一种gii.p12/gii.3重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。本发明分别以六对扩增引物作为扩增引物的上下游引物，以GII.P12/GII.3重组型诺如病毒的RNA为模板进行RT?PCR扩增，分别得到扩增产物，然后采用以上六对扩增引物以及两条测序引物II.12?Seq1R、II.3?Seq6F对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组全长序列。本发明针对我国常见的一种GII.P12/GII.3重组型诺如病毒，根据其基因组所包含的三个开放阅读框设计了“4+1+1”的分段扩增策略，根据保守区域设计相应的扩增引物，将该扩增引物应用于实际检出样本，获得了GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组序列。本发明可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等有诺如病毒检测需求及相关科研领域。
【专利说明】
-种Gl I .P12/GI I .3重组型诺如病毒基因组扩増引物和扩増 方法
技术领域
[0001 ] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组 扩增引物和扩增方法。
【背景技术】
[0002] 诺如病毒(Norovirus)是急性胃肠炎的重要非细菌性病原，在世界各地均有报道。 诺如病毒感染各年龄段人群，临床表现主要为呕吐、腹泻、发热等，对儿童、老人及免疫缺陷 人群还易造成脱水性死亡。据报道，诺如病毒每年至少造成2.3亿人次的感染，在发展中国 家尤其严重，每年导致20万例W上5岁W下儿童的死亡，对公共卫生安全造成了极大的威 胁。至目前为止，还没有有效的抗病毒药物及治疗手段。NoV的危害主要在于其极强的传播 能力，美国疾病预防与控制中屯、已于2006年将其列为生物恐怖B类因子。
[0003] 诺如病毒是一种正链RNA病毒，具有丰富的遗传多样性。一般根据病毒其衣壳蛋白 的序列同源性，可将病毒分成GI-GVI的6个基因组(Genogroup),其中GI、GII和GIV可感染人 类。每个基因组又可进一步分成不同的基因型(Genotype),例如GI含有9个基因型，GII含有 23个(并不断增加）。其中，GII.4型和GII. 17型是近年来的主要流行基因型。
[0004] 诺如病毒的进化机制主要包括两个方面，一是由于自身RNA聚合酶的易错性导致 的基因组点突变积累，二是病毒重组机制。诺如病毒的重组现象非常普遍，一般病毒流行监 测过程中往往都会检出重组株的存在，本研究团队在前期工作中也检出过GII.Pb/GII. 3、 GI.饥/GI .3、GII .P7/GII .6、GII .P4-2006b/GII .4-2012型等。常见的病毒重组位点位于基 因组ORFl与0RF2的连接处，也有文章曾报道了 0RF2/0RF3重组现象。在重庆地区的诺如病毒 监测过程中，曾报道了一种GII .P12/GII .3型重组株在2011-2012年间成为了主要流行基因 型，运在其他监测研究中还从未报道;同时，本团队也在2013/2014与2014/2015两个年度也 连续监测到该型别重组株。重组现象增加了诺如病毒流行的适应性，因此，充分积累 GII.P12/GII.3型重组株的基因组信息，掌握其自身变异特点W及与其他流行株的差异，将 对运种重组株的预防与控制具有重要意义。
[0005] 诺如病毒基因组长约7.5-7.8kb，包括3个0RF。目前报道的基因组扩增方法有直接 扩增法W及分段扩增法，其中我们前期工作中针对GII .4型和GII. 17型诺如病毒建立的"4+ 1+r扩增策略具有操作简单、周期短、成本低W及灵敏度高的特点，因此，我们在W上基础 上，对GII.P12/GII.3重组型诺如病建立一种新颖的"4+1 + r基因组扩增策略，并且开发相 应的扩增引物和扩增方法很有必要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增引物和扩增 方法。
[0007] 本发明的GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对 扩增引物和两条测序引物：
[000引 引物对 1: II-IF: 5 '-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3 ' ；
[0009] II.12-1R：5'-TCAACRCCATTGCGMGGGAT-3'；
[0010] 引物对2:11.12-2尸：5'-1666〔4〔441'〔44〔6(：1'(：1'-3'；
[0011] II.12-2R：5'-ATGGCCACCTCCTCATAATA-3'；
[0012] 引物对3:11.12-3尸：5'-4刊6押6646口'6〔41'刊61'-3'；
[0013] II.12-3R：5'-GCCAATTTKCCTGTRAAGGA-3'；
[0014] 引物对4:11.12-4F:5'-CCAAGTGTGTTAGAGGCTGC-3' ；
[0015] II-4R：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'；
