人WIPI2-shRNA慢病毒载体、构建方法与应用

人WIPI2-shRNA慢病毒载体、构建方法与应用
【专利摘要】本发明属于慢病毒载体制备领域，具体涉及一种人WIPI2?shRNA慢病毒载体、构建方法与应用，合成针对RNA干扰靶点序列的DNA oligo的正链和反链；所述的正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA；通过酶切使慢病毒载体线性化，使线性化载体与步骤（1）得到的双链DNA连接；将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；质粒抽提，用于下一步病毒包装。本发明构建的人WIPI2?shRNA慢病毒载体，将载体质粒转染后得到包装并浓缩的病毒，病毒再侵染目的细胞，实现了WIPI2基因干扰，降低WIPI2基因的表达，降低被病毒侵袭的细胞生长速率，提高被病毒侵袭的细胞凋亡率。
【专利说明】
人WIP12-shRNA慢病毒载体、构建方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明属于慢病毒载体制备领域，具体设及一种人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构 建与应用。
【背景技术】
[0002] WIPI2的全称为WD-repeat protein interacting with phosphoinositides 2， 它是WD重复蛋白家族的一个重要的成员，该蛋白家族的共性是具有WD基元，也称为化P-ASP 或WD40,由40个左右氨基酸残基组成，具有保守的GH( glycine-histidine)和WD (trypto地an-aspartic acid)序列，该基元在蛋白质的相互作用方面具有重要作用。目前 在跨膜信号转导、物质运输、RNA加工等过程中均起着重要作用。
[0003] 目前研究显示WIPI2与自隧相关，它能够与LC3和PI3P共同作用于自隧小体的形 成，并且通过招募自隧相关因子来清除病原体。但是WIPI2与肿瘤的关系未见报道，本发明 将WIPI2进行干扰后构建慢病毒载体发现能够抑制肝癌细胞的生长，因此具有潜在的治疗 肝癌的意义。

【发明内容】

[0004] 针对上述问题，本发明的目的之一是提供一种用于人WIPU-ShRNA慢病毒载体的 制备的WIPI2基因的ShRNA干扰序列。
[0005] 本发明的目的之二是提供人WIPU-ShRNA慢病毒载体。
[0006] 本发明的又一个目的是提供人WIPU-ShRNA慢病毒载体的构建方法。
[0007] 本发明的最后一个目的是提供人WIPU-ShRNA慢病毒载体的应用。
[000引为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为:WIPI2基因的ShRNA干扰序列，包括 DNA 0 1 i g 0的正链和反链，正链序列为5 '- CCGGGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3 '，反链序列为5 ' - AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3 ' ；所述的正链和反 链退火形成带粘性末端的双链DNA。
[0009]人WIPU-ShRNA慢病毒载体，由权利要求1所述的双链DNA插入慢病毒载体中制成。 [0010] 所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体针对的RNA干扰祀点序列为：5 ' - TACGGAAGATGTGTGCATT-3'。
[0011] 人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
[0012] (1)合成针对RNA干扰祀点序列的DNA OligO的正链和反链，正链序列为5/- CCGGGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3 '，反链序列为5 ' - AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3 ' ；所述的正链和反 链退火形成带粘性末端的双链DNA;
[0013 ] (2)通过酶切使载体线性化，使线性化载体与步骤(1)得到的双链DNA连接；
[0014] (3)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；
[0015] (4)质粒抽提，用于下一步病毒包装。
[0016] 在步骤（1)中，将合成的DNA OligO的正链和反链的干粉溶解于退火缓冲液中，90 °C水浴15min;自然冷却至室溫后，形成带粘性末端的双链；退火缓冲液含有Tris、EDTA、 NaCl。DNA 01 igo的正链和反链浓度分别为1 OOiiM。
[0017] 步骤(2)中，酶切反应溫度为37°C，酶切反应中加入AgeI和EcoRI;使线性化载体与 步骤(1)得到的双链DNA连接时，于16 °C反应化-3h。
