物炼制生产的生物能 源和生物基化学品，使用过程产生的二氧化碳可W被植物光合作用吸收，不产生明显的溫 室气体效应。然而，生物炼制生产生物能源和生物基化学品，其成本无法与基于石油和煤等 矿物质资源生产的同类产品竞争。纤维素是木质纤维素类生物质资源中含量最高的碳水化 合物，必须水解为葡萄糖后才能作为微生物发酵的基础原料生产生物能源和生物基化学 品。虽然纤维素组分可W通过酸或碱催化等化学催化水解，但基于纤维素酶催化的水解过 程具有反应条件溫和、副产物少及环境友好等优点，是纤维素组分水解发展的主要方向，然 而纤维素酶生产成本高的问题突出。
[0003] 里氏木霉(Trichoderma reesei)是迄今为止纤维素酶产量最高的菌株，但其纤维 素酶的生物合成需要诱导。纤维素是纤维素酶合成的天然诱导物，因此可W利用各类賴杆 固态发酵生产纤维素酶，李洪兵等公开了 W水稻賴杆为主要原料固态发酵产纤维素酶的方 法(CN105238704)。虽然固态发酵生产纤维素酶成本低，但固态发酵过程无法有效防控杂菌 污染，生产的纤维素酶只能用于饲料和纺织等行业，不能用于水解木质纤维素类生物质资 源中的纤维素组分获得葡萄糖，用于基于微生物纯培养液体深层发酵生产能源和生物基化 学品。
[0004] 液体深层发酵是生产满足木质纤维素类生物质资源生物炼制要求纤维素酶的唯 一选择，国内外均开展了大量研究工作，如冯家励等公开了 W微晶纤维素为诱导物的纤维 素酶液体深层发酵技术(CN201210276891)，但微晶纤维素成本高，特别是微晶纤维素需要 通过菌株基础纤维素酶缓慢水解后才能获得菌体生长所需的葡萄糖和纤维素酶诱导所需 的诱导物(J Biol Chem 1997,272:10169-10174)，纤维素酶发酵所需时间长，不仅导致纤 维素酶生产强度低，发酵罐设备投资大，而且显著增加了纤维素酶发酵过程揽拌与通风的 能耗。因此，研究开发可溶性高效诱导物是纤维素酶液体深层发酵必须解决的技术问题。
[0005] 槐糖是目前发现的纤维素酶生产最佳的可溶性诱导物（J Bacteriol 1962,83: 400-408)，但槐糖的价格极其昂贵，无法用于液体深层发酵大规模生产纤维素酶。乳糖也可 W诱导T.reesei合成纤维素酶（A邮 1 Microbiol Biotechnol 1995,44:106-111;化OS one2013,8:e62631)，而且乳品加工行业副产的含有乳糖的乳清或乳清粉成本较低，是纤维 素酶液体深层发酵工业化生产中可W使用的可溶性诱导物。但是采用乳糖进行诱导，液体 深层发酵过程发酵液中纤维素酶活性低及生产强度低的"双低"问题突出。纤维素酶活性低 使粗酶使用时对纤维素组分水解过程稀释作用大，难W获得高浓度糖，满足后续发酵过程 的要求，运种粗酶液通常需要浓缩处理;纤维素酶生产强度低导致生产设备投资大，发酵过 程通风与揽拌的能耗高。因此，目前纤维素酶生产成本很高，无法满足木质纤维素类生物质 资源生物炼制生产能源、燃料和各种化学品过程纤维素组分酶水解对低成本纤维素酶的需 求。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的纤维素酶发酵生产过程补加纤维素类 不溶性诱导物成本高和控制难及乳糖等可溶性诱导物发酵过程纤维素酶酶活低和生产强 度低的突出问题，提供一种基于葡萄糖转巧反应制备混合物高效生产纤维素酶的方法。
[0007] 为解决所述纤维素酶发酵生产中存在的突出问题，本发明W葡萄糖或含葡萄糖的 糖浆为底物，通过e-糖巧酶催化的转巧反应，制备低成本的W槐糖为主的e-二糖且含有葡 萄糖的混合物(MGD)，进而WMGD为碳源和诱导物，培养T.reesei高效生产纤维素酶。该方法 通过MGD流加补料策略，控制培养过程发酵液中的葡萄糖浓度，使其促进菌丝生长而不抑制 纤维素酶的生物合成。
[0008] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现的，设及一种高效生产纤维素酶的方 法，所述方法包括如下步骤：