[0016] 引物对5: II-5F: 5 '-GGAGGGCGATCGCAATC-3 ' ；
[0017] II-5R：5'-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3'；
[001 引 引物对6: II. 3-6F: 5 '-GGTATGTCAACCCTGACACT-3 ' ；
[0019] II.3-6R：5'-CACTAAACATTTGACTCC-3'；
[0020] 测序引物：11.12-5691尺:5'-〔464466〔4146〔461761'1'-3'；
[0021] II.3-Seq6F:5'-TGGAACCACACATGCCT-3';
[0022] R 代表 A/G，M 代表 A/C，K 代表 G/T，H 代表 A/C/T，N 代表 A/C/T/G。
[0023] 本发明的第二个目的是提供一种GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组的扩增方 法，其特征在于，分别 W 上述引物对 n-lF/II.12-lR、II.12-2F/II.12-2R、II.12-3F/ II. 12-3R、II. 12-4F/11-4R、II-5F/11-5R和II. 3-6F/II. 3-6R作为扩增引物的上下游引物， WGII. P12/GII. 3重组型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后 采用W上扩增引物W及两条测序引物II.12-SeqlR、II.3-Seq6F对扩增产物进行核酸序列 测定，再拼接比对，得到GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组全长序列。
[0024] 优选，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2 X one-step RT-PCR mixUire 10化，10 皿01/L上游引物和10皿01/L下游引物各0.化L，MLV/RNas in/HS-Taq酶混合液0.祉L，RNA模 板化L，其余由双蒸水补足至20化;反应条件为:50°C反转录30min，94°C预变性3min，然后94 1：3〇3、551：3〇3、721：8〇3，共30次循环后，72°(：最后延伸7111111。
[0025] 本发明针对我国常见的一种GII.P12/GII.3重组型诺如病毒，根据其基因组所包 含的=个开放阅读框设计了 "4+1+r的分段扩增策略，根据保守区域设计相应的扩增引物； 并将该扩增方法应用于实际检出样本，获得了广州地区GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基 因组序列。本发明可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等有诺如病毒检测需求单位及相关科 研领域。
【附图说明】
[00%]图1是GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增策略及相应引物的设计位置。 [0027] 图2是适用于GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度 分析，电泳顺序为1，1-35;其中]?为0魁1^日(1(16'，1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31- 35 分别为基因组扩增引物II-1F/II. 12-1RJI. 12-2F/II. 12-2RJI. 12-3F/II. 12-3R、 II. 12-4F/II-4R、II-5F/II-5R、II. 3-6F/II. 3-6R和检测引物G2SKF/G2SKR在病毒RNA不同 稀释度(依次为1〇1-1〇5倍稀释)下扩增产物的电泳结果。
[002引图3是实际样本中病毒基因组的扩增效果；电泳顺序为M，1-6,其中M为DNA 1^曰(1(16'，1-6依次为实际样本622013-1^20进行"4+1+1"策略扩增基因组6个产物的电泳结果。
【具体实施方式】
[0029] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0030] 实施例1:GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增策略及相应引物的设计
[0031] (1)611型诺如病毒基因组约7.化6，包括^个01?。，其中01?。1长约5.1化，01?。2长约 1.化b，0RF3长约0.8kb。^ 一代桑格脱氧核巧酸测序法为基础，则每个扩增片段设计为 1.3kb-l.化b，其中ORFl分为4个片段，0RF2和0RF3均为1个片段。此外，为获得基因组5'和3' 端完整序列，分别在基因组两端设计扩增长度在l〇〇-8(K)bp的片段，相应测序引物分别命名 为II. 12-SeqlR和II. 3-Seq6F。具体基因组分段策略及相应引物位置可见图1，片段1至6两 两之间的重叠区域分别为220bp、34化p、18化p、340bp、54化P。
