苹果锈果类病毒分子标准样品及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种苹果锈果类病毒分子标准样品及其制备方法，具体包括ASSVd的原料选取、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等过程。所述标准样品的制备方法包括：由ASSVd病毒液中提取病毒RNA、RT?PCR反应扩增并纯化目的基因片段、目的片段的连接转化；回收质粒的步骤。本发明的苹果锈果类病毒标准样品稳定性高、均匀性好，适用于对苹果锈果类病毒进行快速检测确证，为苹果锈果类病毒的检测研究、农药研究、应用研究提供了标准样品的需求，可广泛应用于农业生产及环境中的疫情监控及进出口贸易中该类病毒的监测及检测。使用本发明的标准样品可以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。
【专利说明】
苹果诱果类病毒分子标准样品及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于检测用病毒标准品及其制备方法技术领域，具体设及苹果诱果类病毒 标准样品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 类病毒(Viroid)是一种最小的具有侵染性的致病病原，它是由247~375核巧酸组 成的单链、共价闭合的环状RNA，能引起许多经济作物产生严重病害。已经发现的类病毒已 超过30种，其核酸含有246~399个核巧酸，根据序列和结构的同源性、复制特性分为2个组， 分别为马铃馨纺键块茎类病毒组(PSTVd)和鳄梨日斑类病毒组(ASBVd)。苹果诱果类病毒 (Apple scar skid viroid,ASSVd)归于苹果诱果类病毒属(Apscaviroid),粒体由330个核 巧酸组成。苹果诱果类病毒的侵染寄主是苹果和梨。感病的苹果因品种和环境条件的变化 表现出5种显性病症:诱果型、花脸型、诱果-花脸型、环斑型和绿点型，感病的梨大多数表现 为隐性，少数为崎形果。由于类病毒在寄主植物细胞核中复制和累积，在感病寄主的叶、茎、 皮、化木，W及果实的表皮、果肉和种子中均可检测出类病毒。因此，感染类病毒的果树终生 带毒，并通过嫁接和修剪工具传染的途径使类病毒病蔓延。许多国家的苹果树和梨树中均 发现ASSVd的危害，我国东北、西北、华北，W及江苏、安徽、山西和山东等地亦有发生。目前 尚未有苹果诱果类病毒的检测鉴定方法的规范性操作规程。因此，规范苹果诱果类病毒的 检测鉴定方法一般操作规程，对于提高苹果诱果类病毒的检疫检验效率、防止苹果诱果类 病毒的传入、传出，保护我国农业的安全生产，促进我国农产品的顺利出口，具有十分重要 的意义。植物类病毒由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境溫度的影响较大，而且几种 鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于类病毒不能产 生任何蛋白质，所W也不能使用检测病毒的血清学方法。因此，选用RT-PCR方法对苹果诱果 类病毒进行检测。
[0003] 系统内送检种苗的样品通常眼观来看都比较健康，而苹果诱果类病毒通常只有在 适宜的条件下才能发病，而且现在用的PCR方法只能从重度感染表现出症状的植物中检出 病毒，无法检测潜在的病毒。随着进出口贸易的增大，检验流程时限要求缩减，植物病毒疫 病多数要进行分子生物学检测，现行的国家和行业标准，都需要标准阳性毒株或阳性对照 质控物进行实验质控，运些阳性毒株的引进需要办理复杂的审批手续，购置费用昂贵，难度 较大，因此普通的植物疫病实验室很难得到该病毒，对实验室的质量控制及研究带来了极 大的挑战。
[0004] 为了帮助实验室建立规范的质量保证，植物病毒及类病毒的标准样品研制工作一 直在开展中。目前，国内外还没有关于该种植物类病毒标准样品的研究。我们将首次开发可 用于快速检测苹果诱果类病毒的分子标准样品及制备技术。本标准样品的研制成功，不仅 为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、 服务出口企业提供技术上的支持。该发明成果将有望成为植物疫病分子诊断领域的突破性 产品及技术，是植物流行病学检测技术体系的进一步完善和发展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种稳定性高、均匀性好的苹果诱果类病毒分子标准样品 及其制备方法。
[0006] 为了得到所述苹果诱果类病毒分子标准样品，根据苹果诱果类病毒(ASSVd)基因 全序列，设计全序列及特异性引物，其碱基序列如下：
[0007] 沈Q ID N0:1:GTAAACACCGTGCGGTTCCT [000引 沈Q ID N0:2:AAGAGCGTGAGAGAACAGGG
[0009] 本发明的苹果诱果类病毒分子标准样品，采用如下方法制备：
[0010] (1)采集感染苹果诱果类病毒的植物组织，液氮研磨；
[0011] (2)步骤(1)得到的植物组织中提取得到病毒RNA;
[0012] (3)步骤(2)的病毒RNA作为PCR反应模板，进行RT-PCR扩增反应，其中PCR反应的正 反引物分别为沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2;
[OOU] (4)将步骤(3)的PCR扩增产物经纯化后连接至PGEM-T载体中，连接产物转化至感 受态细胞后，LB平板培养，筛选得到阳性克隆；
