大青杨PuICE1基因及其编码蛋白和应用
【专利摘要】大青杨PuICE1基因及其编码蛋白和应用，涉及一种ICE1基因及其应用。本发明中的一条大青杨ICE1基因，开放读码框全长1635bp，编码由545个氨基酸残基组成的多肽，命名为PuICE1基因，可用于培育抗寒转基因植物品种。本发明基因的大量表达不影响植物的生长；在低温胁迫条件下，PuICE1过表达株系的拟南芥长势明显优于野生型拟南芥，表明PuICE1基因具有较强的抗逆功能。进而我们通过DAB等组织染色分析低温胁迫下转基因拟南芥的H2O2和O2?含量，结果发现在非生物胁迫下PuICE1过表达拟南芥株系能够降低体内过氧化氢和活性氧的积累，细胞损伤程度较低，表现出较强的抗逆能力。
【专利说明】
大青杨Pu ICE1基因及其编码蛋白和应用
技术领域
[0001] 本发明设及大青杨化ICEl基因及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 转录因子，也称反式作用因子，是一类能识别真核生物基因启动子区域中的顺式 作用元件，并与之发生特异性结合的蛋白质。通过转基因技术使一个特定转录因子在植物 体内过量表达，就可通过它促使多个功能基因发挥作用，从而达到植物性状获得综合改良 的效果。与过量表达个别功能基因相比，在植物体内过量表达一个转录因子是提高植物抗 逆性更为有效的方法和途径。通过转基因技术和遗传分析手段的有力结合，鉴定出更多的 对植物改良有重大意义的转录因子，将为未来选育和改良抗逆植物奠定基础。
[0003] ICEUinducer of CBF e邱ressionl)也被称为诱导CBF表达基因，是能够调节冷 诱导基因（cold-regulated,C0R)表达的最上游转录因子。它编码一个类似转录激活基因 (MYC)的地LH转录因子，在常溫下纯化，在低溫情况下能够特异地结合CBF3启动子中的MYC 作用元件，诱导CBF3的表达，CBF3进一步结合到其下游目的基因启动子的DRE序列，诱导下 游一系列冷诱导基因 W及其它在植物寒冷适应中起作用的基因的表达，继而提高转基因植 株的抗寒性(化111]1113日1]17等，2003;1^66等，2005)。化;[]1]1113日1]17等(2003)首次化学诱导基因突 变的方法分离出低溫诱导的组成型突变体icel，发现突变体icel极大抑制了 CBF3的表达W 及降低了一些受CBFs调控的下游基因的表达，而且突变体的耐寒力明显下降。他们进一步 采用图位克隆法分离了ICEl基因，可特异地结合到CBF3启动子的MYC作用元件，并诱导CBF3 调控的下游基因的表达。ICEl基因在拟南芥的抗寒中起着关键性的调控作用。Lee等(2005) 采用基因忍片的方法从整个转录组水平上研究了 ICEl在拟南芥耐寒及其在基因表达调控 中的作用，icel突变体影响了一些低溫胁迫早期应答基因 W及受ABA或生长素调控基因的 表达，进一步验证了 I CEl在植物低溫胁迫应答中起着关键性的核屯、作用。国内学者化ang和 Sun(2005)首次将拟南芥ICEl通过农杆菌介导法成功转入巧樣(CitrusLimon)。林元震等 (2007) W拟南芥ICEl蛋白序列为信息探针，利用杨树EST数据库和毛果杨基因组序列拼接 的结果，设计引物并通过RT-PCR从甜杨克隆了杨树的第一个ICEl基因。林元震等（2011)通 过RT-PCR从赤按克隆了按树的第一个ICEl基因。EcaICEl基因表达分析结果显示，EcaICEl 在赤按根、茎、叶中均表达，而且表达水平不受低溫胁迫处理时间的影响，运表明EcaICEl是 组成型表达。此外，EcaICEl的超表达可W提高转基因烟草的耐低溫能力，为进一步研究 EcaICEl在赤按耐低溫胁迫过程中基因表达的调控机制打下基础。黄小山等(2105)从构橘 中克隆得到PtrICEl基因，转PtrICEl基因烟草和巧樣在抗寒胁迫中抗性明显提高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从抗寒能力优良的大青杨中克隆获得一个能明显提 高植物抗寒能力的大青杨ICEl基因，命名为化ICEl，化ICEl基因 cDNA全长1635bp。
[0005] 本发明的大青杨化ICEl基因，它的核巧酸序列如序列表Seq ID No: 1所示。
[0006] 本发明的大青杨化ICEl基因编码的蛋白，它的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2 所示。
[0007] 本发明的大青杨化ICEl基因的应用，它用于培育抗寒转基因植物品种。
[000引本发明包含W下有益效果：
[0009]本发明的大青杨化ICEl的过表达能够明显提高转基因拟南芥的耐低溫能力。
【附图说明】
[0010]图1是大青杨化ICEl基因保守区预测图；
[0011] 图2是大青杨化ICEl与其它5种植物ICEl蛋白多序列比对图；
[0012] 图3【具体实施方式】二中在非胁迫条件(Con化〇1)下和在低溫胁迫条件下阳性转基 因拟南芥植株(0E1和0E2)与野生型拟南芥植株(WT)的生长状况图；