[0009] S1、利用葡萄糖或含葡萄糖的糖浆，通过0-糖巧酶催化的转巧反应制备含槐糖混 合物MGD;
[0010] S2、W所述MGD为碳源，培养T.reesei，高效生产纤维素酶。
[0011] 优选的，步骤S2中，培养过程通过MGD的批式流加控制发酵液中葡萄糖浓度在 0.05-0.30g/L。本发明通过批式流加策略优化控制发酵液中葡萄糖浓度，使其有利 T.reesei菌丝生长而不抑制纤维素酶生物合成，实现纤维素酶高效生产。
[0012] 优选的，含槐糖混合物MGD的批式流加具体为:待发酵液中葡萄糖耗尽时将溫度降 至25 °C后，开始流加MGD;根据发酵液中葡萄糖浓度调控MGD流加速度，使得发酵液中葡萄糖 浓度为 0.05g/l-0.30g/L。
[0013] 优选的，步骤S2中，培养过程中，将T.reesei抱子悬浮液按发酵液体积10%接种于 发酵培养基中，28°C发酵培养至葡萄糖耗尽即可。
[0014] 优选的，培养过程中，利用流加氨水控制pH为不低于4.2,控制溶氧不低于20%饱 和值。
[001引优选的，所述发酵培养基包括:含总糖5-15g/L的MGD，蛋白腺Ig/L，尿素0.3g/L， (畑4)2504 1.4邑/1，1(出？04 2邑/1，]\%504.7此0 0.3邑/1，(：曰(：12 0.4邑/1，尸6504.7出0 5111邑/1， 111504.出0 1.7111邑/1，化504*7出0 1.4111邑/1，(：〇(：12 2111邑/1，吐溫80 0.2111171，5001111710.21 pH 5. ONasHPO广巧樣酸缓冲液。
[0016] 优选的，T.reesei抱子接种于固体培养基中，28°C下培养7d，用无菌水洗下抱子； 洗下的抱子，接种于液体培养基中，于28°C和15化pm条件下培养2地，即得所述T.reesei抱 子悬浮液。
[0017] 优选的，所述固体培养基包括30g/L麦芽粉和15g/L琼脂。
[0018] 优选的，所述液体培养基包括4g/L葡萄糖和lOg/L玉米浆。
[0019] 本发明中使用的0-糖巧酶为商品酶制剂，本领域技术人员应当并且能够了解其催 化葡萄糖转巧反应的工艺条件，包括底物浓度、反应溫度、适宜pH值、反应时间及平衡状态 等。
[0020] 本发明中，纤维素酶生产菌株来自T.reesei，如美国典型培养物保藏中屯、编号为 ATCC?56765?及中国工业微生物菌种保藏管理中屯、编号为cicC?13052的T.reesei RUT C30。
[0021] 本发明中，发酵培养基组成为：含总糖5-15g/L的MGD，蛋白腺Ig/L，尿素0.3g/L， (畑4)2504 1.4邑/1，1(出？04 2邑/1，]\%504.7此0 0.3邑/1，(：曰(：12 0.4邑/1，尸6504.7出0 5111邑/1， 111504.出0 1.7111邑/1，化504*7出0 1.4111邑/1，(：〇(：12 2111邑/1，吐溫80 0.2111171，5001111710.21 pH 5. (Ma抽P化-巧樣酸缓冲液。本领域技术人员可根据T.reesei培养的常识，对发酵培养基 组成进行调整，如加入适当的教皮W补充脚原和生物素等，适当增加或者减少某些无机盐调 控菌丝生长，根据菌丝生长状态调节吐溫80添加量W改变细胞膜的通透性，促进纤维素酶 分泌等。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0023] 1、本发明制备的MGD为含有葡萄糖和槐糖等0-二糖的混合物，通过控制葡萄糖浓 度的流加方案，促进菌丝生长而不抑制纤维素酶的合成，而W槐糖为主的e-二糖可W高效 诱导合成纤维素酶，缩短发酵时间，节省过程能耗，从而降低纤维素酶的生产成本。
[0024] 2、本发明的发酵过程通过该混合物MGD的批式流加，控制发酵液中葡萄糖浓度在 0. 05-0.30g/L，有利菌丝生长而不抑制纤维素酶生物合成，培养144h时发酵液中纤维素酶 活性超过90.0 FPU/mL，发酵罐纤维素酶的生产强度超过625.0FPU/LA。