[0014] (5)阳性克隆中提取得到质粒，即为苹果诱果类病毒的标准样品；
[001引上述制备方法中，在步骤(4)中筛选阳性克隆的方法为RT-PCR方法，其中RT-PCR反 应的正反引物分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2
[0016] 本发明的苹果诱果类病毒分子标准样品稳定性高、均匀性好，为苹果诱果类病毒 的检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、 服务出口企业提供技术上的支持。使用本发明的标准样品可W实现不同实验室结果的比 对，从而保证实验室的质量控制。
【附图说明】
[0017] 图1为实施例1中AS SVd目标基因的PCR扩增反应产物的电泳图，其中M : 化2000Marker，1~9:空白质粒及健康对照；10: PCR扩增产物扩增出273bp大小的片段。
[001引图2为是本发明标准样品灵敏度检测结果图，其中由左到右，依次是10-1，10-2,10 -3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。
【具体实施方式】
[0019] 下述非限制性实施例可W使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不W 任何方式限制本发明。苹果诱果类病毒分子标准样品及其制备方法按如下步骤进行：
[0020] 实施例1苹果诱果类病毒分子标准样品的制备
[0021] (1)提取病毒 RNA;
[0022] 采集0.1 g感染苹果诱果类病毒的植物组织加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移 入1.5mL离屯、管中，加入ImL Trizol Reagent,颠倒混匀，2°C~8°C，12000g，离屯、lOmin。取 上清，15°C~30°C，放置5min;加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡（勿满旋振荡），15s。15°C~30 。(：，放置2min~3min;2°C~8°C，12000g，离屯、15min。小屯、吸取约为600化的上层水相，勿扰 动中间相和下层相。加500化异丙醇混合上清液，15°C~30°C，放置1 Omin。2°C~8°C， 12000g，离屯、IOmin。去除上清液，沉淀中加入ImL 75 %乙醇，洗涂；2 °C~8 °C，7500g，离屯、 5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30化~50化无脚aSe的水中，即为待检模板 RNA。
[0023] (2)目标基因的扩增
[0024] 步骤（1)的病毒RNA作为PCR反应模板，本发明自行设计引物，进行RT-PCR扩增反 应，扩增苹果诱果类病毒基因全序列，大小为273bp的片段，其中PCR反应的正反引物序列如 下：
[00巧]沈Q ID N0:1:GTAAACACCGTGCGGTTCCT [00%] SEQ ID N0:2:AAGAGCGTGAGAGAACAGGG
[0027] 扩增溶液中加入2 XRT-PCR buffer( 10倍聚合酶链式Mix反应液）12.扣L，lOpmol/ yL SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2各0.扣L，将提取的待测样品RNA加入反应体系中，DEPC水补 足体积至25化，PCR循环条件为：481：3〇111111，94°(：预变性5111111后，进入94°(：变性3〇3,55°(：退 火40s，72°C延伸45s，共循环35次;然后72°C再延伸IOmin.
[0028] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶 化，加入漠化乙锭胆存液至终浓度为0.化g/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面 刚刚没过凝胶;将化L~化L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样;9V/cm恒压电 泳，直至漠酪蓝指示剂迁移至凝胶中部;紫外检测仪下观察电泳结果，待检田间样品能够扩 增出预期条带，扩增条带为273bp，电泳结果见图1。
[0029] (3)目标基因的序列测定
[0030] 将PCR扩增产物送宝生物（大连)有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO.3。将 所得序列通过NCBI在线nucleotide blast分析，结果表明：该核巧酸序列与苹果诱果类病 毒(ASSVD)的核酸序列相似性最高达99%，为苹果诱果类病毒基因全序列。
[0031] (4)目标基因的纯化
[0032] 将步骤（2)中PCR扩增产物采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒(货号DV805A)，并按其操作说明回收目标分子DM片段，即SEQ ID NO.3所示 的ASSVd基因全序列。
[0033] (5)目的片段的连接转化
