一种高纯度单克隆抗体的制备方法、单克隆抗体及应用

一种高纯度单克隆抗体的制备方法、单克隆抗体及应用
【专利摘要】本申请公开了一种高纯度单克隆抗体的制备方法、单克隆抗体及应用。本申请的制备方法，包括提取外周血和/或组织细胞免疫样品；采用高通量测序技术从免疫样品中获得抗体核苷酸信息，将所有免疫样品中共有的重轻链序列合并，获得抗体对全长序列；合成所筛选出来的单克隆抗体核苷酸序列，采用真核表达系统进行蛋白表达，提纯表达蛋白，即获得高纯单克隆抗体。本申请的制备方法，能获得完全人源化单克隆抗体，通过分析重轻链配对信息，能获得天然条件的抗体结构，保证其具有较高亲和力；结合高通量测序分析，得到大量高特异性单克隆抗体，具有高通量优势。本申请的制备方法为大量制备高特异性、高亲和力、高纯度单克隆抗体提供了一种新思路和途径。
【专利说明】
-种高纯度单克隆抗体的制备方法、单克隆抗体及应用
技术领域
[0001] 本申请设及单克隆抗体制备领域，特别是设及一种高纯度单克隆抗体的制备方 法，所制备的单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] Kohler和Milstein在1975年发明的杂交瘤技术使人们第一次获得了单克隆抗体。 相对于多克隆抗体，单克隆抗体具有更高的特异性和均一性，在临床诊断和科研领域显示 出无可比拟的优势。从那时起，利用不同途径来获得抗原特异性单克隆抗体的技术层出不 穷。除了经典的杂交瘤技术外，还包括:B细胞永生化、隧菌体展示技术、酵母展示技术等等， 都在抗体的制备和人源化过程中显得日益重要，但是通过运些技术获得的抗体与自然环境 下循环系统中真实存在的抗体还是具有一定差异。运些不同的技术方法大多属于劳动密集 型工作，并且十分耗时。
[0003] 杂交瘤技术作为目前单克隆抗体制备的经典技术，其主要缺点一方面体现在其劳 动密集型工作特点，操作重复步骤多，速度慢，效率低，不能满足高通量筛选的要求;其次， 杂交瘤细胞需要进行多次亚克隆才能获得相对稳定的细胞系，并且获得的杂交瘤细胞遗传 不稳定;此外，在通过腹水制备单克隆抗体的过程中会对实验动物造成痛苦。
[0004] 隧菌体展示技术通过隧菌体外壳蛋白3或外壳蛋白8表达蛋白，将淋己细胞中的整 套编码抗体基因序列克隆到载体上，形成人源化的抗体文库，W融合蛋白的形式展现在隧 菌体表面，通过多轮的淘选可获得完全人源化抗体。然而，隧菌体展示技术十分依赖于文库 的多样性，只有文库的库容量足够大时，才能筛选到阳性隧菌体;隧菌体展示技术的另一个 的局限是真核生物基因很难在原核生物中进行正确的表达和修饰，外源基因转化效率低， 很难获得高亲和力抗体和针对稀有抗原的抗体。

【发明内容】

[0005] 本申请的目的是提供一种新的高纯度单克隆抗体的制备方法，所制备的高纯度的 单克隆抗体及其应用。
[0006] 为了实现上述目的，本申请采用了 W下技术方案：
[0007] 本申请公开了一种高纯度单克隆抗体的制备方法，包括提取外周血和/或组织细 胞的免疫样品；采用高通量测序技术从免疫样品中获得初步的抗体核巧酸信息，将所有免 疫样品中共有的重轻链序列合并，获得抗体对全长序列;合成所筛选出来的单克隆抗体的 核巧酸序列，采用真核表达系统对合成的核巧酸序列进行蛋白表达，提纯所表达的蛋白，即 获得高纯度单克隆抗体。
[000引其中，免疫样品是指带有抗体的样品，通常有两种情况，一种是直接采用抗原对受 试对象进行免疫，第二种是受试对象本身就是带病的。另外，合成所筛选出来的单克隆抗体 的核巧酸序列，实际上就是经过高通量测序分析和重轻链配对分析得出的抗体对序列。
[0009]需要说明的是，本申请的关键在于采用高通量测序技术对免疫样品进行测序、分 析，获得大量的特异性强、且亲和力高的抗体，并采用真核表达系统，对分析筛选出来的抗 体进行表达，有效的提高了单克隆抗体的制备效率，为制备高纯度、高特异性和高亲和力的 抗体提供了一种新的思路和途径。本申请的制备方法能够得到大量的高特异性、高亲和力 的单克隆抗体信息，与传统的单克隆抗体技术相比，本申请的制备方法一次性可W筛选并 制备出若干个符合要求的单克隆抗体，具有高通量的优势；当然，筛选出的多个单克隆抗 体，是分别进行真核表达、提纯的，保障各个单克隆抗体的纯度。
[0010] 优选的，本申请的制备方法还包括，将抗体对全长序列翻译为抗体氨基酸序列，从 抗体氨基酸序列中筛选出互补决定区，并对其进行表达量和突变频率分析，筛选出高亲和 力、高特异性的单克隆抗体。
[0011] 优选的，采用高通量测序技术从免疫样品中获得初步的抗体核巧酸信息，具体包 括，分别提取外周血和/或组织细胞免疫样品的RNA，对RNA进行反转录，获得CDNA文库，采用 高通量测序技术对CDNA进行测序，即获得初步的抗体核巧酸信息。
[0012] 优选的，采用高通量测序技术从免疫样品中获得初步的抗体核巧酸信息，具体包 括，从提取的免疫样品中分离单核细胞，并采用巧光标记的抗原，对单核细胞进行染色;然 后通过流式细胞仪分选与抗原结合的单核细胞，即得到抗原特异性B细胞;最后对抗原特异 性B细胞进行单细胞建库测序，获得初步的抗体核巧酸信息。
[0013] 优选的，采用高通量测序技术从免疫样品中获得初步的抗体核巧酸信息，具体包 括，从提取的免疫样品中分离单核细胞，采用抗原包被的磁珠分离与抗原结合的单核细胞， 即得到抗原特异性B细胞;最后对抗原特异性B细胞进行单细胞建库测序，获得初步的抗体 核巧酸信息。
[0014] 需要说明的是，采用抗原包被的磁珠分离与抗原结合的单核细胞的基本原理是， 预先将抗原包被在磁珠上，抗原与抗体结合后，自然的也将单核细胞固定在磁珠上，因此， 分离磁珠可W将与抗原结合的单核细胞分离出来，得到抗原特异性B细胞。本申请中，磁珠 包被和流式细胞仪都可W筛选出抗原特异性B细胞，通过对抗原特异性B细胞进行测序分 析，能够最大程度获得特异性抗体，保证得到的抗体绝大部分具有特异性。
[0015] 优选的，本申请的制备方法还包括采用抗原亲和层析方法，从提取的外周血免疫 样品中富集特异性的抗体;然后采用质谱分析;将质谱分析的数据作为筛选条件，对基于高 通量测序获得的抗体序列进行筛选，获得高亲和力、高特异性的单克隆抗体。
[0016] 优选的，蛋白酶为胃蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、膜蛋白酶、胞内蛋白酶Lys-C、 金属内肤酶Lys-N、蛋白内切酶Glu-C、天冬氨酸肤链内切酶Asp-N和梭菌蛋白酶Arg-C中的 至少一种。
[0017] 需要说明的是，本申请的抗原亲和层析方法是指，将抗原固定在层析柱上，利用抗 原将特异性的抗体分离出来，从而保障了抗体的高特异性。而采用质谱分析获得的数据对 高通量测序的结果进行筛选，是考虑到质谱分析的对象实际上就是高特异性的、通过抗原 亲和层析获得的抗体，因此，其分析数据自然是一些高特异性的抗体的特征信息，因此，可 W利用运些特征信息，对高通量测序结果进行筛选，从而筛选出高特异性、高亲和力的单克 隆抗体。
[0018] 可W理解，在本申请的其它实现方式中，例如巧光标记抗原筛选抗原特异性B细胞 或抗原包被磁珠分离抗原特异性B细胞，然后对分离的抗原特异性B细胞进行高通量测序的 实现方式中，其本身就是针对抗原特异性的B细胞进行的高通量测序，因此可W直接筛选出 高特异性、高亲和力的单克隆抗体，而不需要与基于抗原亲和层析的质谱分析结合，即不需 要利用质谱分析的数据对高通量测序结果进行筛选。