[0018] 步骤(3)中，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞的具体步骤为:将连接产物加入 到大肠杆菌感受态细胞中，冰浴;热激，冰浴;加入无抗生素的LB液体培养基，摇床震荡培 养;取菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37°C培养箱中过夜培养；阳性克隆进 行PCR鉴定过程中采用的鉴定引物为鉴定引物-F: 5 ' -CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3 '和鉴 定引物-R: 5 ' -GTAATACGGTTATCCACGCG-3 '，具体过程为:挑取单菌落进行PCR扩增，电泳，巧U 序。
[0019] 步骤(4)中，将经PCR鉴定合格的菌液转接培养后，进行质粒抽提;所述的质粒用于 转染293T细胞。
[0020] 人WIPI 2-shRNA慢病毒载体在制备ShRNA慢病毒W及作为制备降低WIPI2基因的表 达、降低被病毒侵袭的细胞生长速率或提高被病毒侵袭的细胞调亡率的试剂中的应用。
[0021] 人WIPU-ShRNA慢病毒载体在制备降低被病毒侵袭的肝癌细胞生长速率的试剂中 的应用。
[0022] 本发明构建的人WIPU-ShRNA慢病毒载体，将载体质粒转染后得到包装并浓缩的 病毒，病毒再侵染目的细胞，实现了 WIPI2基因干扰，降低WIPI2基因的表达，降低被病毒侵 袭的细胞生长速率，提高被病毒侵袭的细胞调亡率。
【附图说明】
[0023] 图1为GVl 15载体图谱；
[0024] 图2为线性化载体的琼脂糖凝胶电泳图片；
[0025] 图3为PCR产物琼脂糖凝胶电泳图片；
[0026] 图4为病毒感染细胞后GFP表达情况示意图；
[0027] 图5为WB验证目的基因干扰有效性的结果示意图；
[0028] 图6为各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平示意图；
[0029] 图7为MTT检测WIPI2基因干扰后对细胞生长的影响结果示意图；
[0030] 图8和图9为流式细胞仪检测WIPI2基因干扰后细胞调亡情况示意图；
[0031] 图10和图11为WIPI2基因干扰后影响肝癌细胞增殖情况示意图。
【具体实施方式】
[0032] W下将结合附图和实施例详细地说明本发明所设及实施例的技术方案。
[0033] 一、实验材料
[0034] 1.实验质粒
[0035] 本次实验使用GV115载体，购自上海吉凯基因化学技术有限公司，载体图谱如图1。
[0036] 2.实验菌株
[0037] TOPlO 大肠杆菌感受态细胞(TIANGEN, Cat. #CB104-03)
[003引 3.实验试剂
[0039] 3.1酶类试剂
[0040；
[0041；
[0042；
[0043；
[0044；
[0045] 表2其它试剂
[0046] 3.3实验仪器
[0047]
[004引 [0049]
[(K)加 ]
[0化1 ]
[0化2]
[0化3]
[0化4]
[0化5]
[0化6]
[0化7]
[0化引
[0化9] 表6 LB固体培养基组成
[0060]含氨节青霉素的LB培养基中氨节青霉素的含量为10化g/ml。 [0061 ] 二、实验方法
[0062] (一)RNA干扰祀点设计及双链DNA OligO制备
[0064]
[0063] I.某巧信烏
[00化]……一，
[0066] 2. RNA干扰祀点设计
[0067] 根据RNA干扰序列设计原则，WWIPI2基因为模板，设计多个19-21nt RNA干扰祀点 序列。经设计软件评估测定后，选取W下序列作为干扰祀点。
[006引表8 RNA干扰祀点设计
[0069]
[0070] 3.DNA OligO序列合成
[0071] 根据已选祀点序列设计ShRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切 位点W完成载体构建。除此之外，在正链3 '端添加 TTTTT终止信号，而反链5 '端添加终止信 号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。
[0073 J *CCGG:AgeI酶切位点;AATTC:EcoRI酶切位点;G:EcoRI酶切位点互补序列。
[0074] 表9 DNA OligO正反向序列
[0075] 4.双链DNA OIigo制备
[0076] 将合成的单链DNA OligO干粉溶解于退火缓冲液中（终浓度IOOiiM)，90°C水浴 15min。自然冷却至室溫后，形成带粘性末端的双链。终浓度指DNAligo干粉溶解在退火缓冲 液中的浓度为lOOyM。
[0077] (二)线性化载体制备
[007引按照肥B说明书配制50iil反应体系，使用AgeI和EcoRI双酶切GVl 15载体使其线性 化。
[0079]
[0080] 表10载体酶切体系
[0081] 37°C(最适溫度)反应化，之后切胶回收目的片段。
[0082] 电泳上样说明
[0083] 泳道1: Ikb Marker:从上至下依次为 10k:b，8化，6化，5k:b，4k:b，3.5k:b，3化，2.5k:b， 2k:b，I ? 5k:b，lk:b，750bp，500bp，250bp
[0084] 泳道2:Age I和EcoR I双酶切线性化后的载体质粒
[0085] 泳道3:没有酶切的载体质粒
[0086] 琼脂糖凝胶电泳图片如图2。
[0087] (S)RNA干扰慢病毒载体构建
[0088] 1.连接
[0089] 按照F'ermentas T4 DNA Ligase说明书配制20山反应体系，将双链DNA oligo与线 性化於
[0090]
[0091] 表11连接体系
[0092] 于16°C反应化-3h，连接产物命名为PSC42265,之后进行转化实验。