[0034] 在步骤（4)中纯化得到的目的片段化L，2XRapid ligation buffer扣L，PGEM-T 载体0.扣L，T4DNA Ligase 0.扣L，用无菌水补充至10化，室溫连接Ih。将连接产物加入到制 备好的感受态细胞E. COl i JM109中，轻轻用移液器混匀，冰浴20min，42°C热应激Imin，冰浴 2min，加入800化SOC培养基，150g摇菌1.化，1000 g离屯、IOmin，弃去培养液，加入新鲜的SOC 培养基20化L，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37°C倒置培养12h-16h。
[0035] 挑取单克隆菌在LB培养液中进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系 及反应条件见步骤3的（2)。将扩增产物进行琼脂糖电泳鉴定，结果获得了与预期大小一致 的273bp片段。
[0036] 应用Omega公司质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(IOOtest)，提取纯化上述步 骤中筛选得到的阳性克隆，获得重组质粒PGEM-T-ASSVD，每支EP管分装成10化L，每支重组 质粒含量为化g，即为苹果诱果类病毒分子标准样品。
[0037] 实施例2苹果诱果类病毒分子标准样品的均匀性实验
[0038] 苹果诱果类病毒分子标准样品的均匀性测定是将如实施例1的方法制备的ASSVd 分子标准样品随机分成两个样品组，即样品组A和样品组B，每个样品组各有15个标准样品， 每个样品按照如下反应条件进行PCR扩增，测定PCR产物浓度(ng AiL )，通过比较PCR产物的 浓度变化，按照统计学方法评价标准样品的均匀性，
[0039] PCR反应体系：反应管中加入苹果诱果类病毒分子标准样品1化（含IX ICT2Wg DNA)，2XPCR buffer(l〇 倍聚合酶链式 Mix 反应液）12.扣L，10pmolAiL 沈 Q ID N0:1 和沈 Q ID NO: 2各0. ，DEPC水补足体积至25化。
[0040] PCR反应条件:94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s， 共循环35次;然后72°C再延伸lOmin。
[0041] 结果如表1，2和3。
[0042] 表1苹果诱果类病毒分子标准样品均匀性测定结果
[0045] 表2苹果诱果类病毒分子标准样品均匀性评价结果
[0043]
[0044]
[0046]
[i
[i
[i
[0050]从表1及其统计结果(表2和表3)的结果可知，两个样品组之间不存在显著差异，可 W认为样品是均匀的。
[0051 ]实施例3苹果诱果类病毒分子标准样品的稳定性实验
[0052] 将实施例1的方法制备的苹果诱果类病毒分子标准样品随机分组，每个样品按照 实施例2所述的PCR反应体系和PCR反应条件下进行PCR扩增，测定PCR产物浓度(ng/化），通 过比较PCR产物的浓度变化，按照统计学方法评价标准样品的稳定性。
[0053] 采用两种类型的稳定性试验：
[0054] -种是在-20°C下的稳定性试验，随机取苹果诱果类病毒分子标准样品24份，每个 月检测2份，连续12个月，结果如表4。
[0055] 另一种是在较高的溫度20°C下的稳定性试验，随机取苹果诱果类病毒分子标准样 品12份，每周检测3份，连续4周，测试结果如表5。
[0056] 表4.稳定性检验实验(-20。〇
[0化7]
[0060]
[0化引对表4结果的F检验结果为F= 1.9524，F葡.O日=4.2838，F<F虹[日.日日,日,日]，即样品间无 显著性差异。[0059] 表5.稳定性检验实验(2(TC)结果
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] 对表6结果方差分析结果为F= 1.4883，F表日.0日=4.0661，F<F虹[日.日日,日,日]，即样品间 无显著性差异。
[0065] 实施例4定值方法
[0066] 由实施例1的方法制备的苹果诱果类病毒分子标准样品随机选15个，每个样品按 照实施例2所述，用苹果诱果类病毒聚合酶链反应方法进行定值试验，结果完全一致，均为 苹果诱果类病毒核酸阳性。
[0067] 本苹果诱果类病毒分子标准样品经福建检验检疫局、烟台检验检疫局、甘肃检验 检疫局、广东检验检疫局等协作试验定值结果统计见表7。
[006引表7.协作试验定值结果表
[0069]
[0070] 应用苹果诱果类病毒聚合酶链反应方法对本标准样品的定值实验结果均为苹果 诱果类病毒核酸阳性。
【主权项】
1. 一种苹果锈果类病毒的标准样品，其特征在于，制备步骤包括： (1) 采集感染苹果锈果类病毒的植物组织，液氮研磨； (2) 步骤(1)得到的植物组织中提取得到病毒RNA; (3) 步骤(2)的病毒RNA作为PCR反应模板，进行RT-PCR扩增反应，其中PCR反应的正反引 物分别为SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO:2; (4) 将步骤(3)的PCR扩增产物经纯化后连接至PGEM-T载体中，连接产物转化至感受态 细胞后，LB平板培养，筛选得到阳性克隆； (5) 阳性克隆中提取得到质粒，即为苹果锈果类病毒的标准样品； 其中所述感受态细胞为E.coli JM109。2. -种利用权利要求1所述方法制备的苹果锈果类病毒标准样品。
【文档编号】C12Q1/70GK105925571SQ201610334625
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】张成标, 吴兴海, 孙敏, 李明哲, 赵丽青, 尼秀媚, 唐静, 郑小龙
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心