[0019] 优选的，采用真核表达系统对合成的核巧酸序列进行蛋白表达，具体包括，将合成 的核巧酸序列克隆到pFUSE质粒上，通过脂质体转染293T细胞或C册细胞获得表达，并使用 无血清培养基培养和驯化转染细胞，得到能够高表达重组单克隆抗体的细胞系。
[0020] 优选的，提纯所表达的蛋白，具体包括，采用偶联纯化柱分离纯化，获得高纯度的 单克隆抗体。
[0021] 优选的，本申请的制备方法还包括采用ELISA对获得的高纯度单克隆抗体进行鉴 定。
[0022] 可W理解，本申请的制备方法可W获得高纯度、高特异性、高亲和力的抗体，但是 为了进一步的保障抗体的性能，因此，采用化ISA对获得的高纯度单克隆抗体进行鉴定。
[0023] 本申请的另一面公开了一种采用本申请的制备方法所制备的单克隆抗体。
[0024] 本申请的再一面公开了一种制备单克隆抗体的试剂盒，该试剂盒中采用了本申请 的制备方法。
[0025] 可W理解，本申请的制备方法，能够制备出高特异性、高亲和力的单克隆抗体，与 传统方法相比具有高通量的优势；因此，完全可W将相关试剂组合成配套的试剂盒，然后按 照本申请所提供的方法进行单克隆抗体的制备。
[0026] 由于采用W上技术方案，本申请的有益效果在于：
[0027] 本申请的制备方法，能够获得人体或动物体内循环系统中存在的抗体信息，可获 得完全人源化单克隆抗体。并且，通过信息分析获得重轻链配对信息，能够获得天然条件下 的抗体结构，保证获得的抗体具有较高的亲和力；结合高通量测序、分析，能够得到大量的 高特异性、高亲和力的单克隆抗体，相比传统的单克隆抗体技术具有高通量的优势。本申请 的制备方法为大量制备高特异性、高亲和力、高纯度的单克隆抗体提供了一种新的思路和 途径。
【附图说明】
[0028] 图1是本申请实施例中单克隆抗体制备方法的流程框图；
[0029] 图2是本申请实施例中流式细胞仪分离抗原特异性B细胞的FSC/SSC二维散点图；
[0030] 图3是本申请实施例中流式细胞仪分离抗原特异性B细胞的FLl通道/直方图；
[0031] 图4是本申请实施例中高通量测序结果的数据分析流程框图；
[0032] 图5是本申请实施例中肤段鉴定结果图；
[0033] 图6是本申请实施例中还原性SDS-PAGE电泳重组抗体结果图；
[0034] 图7是本申请实施例中非还原性SDS-PAGE电泳重组抗体结果图；
[0035] 图8是本申请实施例中抗体配对的原理示意图，其中，超过3个孔中同时出现的重 轻链序列被认为是配对抗体序列。
【具体实施方式】
[0036] 本申请的高纯度单克隆抗体制备方法，对提取的外周血和/或组织细胞免疫样品 进行高通量测序分析，并采用重轻链配对信息得到抗体对全长序列，然后合成所筛选出来 的单克隆抗体的DNA序列，采用真核表达系统对合成的单克隆抗体的DNA进行蛋白表达，提 纯该蛋白，从而获得高特异性、高亲和力、高纯度的单克隆抗体。
[0037] 与传统的杂交瘤技术和隧菌体展示技术相比，本申请的制备方法，直接合成高特 异性、高亲和力单克隆抗体的DNA，对其进行蛋白表达，针对性更强，效率高，能够实现高通 量筛选。并且，本申请的制备方法真核表达获得的直接就是完全人源化单克隆抗体，无需进 行多轮淘选。
[0038] 本申请的一种优选方案中，还对采用抗原亲和层析富集外周血中的特异性抗体， 并采用质谱分析对富集的抗体进行统计分析，将统计分析的结果，用于对高通量测序结果 进行筛选，W获得高亲和力、高特异性的单克隆抗体。整个过程将质谱分析技术与高通量测 序技术相结合，如图1所示，进一步的保障了单克隆抗体的高特异性和高亲和力。
[0039] 本申请的质谱分析是基于抗原亲和层析的，已有文献报道亲和层析主要利用 Protein A亲和层析介质或Protein G亲和层析介质进行抗体纯化，获得生物体液或细胞培 养液中全部免疫球蛋白，虽然获得蛋白样品高，但特异性较弱，不能保证获得的免疫球蛋白 具有高度亲和能力。而本申请使用抗原亲和层析方法，获取外周血中只针对祀抗原的免疫 球蛋白，特异性高，通过后续质谱分析，W及与高通量测序分析结合，能够获得高特异性、高 亲和力的单克隆抗体群。
[0040] 需要说明的是，如前面提到的，质谱分析技术并非必须的，例如在本申请的一些实 现方式中，在进行高通量测序之前已经对抗体的特异性进行了一次筛选，例如抗原巧光标 记筛选抗原特异性B细胞，然后再进行单细胞高通量测序;又例如抗原包被磁珠分离的抗原 特异性B细胞，在进行单细胞高通量测序。运两种实现方式本身就是有针对性的对特异性的 抗体进行的测序分析，再加上后续的重轻链分析，可W筛选出高特异性、高亲和力的单克隆 抗体，因此，可W不需要结合质谱分析技术。
[0041] 本申请中的抗体配对原理如图8所示，检测中超过3个孔同时出现重轻链序列被认 为是配对抗体序列。
[0042] 本申请的高纯度单克隆抗体制备方法，W抗原多肤CK18为例进行试验说明，CK18 也被称为KRT18,编码I型的中间纤维链角蛋白18,是一种最常见的中间纤维基因家族一员。 CK18在身体组织的单层上皮细胞中表达，同时运个基因的突变已与隐源性肝硬化有关。本 例中选择原核表达的CK18蛋白作为免疫原对小鼠进行免疫。
[0043] 下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。W下实施例仅对本申请 进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0044] 实施例一
[0045] 本例采用抗原巧光标记筛选抗原特异性B细胞，然后对单细胞进行测序、分析，筛 选高特异性、高亲和力的单克隆抗体。具体如下：
[0046] 一、样品制备
[0047] 1、免疫样品获取
[0048] 本例使用已知抗原多肤CK18, Wlmg/次的量对小鼠进行免疫，每两周免疫一次，共 进行4次免疫，在每次免疫后获取小鼠外周血，作为试验免疫样品。
[0049] 2、巧光分子标记抗原
[00加]巧光分子标记物可W采用常规使用的Alexa Fluor 488、門TC、切3、切5、阳、PE- TR、APC或PerCP等。本例具体采用的是FITC。首先将CK18抗原蛋白超滤至碳酸盐缓冲液中； 将ImL CK18抗原蛋白碳酸盐缓冲液加入有机溶剂溶解的巧光标记物中，缓慢加入，4°C避光 反应数小时，本例具体反应了化;有机溶剂可W采用常规使用的二甲基亚讽、二甲苯、甲苯、 乙醇或正丙醇，本例采用乙醇;避光反应结束后，向其中加入终浓度为50mM的离子缓冲液，4 °C反应数小时，本例具体的反应化;其中离子缓冲液可W采用氯化锭、硫酸锭，碳酸氨锭或 硝酸锭缓冲液，本例具体采用氯化锭;反应结束后，混合物超滤至憐酸盐缓冲液中，测浓度， 滤膜过滤除菌，-20°C保存，即FITC标记的抗原。
[0化1] 3、外周血单核细胞染色
[0052] 在15mL离屯、管中加入等体积的外周血、憐酸盐缓冲液和淋己细胞分离液，保持明 显液面分界，室溫SOOg离屯、30分钟，获得中间的淋己细胞层，再加入5mL憐酸盐缓冲液250g 离屯、10分钟，分离得到外周血单核细胞。