[0013] 图4是【具体实施方式】二中DAB染色试验的染色结果图；
[0014] 图5是【具体实施方式】二中NBT染色试验的染色结果图；
[0015] 图6是【具体实施方式】二中Evans blue染色试验的染色结果图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0016] 一:本实施方式的大青杨化ICEl基因，它的核巧酸序列如序列表Seq ID No: 1 所示。
【具体实施方式】 [0017] 二:本实施方式的大青杨化ICEl基因编码的蛋白，它的氨基酸序列 如序列表Seq ID No:2所示。
【具体实施方式】 [0018] 本实施方式的大青杨化ICEl基因的应用，它用于培育抗寒转基 因植物品种。
[0019] 本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具体实施方式】的组 合同样也可W实现发明的目的。
[0020] 一、本发明的大青杨化ICEl基因获取过程如下：
[0021] 1、大青杨化ICEl基因的克隆
[0022] 在毛果杨基因组数据库中找到一条Pt I CE 1基因，设计特异性引物(PuI CE 1-T F: 5 ' -ATGCTTTATAGACTCAATAGC-3 ' ； PuICEl-T R: 5 ' -CTACATCGCGCCATGGAAGCC-3 ' ；），W大青杨 cDNA为模板进行PCR(PCR扩增体系：cDNA2.0化，10XExTaqPCRbuffer2.0化，10mmol/ LdNTP MixO.化L，10皿01/L引物各1.0化，抓AiLEx TaqO.化L，补水至20.0化。PCR反应程序： 94°C 预变性 30s;94°C 变性 1〇3、58°(：退火3〇3、72°(：延伸2111111，共35个循环;72°(：延伸1〇111111，4 °C保存。取扣LPCR产物进行电泳检测，W化2000DNAMarker为参照），回收目的条带，连接T载 体，转化大肠杆菌，对阳性克隆进行PCR验证，测序，经分析(分析过程如下所示），最终获得 PuICEl基因编码区全长序列。保存阳性克隆，提取质粒，记为pMD18-T-PuICEl。
[0023] 2、利用生物信息学软件和在线网络资源对克隆获得的化ICEl基因进行序列特征 分析：
[0024] 运用 ExPASy 化 ttp: //www. e 邱asy. o;rg/tools/p;ro1:param. html)在线软件，我们对 大青杨化ICEl基因编码的蛋白质进行了基本理化性质的预测分析，如下：
[00巧]编码的氨基酸数:545
[0026] 等电点(PI ):5.00
[0027] 分子量(MW) :134704.2
[002引分子式；〔4983陆333化63日O2101S310 [00巧]不稳定系数（II) :39.63
[0030] 平均疏水性(GRAVY) :0.701
[0031] 脂肪系数(AI):28.93
[0032] 利用Blast程序化ttp://www.ncbi .nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列同源性捜索， 选择与其相似程度高的其他6种不同植物的ICEl基因氨基酸序列，用多序列联配程序 Clustalx进行多序列比对。所选择的5种植物的ICEl基因分别为：拟南芥（ArabidopsiS thal iana)、毛果杨（P.trichocarpa)、甜杨（P.suaveolens)、蓝按树化ucalyptus globulus)、赤按化ucalyp1:us camaldulensis)。通过Clustal软件对该基因编码蛋白序列 与其他相似程度高的5种植物的I CE 1基因的序列同源性比较发现，大青杨化I CE 1蛋白序列 与其它5种植物的I CE 1蛋白的同源性分别为49 %、87 %，71 %、55 %、54 %，其中与毛果杨的 同源性最高。
[0033] 二、PuICEl基因的抗逆功能研究
[0034] 1、PuICEl过表达载体构建与转基因拟南芥的获得
[0035] 所用引物及测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司（Sangon，http : // WWW.sangon.biogo.net/)合成及完成，引物序列：
[0036] PuICEI-OE F:5'-TCGAGCTCGGTACCCATGCTTTATAGACTCAATAGC-3'；
[0037] PuICE1-0邸：5'-CTCTAGAGGATCCCCCTACATCGCGCCATGGAAGCC-3'；
[003引 PR0K2F:5，GGCGAACGTGGCGAGAAAGG-3，；
[0039] PR0K2R:5'-ACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC-3 \