[OOW] 2.转化
[0094]将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：
[00巧]1)将IOiil连接产物PSC42265加入到10化1大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。
[0096] 2) 42 °C 热激 90sec，冰浴 2min。
[0097] 3)加入50化L无抗生素的LB液体培养基，200巧m于37°C摇床震荡培养化r。
[009引4)取15化1菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37°C培养箱中过夜培 养。
[0099] 3.阳性克隆的PCR鉴定
[0100] 3.1 引物
[0101]
[0102] 表12 PCR鉴定引物
[0103] 3.2 PCR扩增
[0104] 按下表配制20iU PCR反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行PCR扩增， 反应条件为：941：3111111;941：303,551：303,721：303,22次循环；721：5111111。？〇?结束后，取扣1 产物，1 %掠脂焼溢肪由統捻娜Il条带。
[0105]
[0106]
[0107] 表13 PCR扩增体系
[010引电泳上样说明
[0109] 泳道1:阴性对照(d地2〇)，排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果
[0110] 泳道2:自连对照巧载体自连对照组）
[0111] 泳道3:250bp Marker:从上至下依次为f5kb，3kb，2kb，1. f5kb，Ikb，750bp，500bp， 250bp，IOObp
[0112] 泳道4-8:单克隆psc42265-l，2，3，4，5
[0113] 琼脂糖凝胶电泳图片如图3。
[0114] PCR条带大小
[0115] 连接入ShRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为:38化P;
[0116] 没有连接入ShRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为:307bp。
[0117] 由此判断psc42265-l，2,3,4,5为阳性克隆，保存鉴定结果正确的克隆，并进行测 序。
[011引4.阳性克隆测序结果分析
[0119] W鉴定引物-F进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于 下一步实验。
[0120] PSC42265 测序结果：
[0121] ATATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATT TCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG ATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCAC ACATCTTCCGTATCTTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGGCAGTATTCATCCACGAATTCGGATCCATTAGG CGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGC CCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTG
[0122] * ShRNA干扰序列插入片段用粗字体标注，其中AgeI酶切位点被破坏。
[0123] 质粒抽提
[0124] 将测序正确的菌液转接于150ml含Amp抗生素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培 养过夜。按照Endo化ee Maxi Plasmid Kit说明书提取质粒，质检合格的质粒进入下游流 程。
[0125] 详细操作步骤如下：
[01%] 1.8000巧m离屯、4min收集菌体。
[0127] 2.加入7ml P1，震荡混匀；
[012引 3.加入7ml P3,颠倒混匀6~8次，静置5min;
[0129] 4.加入7ml P4,颠倒混匀6~8次，冰浴IOmin;
[0130] 5.900化pm离屯、lOmin，将上清转移到过滤器CS中，过滤后加入IOml异丙醇混匀；
[0131] 6.向吸附柱中加入2.5ml的平衡液化，800化pm离屯、2min，倒掉收集管中的废液，将 柱子放回备用；
[0132] 7.将上清分两次倒入吸附柱中，800化pm离屯、2min，弃废液；
[0133] 8.向吸附柱中加入IOml漂洗液PW(已加入无水乙醇），相同转速离屯、2min，弃废液， 重复该步骤一次；
[0134] 10.向吸附柱中加入3ml无水乙醇，800化pm离屯、2min，弃废液；
[01巧]11.950化pm空甩5min，除去残留的漂洗液；
[0136] 将吸附柱转移至一新的白管中，在柱中屯、滴加 80化1洗脱缓冲液TB(先预热），室溫 放置5min，然后9500巧m离屯、2min;
[0137] 12.将管中的洗脱液转移到一干净的1. SndEP管中，-20°C保存；