[0025] 3、本发明的高纤维素酶活性的粗酶液更适宜直接用于木质纤维素类生物质生物 炼制过程纤维素组分的水解。
[0026] 4、本发明的高纤维素酶生产强度显著节省纤维素酶发酵生产设备投资和过程能 耗，降低纤维素酶生产成本。
【附图说明】
[0027] 图1为批式补料流加培养T.Reesei RUT C30生产纤维素酶工艺流程示意图；其中， 1、 氧气瓶，2、空压机，3、进气调节阀，4、气体流量计，5、气体增湿器，6、发酵罐，7、溫度检测 系统，8、溶氧(DO)检测系统，9、抑检测系统，10、循环水槽，11、循环水累，12、循环水调节阀， 13、氨水储槽，14、MGD储槽，15、消泡剂储槽，16、蠕动累，17、储槽进气滤膜，18、发酵罐尾气 排放；
[002引图2为流加 MDG控制发酵液中葡糖糖浓度的T.reesei RUT C30培养过程菌体生长 及纤维素酶生产示意图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。W下实施例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干调整和改进。运些都属于本发明的保 护范围。
[0030] 实施例1、护糖巧酶催化葡萄糖转巧反应制备MGD
[0031] 配置600g/L葡萄糖溶液，每克葡萄糖加入20IU夏盛实业集团有限公司生产的0-葡 萄糖巧酶，在抑4.8及65°C条件下解育72h，然后煮沸糖液5min使0-葡萄糖巧酶失活后即可 制备可溶性诱导物MGD。经测定MGD中含葡萄糖410.3g/L及槐糖13.7g/L。
[0032] 实施例2、批式流加MGD培养T.reesei RUT C30高效生产纤维素酶
[0033] 批式补料流加培养T.reesei RUT C30生产纤维素酶工艺流程如图1所示。来自氧 气瓶中1中的氧气和空压机2中的空气，通过调节阀3调节和流量计4计量W适当比例混合后 进入气体增湿器5增湿，然后通入发酵罐6,并与溶氧(DO)检测系统8联动控制发酵液中DO不 低于20%，W满足菌丝生长和纤维素酶生物合成的需求。溫度检测系统7与循环水调节阀 12、循环水槽10及循环水累11组成溫度调节控制系统。pH检测系统9和氨水储槽13及蠕动累 16构成抑调节控制系统，控制培养与发酵过程抑不低于4.2"MDG储槽14与蠕动累16联动，通 过检测发酵液中葡萄糖浓度，控制MDG流加。消泡剂储槽15与蠕动累16联动，及时消除培养 与发酵过程产生的泡沫。各种胆槽进气17及发酵罐排空系统18均安装滤膜。
[0034] 具体包括如下步骤：
[00巧]1、斜面培养:从-80。°C冰箱取少量T.reesei RUT C30抱子接种于含30g/L麦芽粉 和15g/L琼脂的固体培养基中，在28°C下培养7d，用无菌水洗下抱子，置于4°C下备用。
[0036] 2、种子培养:将步骤1洗下的抱子，接种于含4g/L葡萄糖和lOg/L玉米浆的液体培 养基中，于28 °C和15化pm条件下培养24h制备抱子悬浮液，作为种子液。
[0037] 3、发酵培养:按10%接种量接种至装液量为化发酵培养基的发酵罐中，在发酵的 前12-3化(本实施例中精确为25h)为菌体生长主要阶段（即快速生长），控制发酵溫度为28 °C，抑利用流加氨水自动控制为不低于4.2,同时补充脚原。监测发酵液中葡萄糖浓度，待发 酵液中葡萄糖耗尽时将溫度降至25°C，并开始流加MGD，每4h检测发酵罐内葡萄糖浓度，并 根据葡萄糖浓度调控MGD流加速度，保证发酵罐中葡萄糖浓度为0.05旨/1-0.30旨凡，其中发 酵罐转速W达到发酵液混合均匀为目的。滤纸酶活测定方法采用国际理论与纯粹化学会 IUPAC颁布的标准方法Whose,T. 1987.Measurement of cellulase activities.化re and applied Chemist巧59(2) :257-268),发酵结果如图2所示。培养144h时发酵液中纤维素酶 活单位达到90.3FPU/mL，纤维素酶生产强度达到627.1FPU/LA，继续延长发酵时间到19化， 纤维素酶酶活单位略有提高，可达到96.7IU/ml，但纤维素酶的生产强度降低到503.8IU/L/ h。