[0040] W之前获得的阳性克隆pMD18-T-PuICEl质粒为模板，PuICEI-OE F和化ICEl-OE R 为引物（下划线为引入PR0K2同源互补序列），利用PCR方法引入PR0K2质粒线性化末端的同 源互补序列。PCR扩增体系：DNA 2.OiiiaoxEx Taq PC肺Uffer 2.0山，lOmmol/L dNTP Mix 0.化I，10皿ol/L引物各I.化1，抓AUEx hq 0.化I，补水至20.0山。PCR反应程序：94°C预变 性 2min;94°C 变性 10s、58°C 退火 30s、72°C 延伸 2min，共 35 个循环;72°C 延伸 10min，4°C 保存。 取化IPCR产物进行电泳检测，WDL2000DNAMarker为参照。回收PCR产物，用限制性内切酶 SmaI对pROKSvector进行单酶切。将目的基因（PuICEl)片段与pROKSvector的连接反应。连 接产物转化大肠杆菌，阳性克隆PCR检测。挑取阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有 限公司测序。将测序成功的重组质粒转化农杆菌，进行农杆菌菌液检测。
[0041] 采用薩花法进行拟南芥的遗传转化，将盛花期的拟南芥的花序浸泡在含有过表达 质粒农杆菌的浸染液中[3%薦糖、150WI1O1/L乙酷下香酬的1/2MS液体培养基(pH=5.8)， 0D600>0.2] IOs，期间轻轻摇动，取出后室溫放置IOmin，再侵染一次。侵染过的植株需保 湿，4化后用水喷雾将转化植株彻底清洗一次。21~28d收集种子，加入适量变色硅胶保持干 燥。标记为TO代，4°C保存。转基因拟南芥的TO代种子表面消毒后铺于含50mg/L Kan的筛选 培养基上进行逐代筛选，直至获得T3代种子，利用PR0K2载体引物对筛选出的抗性苗进行 PCR检测。进一步对过表达转基因拟南芥株系中化ICEl基因的表达量进行实时巧光定量RT- PCR分析后，选取pR0K2-PuICEl转基因拟南芥1号株系和2号株系用于后续试验的研究，并将 它们分别命名为:〇El和0E2。
[0042] 2、PuICEl转基因拟南芥非生物胁迫下的抗逆分析
[0043] (1)转基因拟南芥非生物胁迫下的形态学分析
[0044] 将化ICEl过表达拟南芥植株和野生型拟南芥植株分别移至正常的1/2MS于常溫条 件下及人工气候室中4°C低溫培养15d，观察各植株的长势情况，结果如图3所示。
[0045] 在非胁迫条件下（control),转基因拟南芥株系0EU0E2的生长状况与野生型拟南 芥(WT)基本一致;而在低溫胁迫条件下，PuICEl基因的过表达株系OEl和0E2的拟南芥长势 明显优于野生型拟南芥(WT)。实验结果表明化ICEl基因具有良好的抗逆功能，且不影响植 物的生长。
[0046] (2)非生物胁迫下转基因拟南芥的组织化学染色分析
[0047] 为了确定化ICEl基因在非生物胁迫下的功能，用生理生化染色做进一步的研究。 分别用4周大的野生型和过表达株系的组培苗，然后取未胁迫处理和胁迫处理2地后各植株 的叶片分别进行DAB、NBT、伊文斯兰染色，分析化ICEl基因的抗逆功能。
[〇〇4引 DAB染色结果如图4所示。在非胁迫生长条件(Con化〇1)下过表达株系OE和WT植株 叶片基本无颜色，且相互之间无明显差异，说明此化含量大致相同；在低溫胁迫条件下过表 达株系OE和WT植株叶片上的颜色发生明显的变化。阳性转基因拟南芥株系植株OE叶片上的 颜色比野生型拟南芥叶片上的颜色浅，表明过表达株系OE植株叶片内的此化的含量较野生 型拟南芥植株(WT)叶片内的此化含量少，说明阳性转基因拟南芥株系植株受胁迫之后的损 伤程度低。NBT的染色结果如图5所示，与DAB染色结果相同，在非胁迫生长条件(Control)下 过表达株系OE和WT植株叶片基本无颜色，且相互之间无明显差异，说明出化含量大致相同； 在低溫胁迫条件下过表达株系OE和WT植株叶片上的颜色发生明显的变化。阳性转基因拟南 芥株系植株OE叶片上的颜色比野生型拟南芥叶片上的颜色浅，表明过表达株系OE植株叶片 内的此〇2的含量较野生型拟南芥植株(WT)叶片内的此0洽量少，说明阳性转基因拟南芥株 系植株受胁迫之后的损伤程度低。Evans blue染色结果如图6所示，在胁迫条件下，阳性转 基因拟南芥株系植株OE染色明显弱于野生型拟南芥植株WT，说明了阳性转基因拟南芥株叶 片组织内细胞的死亡率比野生型低。实验结果证明化ICEl基因可在拟南芥植株体内起抗逆 作用。
【主权项】
1. 大青杨PuICEl基因，其特征在于它的核苷酸序列如序列表Seq ID No :1所示。2. 大青杨PuICEl基因编码的蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如序列表Seq ID N〇:2 所示。3. 大青杨PuICEl基因的应用，其特征在于它用于培育抗寒转基因植物品种。
【文档编号】C12N15/82GK105925588SQ201610443550
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】王艳敏, 白卉, 邢亚娟, 李春明, 卢慧颖, 李静
【申请人】黑龙江省林业科学研究所