[0053] 将外周血单核细胞重悬，每IO6个细胞加 1~化g抗原-异硫氯酸巧光素，吹打混匀， 室溫避光反应。留少量细胞不加抗原-异硫氯酸巧光素作阴性对照。反应后，加入憐酸盐缓 冲液重悬，400g离屯、5分钟弃上清，再次用憐酸盐缓冲液重悬沉淀。400g离屯、5分钟，弃上清， 用憐酸盐缓冲液重悬沉淀，制备成样本。
[0化4] 4、流式细胞分选
[0055] 样本在上机前使用滤网过滤。选择分选收集模式，选择液滴偏向角度，确定滴液延 迟(Drop Delay),放置合适的收集器口，获取数据，进行分选。前向角散射/侧向角散射 (FSC/SSC)二维散点图，将外周血单核细胞区域划出来，W排除死细胞，细胞碎片和粒细胞 等其它细胞，如图2所示，图中人为圈出来的部分即外周血单核细胞。
[0056] 然后通过化1通道/直方图界面的二维峰形图判断阳性细胞，根据未染色细胞的 FLl通道巧光强度，确定抗原阴性和阳性的分界限；如图3所示，曲线1为没有巧光的单核细 胞；曲线2为巧光染色的单核细胞，即抗原特异性B细胞。
[0057] 二、单细胞免疫组库制备
[005引 l、首先配置裂解液:0.0化L10%的TritonX-100、0.1化40UA^L的RNA酶抑制剂、 1.0化 IOiiM的01ig0-dT、1.0化 IOiiM的dNTP及 1.86化 Spike-in RNA。
[0059] 将配置好的裂解液喷射分装到384孔板，每个孔的量为4化。喷液后，用滤纸吸去忍 片表面液滴，封上暂时膜，溫度12 °C、转速2600RCF下离屯、5min。
[0060] 2、配制细胞悬液
[0061] 将细胞悬液在转速为1000巧m的条件下离屯、5min，除上清，重复两次；加入适量憐 酸盐缓冲液，重悬细胞，用40WI1的细胞滤网进行过滤，得到过滤后的细胞悬液;取适量过滤 后细胞悬液，加入等量40 % per col 1溶液，配成20 % per CO 11细胞悬液；加入适量20 % percol 1溶液，配制成实验所需浓度细胞悬液，备用。
[0062] 阴性对照为20%percoll溶液；阳性对照为 100pg/50nL(2ngAiL)total-RNA。
[0063] 3、裂解细胞悬液
[0064] 裂解条件为72°C、维持5min，裂解结束后，将忍片置于溫度为12°C、转速为2600RCF 的条件下离屯、5min。
[00化]4、配置逆转录体系：2.OuL First-Strand BufferJ.OuLSM的甜菜碱、0.9化 IOOmM的MgCl2、0.2扣LlOOmM的二硫苏糖醇、0.1 化 IOOiiM的TS0、0.2扣L 40UAiL的RNA酶抑 制剂、0.7化1 200U/]iL的Superscript反转录酶组成。
[0066] 将配置好的裂解液喷射分装到384孔板，每个孔的量为6.2扣L。将384孔板封上封 口膜，在溫度为12°C、转速为2600RCF的条件下离屯、5min。
[0067] 5、逆转录细胞RNA
[006引 421：90111111;70°(：15111111;121：5111111。逆转录结束后，将忍片置于溫度为12°(：、转速为 2600RCF的条件下离屯、5min。
[0069] 6、配制PCR扩增反应体系
[0070] 本例的PCR扩增采用了6条下游引物，上游引物由Race abriged anchor primer (AAP)Invitorgen提供，并采用了一条错定引物。下游引物具体序列如Seq ID No. I至Seq ID No.6所示，错定引物如Seq ID No.7所示。
[0071] Seq ID No.l:Mouse IgHM:5'-AAGACATTTGGGAAGGACTGA-3'
[0072] Seq ID No.2:Mouse Ig服3:5'-CAGATGGGGCTGTTGTTGTA-3'
[0073] Seq ID No.3:Mouse_Ig服！-2pro:5'-GCCAGTGGATAGACDGATG-3'
[0074] Seq ID No.4:Mouse IgL5-4new:5'-TGAGGGTGTAGCCTTGGGT-3'
[0075] Seq ID No.5:Mouse I巧C:5'-GGATGGYGGGAAGATGGAT-3'
[0076] Seq ID No.6:Mouse IgLCl:5'-GGTGACTGATGGCGAAGAC-3'
[0077] Seq ID No.7：
[007引 错定引物:5 ' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3 '
[00巧]具体PCR扩增反应体系：去离子水31.5化、IOXPCR buffer 5.0化、25mM MgCb 3.0化、1 OmM dNTP miX混合物1.0化、上述各引物（1 OiiM) 2.0化、错定引物（1 OiiM) 2.0化、de? tailed cDNA 5.0 化、 hq DNA聚合酶 O.^iL。
[0080]其中，IOXPCR buffer包含200mM Tris-肥 1(抑 8.4)、500mM KC1。
[0081 ]反应条件为：94 °C 2min，然后进入 10个循环：94°C0.5min，55 °C Imin，72 °C Imin;循 环结束后，72°C5min。
[0082] 7、末端修复W及3 '末端加碱基"A"
[0083] PCR扩增产物先经过切胶回收纯化，然后在T4DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核巧 酸激酶等酶的作用下，WdNTP为底物进行末端修复，形成补平的末端憐酸化的DNA片段，使 用MiniElute PCR Purification Kit胶回收试剂盒回收产物。然后利用Klenow FYgment (3'-5'exo-)聚合酶及dATP在补平序列的3'末端加上碱基。用MiniElute PCR Purification Kit回收纯化反应体系的DNA。
[0084] 末端修复反应体系：RCR产物76化、10 XPolynucleotide Kinase Buffer 10化、 dNTP(10mM)4化、T4DNA聚合酶扣L、Klenow Fragment化L、T4多核巧酸激酶扣L。末端修复反 应条件为:20°C30min。
[0085] 加碱基"A"反应体系：末端修复回收DNA产物32化、IOx Blue buffer扣UdATP (lmM)10]iL、Klenow Rrgment(3'-5'exo-)聚合酶化L〇37°C恒溫30min。
[00化]8、连接接头
[0087] 3'末端加上碱基"A"的DNA序列在T4DNA Ligase连接酶的作用下进行接头连接，用 Mini Elute PCR Purification Kit回收连接产物，采用Qubit等方法对其进行定量。利用 琼脂糖凝胶电泳W及Mini Elute PCR Purification Kit回收纯化凝胶片段DM。
[008引 连接接头反应体系：DNA 15化、2XRapid Ligase Buffer 25化、PE Adapter oligo mix(化M)5化、T4DNA连接酶化L。反应条件为：20°C30min。
[0089] 9、文库接头PCR扩增