[0138] 13.取样电泳，使用分光光度计(Thermo_Nano化OP 2000)测定质粒浓度，质检。
[0139] 14.将质检合格的质粒进行下一步病毒包装。
[0140] (四）病毒包装
[0141] 1.转染前2地，用膜蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，W含10 %血清的培养基调 整细胞密度约5x 106细胞/15ml，重新接种于IOcm细胞培养皿，37 °C、5 % C〇2培养箱内培养。 24h待细胞密度达70 %~80 %时即可用于转染；
[0142] 2.转染前化更换为无血清培养基；
[0143] 3.向一灭菌离屯、管中加入所制备的各DNA溶液(GV载体质粒20iig、p化Iper 1.0载 体质粒15]ig、p化Iper 2.0载体质粒IOyg)，不相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体 积为Iml，在室溫下溫育15min;
[0144] 4.混合液缓慢滴加至293T细胞培养液中，混匀，于37 °C、5 % C〇2细胞培养箱中培 养；
[0145] 注:加入过程一定要均匀，尽可能地不要将细胞吹起。
[0146] 5.培养化后弃去含有转染混和物的培养基，加入IOml的PBS液清洗一次，轻柔晃动 培养皿W洗涂残余的转染混和物后倒弃；
[0147] 6.缓慢加入含10 %血清的细胞培养基20ml，于37 °C、5 % C02培养箱内继续培养48- 7化。
[0148] (五)病毒的浓缩与纯化
[0149] 1.根据细胞状态，收集转染后4她(转染即可计为化)的293T细胞上清液；
[0150] 2.于4°C、4000g离屯、lOmin，除去细胞碎片；
[0151] 3. Wo.45皿滤器过滤上清液于40ml超速离屯、管中；
[0152] 4.分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离屯、管逐一放入至Beckman超速离屯、 机内，设置离屯、参数为2500化pm，离屯、时间为化，离屯、溫度控制在4°C ;
[0153] 5.离屯、结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用 PBS戒细胞培养基替代），轻轻反复吹打重悬；
[0154] 注:该步骤病毒回收会存在一定程度损失，尽可能地避免病毒长时间暴露在室溫 中。
[01巧]6.经充分溶解后，高速离屯、1000化pm、5min后，取上清按要求分装；
[0156] 7.准备样品待检测。
[0157] (六)病毒感染细胞
[0158] 培养生长状态良好的目的细胞，进行病毒感染。于巧光显微镜下观察GFP表达情 况，巧光率达70-80 %左右，细胞汇合度达80 %左右，收集细胞进入下游实验。
[0159] 感染结果说明：
[0160] 根据图4,对照及目的慢病毒感染SMMC-7721细胞后72小时于显微镜下巧光观察， 观察结果显示细胞感染效率约达到80%，细胞状态正常。
[0161] (屯)WB验证目的基因干扰有效性
[0162] 1)转染前1天将生长良好的293T细胞按5X104/ml接种于24孔板中
[0163] 2)293T生长达 80 ~90% 融合时，换成 40化 W^opti-MEMl
[0164] 3)根据实验脂质体说明书进行293T细胞转染
[01化]4)将实验组和对照组质粒和Iipofectamine 2000分别溶解于opti-MEM中，混匀， 室溫静置5min
[0166] 5)将4.中稀释好的质粒和稀释好的Iipofectamine 2000混匀，室溫静置20min
[0167] 6)把质粒DNA不Lipofectamine 2000的混合液加入293T细胞中，37°C5%C02培养 箱中培养6~化，换成新鲜的含10%血清化完全培养液
[0168] 7)转染后2地巧光显微镜下观察预估转染率
[0169] 8)转染后36~4她收集细胞，抽提总蛋白进行western blot检测
[0170] 根据图5,从Western Blot结果可W看出，在293T细胞中，祀点对WIPI2基因化外源 表达在蛋白质水平有显著化敲减作用。
[0171] (八)巧光定量PCR检测目的基因干扰有效性
[0172] !.Total RNA抽提
[0173] 按照上海普飞公司Trizol试剂盒说明书抽提目的细胞to化1 RNA。
[0174] 详细操作步骤如下：
[01巧]1)收集细胞，200化pm离屯、5min;去上清，细胞沉淀中加入1血Trizol;充分混匀后 室溫静置5min，转移至新的EP管中。
[0176] 2)加入2(K)化氯仿，颠倒混匀15s，室溫静置lOmin。
[0177] 3)4°C、12800rpm，离屯、15min。
[0178] 4)转移上层液体至新的EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4°C静置lOmin。 [01巧]5)4°C、12800巧m离屯、12min，弃上清。
[0180] 6)加入ImL 75%乙醇（用DEPC水新鲜配制），洗涂沉淀。
[0181 ] 7)4°C、11800巧m离屯、5min，弃去大部分上清。
[0182] 8)4°C、11800巧m再次离屯、5min，弃去上清，室溫干燥。
[0183] 9)加入RNase-打ee水至RNA沉淀完全溶解，Nano化OP 2000/2000C分光光度计分析
[0184] 测定RNA浓度及质量。