[0032] (2)在建立扩增策略的基础上，根据Oligo软件设计相应的引物，具体引物信息见 表1，其中，引物核巧酸序列中的R代表A/G，M代表A/C，K代表G/T，H代表A/C/T，N代表A/C/T/ G。
[0033] 表1 GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增用引物信息
[0034]
[0035] a位置参考GII. 12的代表序列AB045603-肝-1996。
[0036] b位置参考Gn .3的代表序列KJ194504-NL-1994。
[0037] 实施例2:适用于GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏 度分析
[0038] (1)病毒样本处理及核酸提取:通过PBS溶液(pH7.4，DEPC处理)稀释收集的待处理 样品（含有GII.P12/GII.3重组型诺如病毒阳性样本GZ2013-L20)至10%(w/v)浓度，充分振 荡混匀，于12000 Xg下离屯、IOmin收集上清液14化L，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒 RNA共60iiL，并进行10 X梯度的适当稀释处理。
[0039] (2)"4+l + r基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：II-IF/ 11.12- 1R、II.12-2F/II.12-2R、II.12-3F/II.12-3R、II.12-4F/II-4R、II-5F/II-5R和 II. 3-6F/II. 3-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20化的一步法RT-PCR反应体系，含 有2Xone-stepRT-PCRmixturel0化，上游引物和下游引物（10Mlol/L)各0.化L，MLV/ RNas in/服-Taq酶混合液0.祉L，样本RNA模版化L，其余由dd出0补足。
[0040] 反应条件为：50°C反转录30min，94°C预变性3min，然后94°C30s、55°C30s、72°C 80s，共30次循环后，72°C最后延伸7min。
[0041 ] W检测引物G2SKF/G2SKR(G2SKR: 5 ' -CCRCCNGCAT畑CCRTTRTACAT-3 ' ； G2SKF: 5 ' - CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3 '）作为对照，按照上述体系和反应条件进行。
[0042] (3)电泳、PCR产物序列测定：取扩增产物化L，1.0 %的琼脂糖凝胶(含0.05°/〇〇Gold View核酸染料）进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对II-1F/II.12-1R、 11.12- 2F/II.12-2R、II.12-3F/II.12-3RJI.12-4F/II-4R、II-5F/II-5R、II.3-6F/II.3- 6R的顺序，GII.P12/GII.3重组型诺如病毒阳性样本GZ2013-L20基因组扩增条带依次为 159化p、1429bp、153化口、158化口、16476口、9626口，电泳结果如图2，结果表明与检测引物 G2SKF/G2SKR的电泳条带对比，片段2、4、5扩增引物（II. 12-2F/II. 12-2R、II. 12-4F/II-4R、 II-5F/II-5R)可达到检测引物的灵敏度，片段1扩增引物（II-1F/II. 12-1R)的灵敏度则低 于检测引物一个数量级，而片段3和片段6扩增引物（I1.12-3F/II. 12-3R和II. 3-6F/II. 3- 6R)的灵敏度高于检测引物一个数量级。
[0043] 实施例3:实际样本中病毒基因组的扩增效果
[0044] (1)病毒样本处理及核酸提取:取广州地区获得的GII.P12/GII. 3重组型诺如病毒 阳性样本GZ2013-L20,通过PBS溶液(pH7.4，DEPC处理)稀释待处理样品至10%(w/v)浓度， 充分振荡混匀，于12000Xg下离屯、IOmin收集上清液14化L，并通过RNA提取试剂盒抽提样本 中病毒RNA共60化。
[0045] (2)"4+l + r基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：II-IF/ 11.12- 1R、II.12-2F/II.12-2R、II.12-3F/II.12-3R、II.12-4F/II-4R、II-5F/II-5R和 II. 3-6F/II. 3-6R，每次RT-PCR反应选择一对引物。采用20化的一步法RT-PCR反应体系，含 有2Xone-stepRT-PCRmixturel0化，上游引物和下游引物（10Mlol/L)各0.化L，MLV/ RNas in/服-Taq酶混合液0.祉L，样本RNA模版化L，其余由dd出0补足。
[0046] 反应条件为：50°C反转录30min，94°C预变性3min，然后94°C30s、55°C30s、72°C 80s，共30次循环后，72°C最后延伸7min。