[0090] W使用已经连接接头的DNA产物为模板，加入Hiseq通用PCR引物，DNA高保真 Phusion酶进行PCR扩增，通过对接头序列进行扩增得到更高浓度的测序文库DNA。扩增产物 用磁珠进行纯化后即可得到测序文库。
[0091] PCR扩增反应体系：DNA 12.5化、PlPrimer(IOyM)IiiUPrimer Index(IOiiM)I化、分 子级水 10.5]iL、2Xphusion master mix 25化。
[0092] PCR反应条件:98°C Imin;然后进行30个循环:98°C 20s，65 °C30s，72 °C30s;循环结 束后，72°C5min;12°Chold。
[0093] 将所得到的测序文库在11 Iumina HiSeq2000高通量测序平台上进行测序，过滤除 去低质量的数据，得到测序结果。将所有免疫样品中共有的重轻链序列合并，获得抗体对全 长序列。本例经过数据分析筛选，获得了 4条重链:刖、肥、册、^，3条轻链:1^、1^2、1^3，因此， 重轻链合并可W获得12条抗体全长序列。4条重链:Hl、H2、H3、H4的氨基酸序列如SeqID No.8至Seq ID No. 11所示，3条轻链：L1、L2、L3的氨基酸序列如Seq ID No. 12至Seq ID No. 14所示。
[0094] Hl的序列为Seq ID No.8:
[00 巧]EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFSRNKASGYTTDYSASVKGR FTIS畑NSQSILYLQMNTLRAEDSATYFCARDKAYWGQGTLVTVSA
[0096] 肥的序列为Seq ID No.9:
[0097] EVMLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNFAMSWVRQTP 邸化 EWVATISTGGSNTYYPDSVKGRFT IS畑NARNTLYLQMSSLR沈DTAMYYCARLNYFGTNAYAU)YWGQGTSVTVSS
[009引册的序列为Seq ID No. 10:
[0099] EV化VESGGDLVKPGGSLKLSCVASGFSFSKSGMSWNRQTPD邸LEWVATISSGGSYTFYADSVKGRFT IS畑NAKNTLYLQMSSLK沈DTAMYYCARGDYWGQGTTLTVSS
[0100] H4的序列为Seq ID No. 11:
[0101 ] EVKLVESGGGLVQPGG 化化 SCATSGFTFPDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKANGYTTKYSASVKGR FTIS畑NSQNILFLQMNILRAEDSATYFCARDIGDYEGFPYWGQGTLVTVSA
[0102] Ll的序列为Seq ID No. 12:
[0103] DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSK化LHSNGITYLYWYLQKPGQSPQUJYQMSNLASGVPDRFSS SGSGTD巧LRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTK
[0104] L2的序列为Seq ID No. 13:
[0105] QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYMHWYQQKPGSSLKVWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTVSRVEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTK
[0106] L3的序列为Seq ID No. 14:
[0107] DVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQDIV服NGNTYLEWYLQKPGQSPR化IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPVTFGSGTK。
[010引实施例二
[0109] 本例采用抗原包被磁珠筛选抗原特异性B细胞，然后进行单细胞高通量测序、分 析，获得高特异性、高亲和力的单克隆抗体。详细如下：
[0110] -、样品制备
[0111] 1、分离外周血单核淋己细胞
[0112] 本例免疫样品的制备与实施例一相同，在此不累述。获得外周血后，在15mL离屯、管 中加入等体积的外周血、憐酸盐缓冲液和淋己细胞分离液，保持明显液面分界，室溫SOOg离 屯、30分钟，获得中间的淋己细胞层，再加入5mL憐酸盐缓冲液250g离屯、10分钟，分离得到外 周血单核细胞。
[0113] 2、制备抗原包被磁珠
[0114] 人原核表达CK18蛋白SOiig超滤至憐酸盐缓冲液中，加入0.5mL粒径为200nm，浓度 1 Omg/mL的簇基包被磁珠，37 °C反应化后取出磁珠。用清洗液清洗2次，加入封闭液37 °C反应 化获得抗原包被磁珠。
[0115] 清洗液组分：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、化抽P〇4 ? 12出0 2.9g、KH2P〇4 0.2g、Tween-20 0.5mL。加去离子水调整抑至7.4，定容至化。
[0116] 封闭液组分：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2册〇4 ? 12出0 2.9g、K出P〇4 0.2g、酪蛋白 20.0g、甘氨酸20.0g、甘露醇5.0g、TritonX-100 0.5mL、化化0.9g。加去离子水调整抑至 7.4，定容至化。
[0117] 3、分离抗原特异性B细胞
[011引将0.1血磁珠和SmL外周血单核细胞在4°C共同解育30min，之后放置在磁力架上吸 附2min，吸走上清。加入憐酸盐缓冲液吹打2-3次，重悬磁珠和细胞混合物;然后置于磁力架 上吸附2min，收获上清，即获得抗原特异性B细胞。二、单细胞建库测序
[0119] 获得抗原特异性B细胞后，后续的单细胞免疫组库制备与实施例一相同，在此不累 述。将所得到的测序文库在IlIumina HiSeq2000高通量测序平台上进行测序，过滤除去低 质量的数据，得到测序结果。将所有免疫样品中共有的重轻链序列合并，获得抗体对全长序 列，本例同样获得了4条重链和3条轻链，4条重链和3条轻链的具体序列与实施例一相同。
[0120] 实施例S
[0121] 本例直接对获取的免疫样品进行DNA提取和高通量测序分析，采用重轻链配对的 方法，获得抗体对全长序列;并结合质谱分析，最终筛选出高特异性、高亲和力的单克隆抗 体。具体如下：
[0122] -、获取免疫组织或者外周血
[0123] 使用已知抗原多肤CK18, Wlmg/次的量对小鼠进行免疫，每两周免疫一次，共进行 4次免疫。在每次免疫后分别获取小鼠外周血，并在最后一次免疫后处死小鼠获得小鼠脾脏 组织样品，并分别从所获取的组织样本和外周血提取RNA核酸样本，所得到核酸样本用于后 续实验。