[01化]2.反转录获得CDNA
[01化]按照Promega M-MLV试剂盒说明书将RNA反转录获得cDNA。详细操作步骤如下：
[0187] 1)按下表配制混合物，混匀后离屯、；70°C溫浴IOmin;之后立即置于冰水混合物中 冰浴，使Oligo肌和模板退火。
[0188] 试剂使用量
[0189] Oligo 肌（0.5蛇/化） 化 1
[0190] Total RNA 2yl
[0191] RNase-Free 肥0 Up to IOyl
[0192] 2)按下表配制反应体系(冰上进行），加入步骤I制备的混合物中，混匀，短暂离屯、
[0193] 试剂使用量
[0194]
[01 巧]注：dNTPs 是 dATP，dCTP，dGTP，dTTP 的混合，浓度为 IOmM
[0196] 3)上述体系置于如下条件反应:42 °C反转录化，70°C IOmin使RT酶失活。将所得产 物cDNA-2(TC保存备用。
[0197] 3.Real-Time qPCR基因表达检测
[0198] 按照TAKARA SYBR Master Mixture试剂盒说明书进行目的基因 real-time qPCR 表达检测。
[0199] 详细操作步骤如下：
[0200] 1)按下表配置反应体系，进行qPCR扩增，反应条件为:95°C 15s ;95°C5s，60°C30s， 45次循环。在每一步的延伸阶段读取吸光值。
[0201] 试剂使用量
[0202]
[0203]
[0204] 2)qPCR结束后，制作烙解曲线，反应条件为:95°Clmin;冷却至55°C，使DNA双链充 分结合;从55°C开始到95°C，每增加 0.5°C，保持4S，同时读取吸光值。
[02化]4.数据分析
[0206] 本实验采用2-A AGt法分析数据：
[0207] A Ct=目的基因 Ct值-内参基因 Ct值；
[020引 -A A Ct =对照组A Ct平均值-各样品A Ct值；
[0209] 2-AAet反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平
[0210] 根据图6,经ShRNA慢病毒感染3天后，实验组SMMC-7721细胞中WIPI2基因在mRNA水 平的表达量受到抑制。
[0211] (九)MTT检测WIPI2基因干扰后对细胞生长的影响
[0212] 1.将处于对数生长期的各实验组细胞膜酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液， 并计数。
[0213] 2.根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(多数为2000cell/well)，每组3-5重复， 根据实验设计决定铺板数量(检测5天，则铺5张 96孔板）。
[0214] 3.统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如 果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板(如:发现Con组细胞较多，降低 细胞量再次铺板），放入细胞培养箱中培养。
[0215] 4.从铺板后第二天开始，培养终止前地加入20化5mg/mL的MlT于孔中，无需换液。
[0216] 5. 4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲琐颗粒，加 100化DMSO溶解 甲琐颗粒。
[0217] 6.振荡器振荡2-5min，酶标仪490皿检测OD值，根据图7,实验组SMMC-7721细胞化 增殖速率受到显著抑制。
[021引7.数据统计分析。
[0219] (十)流式细胞仪检测WIPI2基因干扰后细胞调亡情况
[0220] 1.将SMMC-7721细胞分别铺于6孔板中，按照W上慢病毒感染细胞方法将对照组慢 病毒载体和干扰组慢病毒载体分别感染肝癌细胞，继续培养5天。
[0221] 2.膜酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，与上清细胞收集于同一 5mL离屯、管中， 每组设=个复孔。
[0222] 3. ISOOrmp离屯、5min，弃上清，4°C预冷的D-化址S(抑=7.2~7.4)洗涂细胞沉淀。
[0223] 4. 1 Xbinding buffer洗涂细胞沉淀一次，1300;rmp、3min离屯、，收集细胞。
[0224] 5. 200化 1 Xbinding buffer重悬细胞沉淀。
[02巧]6.加入10化Annexin V-APC染色，室溫避光10-15min。
[02%] 7.根据细胞量，补加 400-800化I Xbinding buffer,上机检测。
[0227] ShRNA慢病毒感染SMMC-7721细胞，培养5天后，shWIPI2组与对照组（she化1)调亡 率对比，显著增多（图8和图9)。
[02%](十一 )WIPI2基因干扰后影响肝癌细胞增殖情况
[0229] (1)准备感染后细胞:将处于对数生长期化各实验组细胞膜酶消化，完全培养基重 悬，制成细胞悬液，计数。
[0230] (2)细胞接种:于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔(根据细胞生长 情况确定），每个实验组设3个复孔。