[0047] (3)电泳、PCR产物序列测定：取扩增产物化L，1.0 %的琼脂糖凝胶(含0.05°/〇〇Gold View核酸染料）进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对II-1F/II.12-1R、 11.12- 2F/II.12-2R、II.12-3F/II.12-3R、II.12-4F/II-4R、II-5F/II-5R和II.3-6F/II.3- 6R的顺序，GII.P12/GII.3重组型诺如病毒广州株GZ2013-L20基因组扩增条带依次为 15966口、142抓口、153化口、158化口、16476口、9626口。电泳结果如图3，结果表明，611.口12/611.3 重组型诺如病毒广州株GZ2013-L20基因组的6个片段均成功获得扩增。
[004引（4)基因组序列拼接与比对：采用W上六对扩增引物W及两条测序引物11.12- SeqlR、II. 3-Seq6F对GII.P12/GII. 3重组型诺如病毒广州株GZ2013-L20扩增产物测序(每 个片段测序S次W上），拼接全长基因组，长度为7492bp。将该基因组序列提交进行BLAST分 析，结果表明，GII.P12/GII.3重组型诺如病毒广州株GZ2013-L20与GU980585.U韩国）、 GU991355.1(中国）诺如病毒毒株基因组序列达到96 %的相似度（Que巧coverage = 100%)。
【主权项】
1. 一种GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引 物和两条测序引物： 引物对I: II-IF: 5 '-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3 ' ； II·12-1R:5 '-TCAACRCCATTGCGMGGGAT-3 '； 引物对2: II · 12-2F: 5 '-TGGGCACAATCAACGCTCT-3 ' ； II·12-2R:5 '-ATGGCCACCTCCTCATAATA-3 '； 引物对3: II · 12-3F: 5 '-ATTGCTGGAGCTGCATTTGT-3 ' ； II·12-3R:5 '-GCCAATTTKCCTGTRAAGGA-3 '； 引物对4: II · 12-4F: 5 '-CCAAGTGTGTTAGAGGCTGC-3 ' ； II-4R:5 '-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3 '； 引物对5: II-5F: 5 '-GGAGGGCGATCGCAATC-3 ' ； II-5R:5 '-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3 '； 引物对6: II · 3-6F: 5 '-GGTATGTCAACCCTGACACT-3 ' ； II·3-6R:5 '-CACTAAACATTTGACTCC-3 '； 测序引物：Π · 12-SeqlR: 5 '-CAGAAGGCATAGCAGTTGTT-3 ' ； II·3-Seq6F:5，-TGGAACCACACATGCCT-3，； R 代表 A/G，M 代表 A/C，K 代表 G/T，H 代表 A/C/T，N 代表 A/C/T/G。2. -种GII.P12/GII.3重组型诺如病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以权利要 求1所述的引物对II-1F/II · 12-1R、II · 12-2F/II · 12-2R、II · 12-3F/II · 12-3R、II · 12-4F/ II-4R、II-5F/II-5R和II. 3-6F/II. 3-6R作为扩增引物的上下游引物，以GII .P12/GII .3重 组型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后采用以上扩增引物以 及两条测序引物II.12-S eqlR、II.3-Seq6F对扩增产物进行核酸序列测定，再拼接比对，得 至IjGII.P12/GII. 3重组型诺如病毒基因组全长序列。3. 根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述的RT-PCR，其反应体系为:含有2 Xone-step RT-PCR mixture 10yL，10ymol/L上游引物和lOymol/L下游引物各0.6yL，MLV/ RNasin/HS-Taq酶混合液0.8yL，RNA模板2yL，其余由双蒸水补足至20yL;反应条件为：50 °C 反转录 30min，94°C 预变性 3min，然后 941€3〇8、551€3〇8、721€8〇8，共30次循环后，72°(：最后 延伸7min。
【文档编号】C12N15/11GK105925573SQ201610510474
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】薛亮, 吴清平, 蔡伟程, 蔡淑珍, 张菊梅
【申请人】广东省微生物研究所, 广东环凯微生物科技有限公司