[0124] 二、微量细胞RNA提取
[0125] 在15mL离屯、管中加入等体积的外周血、憐酸盐缓冲液和淋己细胞分离液，保持明 显液面分界，室溫SOOg离屯、30分钟，获得中间的淋己细胞层，再加入5mL憐酸盐缓冲液250g 离屯、10分钟，分离得到外周血单核细胞。然后按照W下步骤提取RNA:1、细胞计数后1-2X IO4个外周血单核细胞加入15化L Trizol，吹打混匀，室溫静置5min; 2、加3化LS氯甲烧至 Trizol匀浆液中，震荡20-30S直至混合物成乳浊液;3、4°C12000rpm离屯、15min，将75化上层 水相吸到新的PCR管中，加入化L5mg/mL糖原和75iiL预冷的异丙醇混匀，-20°C冰箱静置沉淀 SOmin; 4、4 °C 12000巧m离屯、15min，弃上清；5、加入 150 化预冷 80 % DEPC乙醇，4 °C 12000rpm 离 屯、15min;6、小屯、的吸取乙醇溶液，小屯、不要吸到沉淀。超净工作台放置、干燥15-30min，待 无乙醇残留时取出获得细胞总RNA。
[0126] S、反转录cDNA制备
[0127] 接W上步骤6,向在超净工作台放置、干燥15-30min后获得的细胞总RNA中直接加 入化L反应液，65°C反应5miru6化反应液包括aOOng/iiL N6随机引物化L、10mM dNTP 0.扣 UDEPC出0 4.化Ld65°C反应5min后，向其中加入4化反应液，42°C反应50min，70°C灭活 IOmin，获得反转录cDNA。或者，在加入反应液后，37 °C反应大于化，然后70 °C灭活IOmin^ 得反转录cDNA。其中，4化反应液包括：5X First-Stand Buffer化L、0.1 M二硫苏糖醇化L、 RNA酶抑制剂0.Superscript II逆转录酶0.
[01%]每组细胞加入96孔板中的1个孔进行后续试验。
[0129] 四、多细胞免疫组库文库制备
[0130] 本例的多细胞免疫组库文库制备可W采用RNA样本，也可W采用制备的反转录 cDNA样本进行。
[0131 ] 如果采用RNA样本，则对所得到的RNA样本进行5 ' -RACE，即5 端的快速扩增法，W 便扩增相应的抗体序列，其中，在扩增反应体系中，RNA的起始量为1-化g。
[0132] 1、混合下列样品，37 °C 1 Omin;冰浴Imin:
[0133] N6随机引物2.5pmoles(10-25ng)、RNAl-5i^g、补DEPC-水至15.5化。
[0134] 2、依次加入W下样品：
[013 引 IOXPCR buffer 缓冲液 2.扣L、25mM MgCb 2.化U IOmM dNTP mix 混合物 1 化、 0.1 M二硫苏糖醇2.
[0136] W上1和2两步成分总体积2化L。混匀后简单甩下来，42°C冰浴Imin。
[0137] 3、W上体系再加入化L反转录酶II，混匀，42°C溫浴SOmin反转录。
[0138] 4、按照W下方法进行末端加 C
[0139] 反转录完成后，向W上体系加入DEPC-水6.化L、SXXtailing buffer末端转移缓 液5.0化、2mM dCTP 2.S.N.A.P.-purified纯化样本10.0化，共计反应体积49.0化。
[0140] 5、94°(：溫浴2-3111111，冰浴1111111，加入1化末端转移酶了(11'，简单离屯、后37°(：溫浴 1 Omin。然后65 "ClOmin灭活TdT,置于冰上。
[0141] 6、PCR扩增富集目标区域：
[0142] 本例的PCR扩增引物与实施例一相同，采用了6条下游引物，上游引物由Race abriged anchor Primer(AAP)Invitorgen提供，并采用了一条错定引物。下游引物具体序 列如Seq ID No. 1至Seq ID No.6所示，错定引物如Seq ID No.7所示。
[0143] 具体PCR扩增反应体系和反应条件与实施例一相同。
[0144] 7、末端修复W及3 '末端加碱基"A"
[0145] 本例的末端修改和加碱基"A"与实施例一相同。
[0146] 8、连接接头
[0147] 本例的接头连接于实施例一相同。
[0148] 9、文库接头PCR扩增
[0149] W使用已经连接接头的DNA产物为模板，加入Hiseq通用PCR引物，DNA高保真 Phusion酶进行PCR扩增，通过对接头序列进行扩增得到更高浓度的测序文库DNA。扩增产物 用磁珠进行纯化后即可得到测序文库。
[01 加]将所得到的测序文库在IlluminaHiSeq2000、HiSeq2500、MiSeq、MiSeqDx、 NextSeq500、Hiseq X ten、Life SOLiDJon Torrent PGM、P;roton、Roche 454和单分子测 序等至少一种高通量测序平台上进行测序，从而得到测序结果。进行过滤除去低质量的数 据。
[0151] PCR扩增反应体系：DNA 12.5化、PlPrimer(IOyM)IiiUPrimer Index(IOiiM)I化、分 子级水 10.5]iL、2Xphusion master mix 25化。
[0152] PCR 反应条件:98 °C Imin;然后进行 30 个循环：98 °C 20s，65 °C 30s，72 °C 30s;循环结 束后，72°C5min;12°Chold。
[0153] 五、抗原亲和层析
[0154] 将外周血除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质，得到抗血清。将抗血清用憐酸盐缓冲 溶液W1:5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。W每分钟0.5mL速度将抗血清上到柱上， 为保证抗血清与填料结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用憐酸盐缓冲溶液清洗柱子 至M280nm<0.008后力化肥.7洗脱缓冲溶液，Wo. 5血/min的速度洗脱至所有蛋白均流下。用 已经加入100化中和缓冲溶液的1.5mL EP管分管收集洗脱液，混匀后用抑试纸检查洗脱液 pH，如pH低于7利用中和缓冲液调至约抑7.4 W防止抗体的变性。在柱中加入IOmL，pHl. 9洗 脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至AA280nm<0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质 的含量。若蛋白浓度低于〇.5mg/mL，则加入10%的甘油W便保存，将纯化的抗体分装后在2 °C~8°C保存。用含0.05%叠氮化钢的0.OlM憐酸盐缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2-8 °C环境。将抗体装入透析袋中，做好记录，用0.OlM憐酸盐缓冲溶液透析4°C过夜或室溫6小 时换一次透析液再透析一次。将透析好的抗体用Mi IliporeAmicoir孩叫tra超滤离屯、管浓 缩。
[0155] 中和缓冲溶液：121.2g Tris(lM)、87.8g 化Cl(1.5M)、0.37g 抓TA(ImM)及5g叠氮 化钢(0.5 % )溶于1L蒸馈水中，并用肥1调节抑8.0。