[0231] (3)将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大 于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态。
[0232] (4)实验终止前巧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，PBS洗涂细胞1次。
[0233] (5)每孔加入ImL 4%多聚甲醒，固定细胞30-60min，PBS洗涂细胞1次。
[0234] (6)每孔加入洁净、无杂质GIEMSA染液500化，染细胞10-20min。
[0235] (7) d地20洗涂细胞数次，惊干，数码相机拍照整，克隆计数。
[0236] ShRNA慢病毒感染3天后，细胞铺于6孔板，铺板量为600。8天后，观察克隆数，发现 实验组S匪C-7721细胞集落数目减少，提示WIPI2基因与S匪C-7721细胞的克隆形成能力显 著相关(图10和图11)。
[0237] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可W做出若干改进和变形，运些改进和变形 也应视为本发明化保护范围。
【主权项】
1. ￥1?12基因的8111?财干扰序列，包括0财〇1丨8〇的正链和反链，正链序列为5'-CCGGGATACG GAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3 '，反链序列为5 ' -AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3 ' ；所述的正链和反 链退火形成带粘性末端的双链DNA。2. 人WIPI2-shRNA慢病毒载体，由权利要求1所述的双链DNA插入慢病毒载体中制成。3. 根据权利要求2所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体，其特征在于，所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体针对的RNA干扰靶点序列为:5' -TACGGAAGATGTGTGCATT-3'。4. 人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤： (1)合成针对RNA干扰靶点序列的DNA oligo的正链和反链，正链序列为5'-CCGGGATACG GAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3 '，反链序列为5 ' -AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAAT GCACACATCTTCCGTATC-3 ' ；所述的正链和反 链退火形成带粘性末端的双链DNA; (2 )通过酶切使载体线性化，使线性化载体与步骤(1)得到的双链DNA连接； (3 )将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定； (4)质粒抽提，用于下一步病毒包装。5. 根据权利要求4所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，在步骤 (1)中，将合成的DNA oligo的正链和反链的干粉溶解于退火缓冲液中，水浴；自然冷却至室 温后，形成带粘性末端的双链;退火缓冲液含有Tris、EDTA、NaCl。6. 根据权利要求4所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(2) 中，酶切反应中加入AgeI和EcoRI。7. 根据权利要求4所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(3) 中，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞的具体步骤为:将连接产物加入到大肠杆菌感受 态细胞中，冰浴;热激，冰浴;加入无抗生素的LB液体培养基，摇床震荡培养;取菌液均匀涂 抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37° C培养箱中过夜培养；阳性克隆进行PCR鉴定过程中 采用的鉴定引物为鉴定引物-F : 5 ' -CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3 '和鉴定引物-R: 5 ' -GTAATACGGTTATCCACGCG-3 '，具体过程为:挑取单菌落进行PCR扩增，电泳，测序。8. 根据权利要求4所述的人WIPI2-shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(4) 中，将经PCR鉴定合格的菌液转接培养后，进行质粒抽提;所述的质粒用于转染293T细胞。9. 人WIPI2-shRNA慢病毒载体在制备shRNA慢病毒以及作为制备降低WIPI2基因的表 达、降低被病毒侵袭的细胞生长速率或提高被病毒侵袭的细胞凋亡率的试剂中的应用。10. 人WIPI2-shRNA慢病毒载体在制备降低被病毒侵袭的肝癌细胞生长速率的试剂中 的应用。
【文档编号】C12N15/867GK105925581SQ201610457343
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】袁献温, 丁义涛, 孙喜太, 施晓雷
【申请人】南京大学医学院附属鼓楼医院