[0038] 其中步骤(3)所述的发酵培养基配方为:含有葡萄糖的液体诱导物MGD lOg/L，蛋 白腺Ig/L，教皮lOg/L，尿素0.3g/L，（NH4)2S〇4 1.4g/L，K此P〇4 2g/L，MgS〇4.7出0 0.3g/L， 化(：12 0.4邑/1，尸6504.7出0 5111邑/1，]\111504.出0 1.7111邑/1，211504*7此0 1.4111邑/1，(：〇(：12 2111邑/ L，吐溫80 0.2ml/L。
【主权项】
1. 一种高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 51、 利用葡萄糖或含葡萄糖的糖浆，通过β-糖苷酶催化的转苷反应制备含槐糖混合物 MGD ； 52、 以所述MGD为碳源和诱导物，培养里氏木霉(Trichoderma reesei)，高效生产纤维 素酶。2. 根据权利要求1所述的高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，步骤S2中，培养过程 通过MGD的批式流加控制发酵液中葡萄糖浓度在0.05-0.30g/L。3. 根据权利要求2所述的高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，含槐糖混合物MGD的 批式流加具体为:待发酵液中葡萄糖耗尽时将温度降低至25°C，然后开始流加 MGD;根据发 酵液中葡萄糖浓度调控MGD流加速度，使得发酵液中葡萄糖浓度为0.05g/L-0.30g/L。4. 根据权利要求1所述的高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，步骤S2中，培养过程 中，将T.reesei孢子悬浮液按发酵液体积10%接种于发酵培养基中，28°C培养至葡萄糖耗 尽。5. 根据权利要求1或4所述的高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，培养过程中，利用 流加氨水控制pH为不低于4.2，控制溶氧不低于20 %饱和值。6. 根据权利要求4所述的高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基包 括：含总糖5-15g/L的MGD，蛋白胨lg/L，尿素0 · 3g/L，（NH4)2S〇4 1 · 4g/L，KH2P〇4 2g/L， MgSO4 · 7H20 0.3g/L,CaCl2 0.4g/L,FeSO4 · 7H20 5mg/L,MnSO4 · H2O 1.7mg/L,ZnS04 · 7H20 1.411^/1，(：〇(：12 211^/1，吐温80 0.2111171，5001111710.21口!15.0恥2册04-柠檬酸缓冲液。7. 根据权利要求4所述的高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，T.reesei孢子接种于 固体培养基中，28°C下培养7d，用无菌水洗下孢子;洗下的孢子，接种于液体培养基中，于28 °C和150rpm条件下培养24h，即得所述T. reese i孢子悬浮液。8. 根据权利要求7所述的高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述固体培养基包括 3〇g/L麦芽粉和15g/L琼脂。9. 根据权利要求7所述的高效生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述液体培养基包括 4g/L葡萄糖和10g/L玉米浆。
【文档编号】C12N9/42GK105925551SQ201610309126
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】白凤武, 赵心清, 李勇昊
【申请人】上海交通大学