[0156] 洗脱缓冲溶液(P肥.7):3.75g甘氨酸(50mM)溶于IL蒸馈水，肥1调抑2.7。
[0157] 六、亲和力抗体质谱分析
[015引 1、酶切
[0159]将富集获得的特异性抗体分成若干份，每份分别采用不同的蛋白酶进行酶切，得 到酶解肤段。然后，将所得到的酶解肤段进行质谱分析，得到质谱检测结果。其中，特异性抗 体分成若干份，其具体的份数与试验中所采用的蛋白酶的数量相同；蛋白酶可W采用常规 使用的胃蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、膜蛋白酶、胞内蛋白酶Ly S-C、金属内肤酶Ly S-N、 蛋白内切酶GlU-C、天冬氨酸肤链内切酶Asp-N、梭菌蛋白酶Arg-C等。本例具体的将特异性 单克隆抗体分成九份，分别采用了胃蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、膜蛋白酶、胞内蛋白酶 Lys-C、金属内肤酶Lys-N、蛋白内切酶Glu-C、天冬氨酸肤链内切酶Asp-N、梭菌蛋白酶Arg-C 对其进行酶切。W膜蛋白酶为例，每种样品精确取出IOyg蛋白，按照蛋白：酶= 20:1的比例 加入膜蛋白酶，37 °C酶解4h，按照蛋白：酶=20:1的比例再次加入膜蛋白酶继续酶解化，完 成酶解反应。
[0160] 2、分离
[0161] 采用岛津LC-20AB液相系统、分离柱为4.6x250mm型号叫化emexSCX柱对样品进行 液相分离。肤段采用4mL Buffer A(25mM化此P〇4in 25%ACN抑2.7)复溶，进柱后111117111111 速度进行梯度洗脱，先在5%Buffer B(20mM化此P04，1M KCl in 25%ACN pH2.7)中洗脱 7min，紧跟着一个20min的直线梯度使buffer B由5%上升至60%，最后在2min内使buffer B的比例上升至100%并保持Imin，然后恢复到5%平衡lOmin。整个洗脱过程在214皿吸光度 下进行监测，经过筛选得到所需组分，洗提后的肤段混合为所需数目，一般是6个，S化ata X ClScolumn除去盐份，冷冻抽干。
[0162] 3、质谱上机
[0163] 将抽干的每个组分分别用buffer A(5%ACN，0.1 %FA)复溶至约0.扣g/化的浓度， 20000g离屯、IOmin，除去不溶物质。每个组分上样扣L(约2.扣g蛋白），通过岛津公司LC-20AD 型号的纳升液相色谱仪进行分离。所用的柱子柱包括化ap柱和分析柱两部分。分离程序如 下：先W祉L/min的流速在4min内将样品loading到化ap柱上，紧接着一个总流速为30化L/ min的分析梯度将样品带入分析柱，分离并传输至质谱系统。先在5 % buffer B下洗脱5min， 跟着一个35min的线性梯度使buffer B的比例由5%上升至35%，在接下来的5min内提高到 60 %，然后在2min内buffer B增加到80 %并保持2min，最后在Imin内恢复至5 %并在此条件 下平衡lOmin。使用的机器为TripleTOF 5600(AB SCIEX，Concord，0N)，离子源为 化no spray III source (AB SCIEX , Concord , ON)，放射器为石英材料拉制的喷针（New Objectives,Woburn,MA)。数据采集时，机器的参数设置如下：离子源喷雾电压2.化V，氮气 压力为3〇931(14.5931>化日'），喷雾气压15931，喷雾接口处溫度150摄氏度;扫描模式为反 射模式，分辨率>30,000;在一级质谱中积累IOOrns并且只扫描电荷为化~5+的离子;挑选 其中强度超过150邱S的前40个进行扫描，2.8s为一个循环;第二个四极杆(Q2)的传输窗口 设置为80及210处效率各为50%;脉冲射频电的频率为IlkHz;检测器的检测频率为40G化； 每次扫描的粒子信号W四个通道分别记录共四次后合并转化成数据;母离子动态排除设置 为:在一半的出峰时间内，约15s，相同母离子的碎裂不超过2次。
[0164] 4、质谱数据分析
[0165] (1)数据库构建
[0166] 向酶切质谱获得的数据中渗入常见污染蛋白序列，渗入的常见污染蛋白主要是作 为阴性结果排除错误鉴定，得到最终数据库。运里所使用的污染蛋白序列包括实验对象物 种的保守区域序列和作为干扰的来自其他物种的蛋白序列。
[0167] (2)数据库鉴定
[0168] 通过软件Mascot对质谱结果进行鉴定，并用Mascot化rcolator对鉴定结果进行 过滤。软件Mascot来自于ht1:p: //www.matrixscience. com/，软件Mascot F^ercolator来自 ^： http://WWW.sanger.ac.uk/resources/software/mascotpercolator/ 「niAOl
LUI /u」 ^片民阳巧华粒制卿盜疋职段师趣
[0171] 利用化rget-Decoy方法对上述步骤得到的鉴定结果的假阳性率进行评估，保留低 假阳性率鉴定结果作为后续分析基础，本例设假阳性率过滤阔值为1%。
[0172] 将高通量测序获得的数据经过数据分析后的结果作为数据库，W每条抗体序列为 索引，包括分别获得的重链轻链氨基酸序列、DNA序列、抗体可变区和恒定区结构信息，互补 决定区（缩写CDR3)频率、CDR3长度、CDR3突变率、V-J基因配对情况、V-D-J基因插入长度、V- J基因碱基组成等相关信息，将质谱获得的数据在数据库中作为条件进行筛选获得相应候 选抗体序列，将运些候选抗体序列通过相应的指标再次进行筛选获得候选表达抗体序列， 如图4所示。
[0173] 运些指标包括但不限于:互补决定区（缩写CDR3)频率、CDR3长度、CDR3突变率、V-J 基因配对情况、V-D-J基因插入长度、V-J基因碱基组成、抗体质谱数据覆盖率、抗体CDR3质 谱数据覆盖度、抗体序列亚型、质谱蛋白信号强度。
[0174] 肤段鉴定情况如图5和表1所示。
[0175] 表1抗体序列统计情况
体序列、序列3为重链、序列4为重链C化3_coverage〉50%、序列5为重链C化3_coverage== 100%、序列6为轻链、序列7为轻链Cdr3_coverage〉50%、序列8为轻链Cdr3_coverage== 100%。
[0178]表1的结果可见，本例最终获得含有至少一条肤的抗体序列195735条，含有至少一 条独有肤的抗体序列734条，重链355条，C化3覆盖度大于50 %的重链86条，C化3覆盖度大于 100%的重链31条，轻链379条，C化3覆盖度大于50%的轻链103条，C化3覆盖度大于100%的 轻链59条。
[01巧]抗体序列示例:抗体为重链H1、H2、H3、H4;抗体轻链:L1、L2、L3;其中，H1为Seq ID No.8所示序列，H2为Seq ID No.9所示序列，H3为Seq ID No. 10所示序列，H4为Seq ID No. 11所示序列，Ll为Seq ID No. 12所示序列，L2为Seq ID No. 13所示序列，L3为Seq ID No. 14所示序列。
[0180]重链轻链各1条相互组合共表达获得具有完整功能的抗体免疫球蛋白。
[0181 ] 4.覆盖度，丰度统计与相关性分析
[0182]合并多种酶解的数据，根据抗体和鉴定肤段的对应关系，统计抗体序列的肤段鉴 定数，抗体可变区覆盖度，CDR3区域覆盖度等信息，并计算对应抗体序列的定量值。其中，覆 盖度是指所有鉴定肤段覆盖的长度占总长度的比例;肤段鉴定数目是指所有高于假阳性率 过滤阔值的鉴定肤段数目。
[0183] 实施例四
[0184] 合成最终筛选出来的高亲和力、高特异性的单克隆抗体的DNA，通过蛋白表达系统 表达单克隆抗体，并对表达的单克隆抗体进行纯化和鉴定。本例具体合成了 W上筛选出来 的4条重链H1、H2、H3、H4和3条轻链:L1、L2、L3两两组合表达的单克隆抗体，共计12条，即 LlHl组合、L2H1组合、L3H1组合、L1H2组合、L2肥组合、L3H2组合、L1H3组合、L2册组合、L3H3 组合、L1H4组合、L2H4组合、L3H4组合。本例合成了 12条单克隆抗体的核巧酸序列，采用真核 表达序列进行蛋白表达提纯，获得高纯度单克隆抗体。
[0185] Lmi组合:重链为Seq ID No.8所示序列，轻链为Seq ID No. 12所示序列。
[01化]L2化组合:重链为Seq ID No.8所示序列，轻链为Seq ID No. 13所示序列。
[0187] L3化组合:重链为Seq ID No.8所示序列，轻链为Seq ID No. 14所示序列。
[0188] Ll肥组合:重链为Seq ID No.9所示序列，轻链为Seq ID No. 12所示序列。
[0189] L2肥组合:重链为Seq ID No.9所示序列，轻链为Seq ID No. 13所示序列。
[0190] L3肥组合:重链为Seq ID No.9所示序列，轻链为Seq ID No. 14所示序列。
[0191] Lm3组合:重链为Seq ID No. 10所示序列，轻链为Seq ID No. 12所示序列
[0192] L2册组合:重链为Seq ID No. 10所示序列，轻链为Seq ID No. 13所示序列。
[0193] L3册组合:重链为Seq ID No. 10所示序列，轻链为Seq ID No. 14所示序列。
[0194] L1H4组合:重链为Seq ID No. 11所示序列，轻链为Seq ID No. 12所示序列。
[0195] L2H4组合:重链为Seq ID No. 11所示序列，轻链为Seq ID No. 13所示序列。
[0196] L3H4组合:重链为Seq ID No. 11所示序列，轻链为Seq ID No. 14所示序列。
[0197] -、构建表达载体 [019引 1.酶切
[0199] 分别对载体和合成的单克隆抗体基因进行酶切，使之获得粘性末端，并采用琼脂 糖凝胶DNA回收试剂盒，回收酶切后的载体和单克隆抗体基因。本例具体合成的单克隆抗体 基因为：
[0200] 具体的酶切体系和条件如下：
[0201] 20化质粒P即沈DNA或者单克隆抗体基因，化L EcoRV外切酶，1化化el外切酶，5y L 10 X K缓冲液，2化L dd出0,37 °C恒溫化。
[020^ 2.连接、转化
[0203] (1)连接：
[0204] 1化载体，化L目的片段，1化T4连接酶，5化2乂缓冲液，混匀，室溫反应3〇111111^ 上。
[0205] (2)转化
[0206] 1)取出零下80°C保存的化21感受态细胞，放在冰上缓慢解冻。
[0207] 2)将感受态细胞加入化L连接产物中或质粒DNA中混匀，冰上放置30min。
[020引 3) 42 °C热激90s，然后继续冰浴。
[0209] 4)冰浴2min后，加入80化L无抗性的LB培养基。
[0210] 5)37°(：培养45111111。
[0211] 6)500化pm离屯、3min，弃大部分上清，留约100-15化L，重悬菌体，博来霉素抗性的 LB平板，涂板。
[0212] 7)惊干，于37°C培养箱中倒置培养过夜。
[0213] 3.扩增质粒和转染
[0214] (1)从转化的平板挑单克隆到1.5mL的LB液体培养基中，于37°C，200巧m下培养至 OD = O.6-0.8〇
[0215] (2)收集菌液使用质粒回收试剂盒回收质粒。
[0216] (3)转染前，3~4*l〇VmL细胞密度将293T接种到6孔培养板上。接种密度是3~4* 10己/血
[0217] (4)溶液1:240化无血清培养基+10化Iipofectamine 2000每孔总体积250化，溫 育5min;溶液2:10化无血清培养基+4iig质粒每孔总体积将溶液1与溶液2混合，室溫 下置20min。
[0218] (5)将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗293T细胞两遍后，加入2mL无血清培养 基。
[0219] (6)将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37°C ,5% 的C02中保溫5~6小时。
[0220] (7)6小时后，更换含有血清的全培养基，在37°C，5%的C02中48~72h检测转染水 平。
[0221] (8)换全培养基培养后2地，加药物进行筛选。
[0222] (9)7化后收获细胞进行蛋白收集纯化。
[0223] 4.蛋白样品收集及亲和层析柱纯化
[0224] (1)收集的细胞加入裂解液，冰上放置15min，高速离屯、获得全蛋白样品。
[0225] (2)样品按1 .OmL/min的流速上样至层析柱中，收集流出液。
[0226] (3)收集流传穿出的血清，再次加入纯化管，样品经过=次流穿。
[0227] (4)用30mL的平衡缓冲液洗涂树脂，流速维持约2.OmL/min,或洗至流出液的A280 吸光度达到稳定。
[0228] (5)用15mL洗脱缓冲液洗脱抗体，流速维持ImL/min，收集含有目的免疫球蛋白的 洗脱液，并立刻加入1/10洗脱液体积的中和缓冲液，调节抑至7.0。
[0229] (6)憐酸盐缓冲液溶液透析过夜，获得浓缩蛋白质。即真核表达的高纯度的单克隆 抗体。
[0230] 5. SDS-PAG 电泳检测
[0231] 将获得的蛋白样品加入等体积的2 X加样缓冲液，100°C解育5min，SDS-PAGE胶电 泳。样品在浓缩胶中时，80V电压电泳25min，接着使用120V电压继续电泳，直到指示剂到达 分离胶底部时停止电泳。SDS-PAGE结束后使用马考斯亮蓝对凝胶进行染色。本例分别进行 了还原性SDS-PAGE胶电泳和非还原性SDS-PAGE胶电泳。
[0232] SDS电泳结果如图6和图7所示，图6为还原性SDS-PAGE胶电泳的结果，图7为非还原 性SDS-PAGE胶电泳的结果，两个图中由左至右的电泳通道依序为marker、L1H1、L2化、L3H1、 L1H2、L2肥、L3肥、Lm3、L2册、L3册、1^拟、111曰浊6'、1^2拟、13拟。图6的还原性505斗466胶电泳 结果显示，重链轻链都得到正确表达，比例基本合适;而图7的非还原性SDS-PAGE胶电泳结 果显示，重链轻链能够正确配对，完整性良好。
[0233] 二、抗体鉴定
[0234] 抗体鉴定采用化ISA方法，实验步骤如下：
[0235] 将步骤"3.扩增质粒和转染"中，换全培养基培养24h，加药物进行筛选培养72h后 的菌液，即小量表达蛋白，进行超声处理，具体的，50mL离屯、管中400W工作5s、间隔5s，重复 60次。12000巧m离屯、IOmin，吸上清到新EP管中，作为抗体使用。
[0236] 1.包被:偶联抗原多肤包被浓度lOiig/mL，每孔10化L，4°C包被过夜，每个样品两个 重复。
[0237] 2.封闭：包被完的板子，用洗板机洗板3次，于吸水纸上拍干，然后用1%牛血清白 蛋白封闭，200化/孔，4°C封闭过夜或37 °C封闭化。
[0238] 3.加一抗:封闭完的板子，用洗板机洗板3次，于吸水纸上拍干，根据不同实验，取 好相应板子，加入相应一抗，本例的一抗为纯化抗体，37 °C解育化。
[0239] 4.洗板:用洗板机洗板5次W上，于吸水纸上拍干。
[0240] 5.加二抗:小量表达蛋白上清的孔加山羊抗小鼠-偶联HRPQ :2000)作为二抗，其 余孔加憐酸盐缓冲液，37°C解育化。
[0241] 6.洗板:用洗板机洗板5次W上，于吸水纸上拍干。洗板同时，配制好显色液TMB。
[0242] 7 .显色：准备好终止液后，加入显色液10化L/孔，可W晃动板子加速显色过程。显 色到一定程度时，一般不能让空白和阴性显色太高，加入50化/孔终止液，加入终止液后静 置IOminW上，使终止彻底、颜色均一。
[0243] 8.读数:使用酶标仪，对终止后的板子进行读数，其中，酶标仪必须预热30minW 上;TMB显色检测波长为:450nm。
[0244] 在1:10的稀释条件下，阳性结果与阴性对照之间的OD值的比值达到1.5或W上，本 例中为憐酸盐缓冲液对照:〇. 117X1.5 = 0.175,即大于0.175即为阳性，认为相应单克隆抗 体有活性，结果如表2和表3所示。其中表2中anti-CK18为阳性对照；表3中Anti-PCT、Anti- STRBPII、化gative ser皿of mice为阴性对照，憐酸盐缓冲液为空白对照。
[0245] 表沈LISA测试结果
[0246]
[024引表3ELISA测试结果 [09491
[02加]表2为样品分别稀释为0. lmg/mL、0.05mg/mL和0.025mg/mL后的化ISA测试结果统 计表，450nm处的OD值，目前还不能通过信息分析筛选来指示抗体亲和力信息。表帥显示了 两个重复样品的统计结果。经表达后对照验证：1、抗体稀释至0.1 mg/ml，阳性率达91.97% ; 2、抗体稀释至0.05111邑/1111，阳性率达％达75%;3、抗体稀释至0.025111邑/1111，阳性率达50%。 Qit-Off=Mean of Negatives+(3x SD of 化gatives)计算得到Qit-Off = O.843。
[0巧1] 表3中Anti-PCT为鼠抗人降巧素原单克隆抗体，Anti-STRBPII为鼠抗链霉素标签 单克隆抗体，Negative serum of mice为小鼠未进行免疫的阴性血清;运S种样品均做为 阴性样品进行化ISA实验，其中链霉素标签的抗原决定区与CK18,即细胞角蛋白-18,有一定 相似性，因此OD值较高。
[0252] 结果表明，通过高通量鉴定和质谱测序鉴定的抗体序列经过表达合成的重组抗体 能够产生相应的活性。
[0253] W上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申 请的具体实施只局限于运些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本申请构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护 范围。
【主权项】
1. 一种高纯度单克隆抗体的制备方法，其特征在于:包括提取外周血和/或组织细胞的 免疫样品；采用高通量测序技术从免疫样品中获得初步的抗体核苷酸信息，将所有免疫样 品中共有的重轻链序列合并，获得抗体对全长序列;合成所筛选出来的单克隆抗体的核苷 酸序列，采用真核表达系统对合成的核苷酸序列进行蛋白表达，提纯所表达的蛋白，即获得 所述高纯度单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:还包括，将所述抗体对全长序列翻译 为抗体氨基酸序列，从抗体氨基酸序列中筛选出互补决定区，并对其进行表达量和突变频 率分析，筛选出高亲和力、高特异性的单克隆抗体。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述采用高通量测序技术从免疫样品 中获得初步的抗体核苷酸信息，具体包括，分别提取外周血和/或组织细胞免疫样品的RNA， 对RNA进行反转录，获得cDNA文库，采用高通量测序技术对cDNA进行测序，即获得初步的抗 体核苷酸信息。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述采用高通量测序技术从免疫样品 中获得初步的抗体核苷酸信息，具体包括，从提取的免疫样品中分离单核细胞，并采用荧光 标记的抗原，对单核细胞进行染色;然后通过流式细胞仪分选与抗原结合的单核细胞，即得 到抗原特异性B细胞;最后对抗原特异性B细胞进行单细胞建库测序，获得初步的抗体核苷 酸信息。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述采用高通量测序技术从免疫样品 中获得初步的抗体核苷酸信息，具体包括，从提取的免疫样品中分离单核细胞，采用抗原包 被的磁珠分离与抗原结合的单核细胞，即得到抗原特异性B细胞;最后对抗原特异性B细胞 进行单细胞建库测序，获得初步的抗体核苷酸信息。6. 根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于:还包括采用抗原亲和层析方 法，从提取的外周血免疫样品中富集特异性的抗体;然后采用质谱分析;将质谱分析的数据 作为筛选条件，对基于高通量测序获得的抗体序列进行筛选，获得高亲和力、高特异性的单 克隆抗体。7. 根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于:所述提纯所表达的蛋白，具 体包括，采用偶联纯化柱分离纯化，获得高纯度的单克隆抗体。8. 根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于:还包括采用ELISA对获得的 高纯度单克隆抗体进行鉴定。9. 一种采用权利要求1-8任一项所述的制备方法所制备的单克隆抗体。10. -种制备单克隆抗体的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒采用了权利要求1-8任一 项所述制备方法或者所述试剂盒中含有权利要求9所述单克隆抗体。
【文档编号】C12N15/79GK105925599SQ201610255098
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】杨乃波, 刘晓, 聂超, 李新洋, 张曦, 刘楚新, 曹丽霞, 周羽, 黄谧
【申请人】深圳华大基因研究院