一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法
【专利摘要】本发明公布了一种利用CRISPR?Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，该方法通过对多物种进行同源对比选取两对ALK6基因靶序列，利用gRNA的PAM设计原则，合成两对靶序列不同，表达的蛋白相同，带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链，将双链与pPDNA330质粒进行连接得到携带有多物种的ALK6同源基因的重组载体，重组载体利用荧光蛋白表达法对基因敲除效率进行检测，选择敲除效率更高的载体转染多物种受体细胞，进行基因敲除并验证，完成对多物种ALK6基因进行简单、高效、精确的基因敲除。
【专利说明】-种利用CR I SPR-Cas9卽向敲除ALK6基因的方法 【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，特别设及一种利用CRISPR-Cas9祀向敲除ALK6基因 的方法。 【【背景技术】】
[0002] ALK6是骨形态发生蛋白受体lB(bone morphogenetic protein receptor 1B, BMPR-IB)的别称，是是转化生长因子-0(transforming growth factor-P)超家族一型受 体，其通过传递骨形态发生蛋白2(bone mor地Ogenetic protein 2,BMP2)、骨形态发生蛋 白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、骨形态发生蛋白6(bone morphogenetic protein 6,BMP6)和骨形态发生蛋白 15(bone mor地Ogenetic protein 15,BMP15)等配体 信号，在哺乳动物生殖过程中发挥非常重要的作用，自然情况下，布鲁拉美利奴等绵羊品种 ALK6基因编码区第109位碱基A突变为G，突变个体的排卵率及多胎率显著高于野生型个体。
[0003] 第一个被发现携带增加排卵率的主效基因即ALK6的羊是Booroola羊，ALK6位于绵 羊高繁殖力FecB基因所在的6号染色体区域与其相对应人4号染色体q22-q23区域中，与 Booroola羊的排卵率密切相关。ALK6基因编码区A746G碱基突变，导致了谷氨酷胺被精氨酸 替换(Q249R)，导致绵羊排卵率与产黑数发生了变化，证明了对该基因进行突变可W使羊的 排卵率增多，从而增加产黑羊数量，ALK6基因具有影响卵泡颗粒细胞分化和卵泡发育、促进 排卵数增加的作用。水牛是单胎动物，其排卵率低，发情不明显，繁殖力相对低于黄牛，自然 情况下极少出现能繁多胎的母本，如果能将动物的ALK6基因进行改变则会大大提高动物的 繁殖能力。
[0004] 改变基因构造通常是进行基因突变，即将DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改 变而引起的基因结构改变，而基因突变往往是不定向的，随机的，未知的。为提高改变基因 结构的效率，在现今的分子生物学领域中，通常是从特定生物体中提取ALK6基因，再根据基 因组的编码顺序来编码进行同源性替代祀基因使上述的ALK6基因被取代或破坏而失活，达 到祀向敲除基因的目的，祀向敲除精确度高、容易进行形状分析筛选，大大提高了工作效 率。然而该方法仅能对单一物种的某一基因进行基因敲除，不能适用于多物种。
[0005] 基因编辑常用ZF化和TALEN技术，然而运两种技术如果要实现定向编辑，则必须合 成DNA序列特异性结合蛋白模块，即DNA剪切的实现有赖于化kl核酸酶结构域。运一要求大 大限制了运两种技术的发展，而CRISPR/cas9技术则通过曲NA引导核酸内切酶实现DNA特异 位点的编辑，突破了ZFNs和TALEN技术的发展限制，是更为高效的基因特异位点的编辑技 术。
[0006] 目前，有些研究开始使用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除实验，例如PCT专利CN 105142669A公开了基于CRISPR的基因组修饰和调控，说明了 CRISPR系统可用于基因组的修 饰和调控，用CRISPR系统比ZFN和TALEN更简单、高效的优点，但该专利未公布针对ALK6基因 敲除的特定酶切位点和碱基序列，未公布针对ALK6基因的优选片段进行检测、选择的方法， 而且也未公布本发明针对ALK6基因敲除所用的重组质粒载体的构建。使用CRISPR/Cas9系 统由于其可多位点对基因进行修饰。因此，本发明需要解决W下几个问题：（1)构建能祀向 敲除多物种的ALK6基因编辑方法；（2)现有技术在基因编辑过程特别是人和水牛基因组编 辑的技术平台存在效率低，适用性低的特点，整个平台仍需进行优化和条件摸索；（3)现有 技术没有一种能快速、精确的找到祀序列的检测方法，从而进一步提高基因编辑的成功率。 【
【发明内容】
】
[0007] 鉴于上述内容，有必要提供一种简单、高效、准确、适用于多物种特别是针对人和 水牛的ALK6基因敲除方法，并进一步提高对祀序列的检测效率，能快速、精确的找到祀序 列，提局基因编辑的成功率。
[0008] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 一种利用CRISPR-化s9祀向敲除ALK6基因的方法，所述方法包括如下步骤：
[0010] (1)构建 PPDNA330-ALK6-1 和 PPDNA330-ALK6-2 载体，构建方法如下：
[0011] A、从基因数据库中下载多物种ALK6基因的核巧酸序列，并进行同源比对选取两对 祀序列，分别为ALK6祀序列 1 : 5 ' -ATGATAGAAGAAGATGACTC-3 ' 和ALK6祀序列2 : 5 ' - GGATCAGGCCTCCCTCTGC-3'；
[0012] B.根据同源对比结果和排NA的PAM设计原则，合成两对与祀序列不同，表达的蛋白 相同，带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链，分别命名为:ALK6-1和ALK6-2;
[0013] C.用BsmBI酶切PPDNA330质粒，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收；
[0014] D.用连接酶将ALK6-1和ALK6-2分别与BsmBI酶切后的PPDNA330质粒进行连接，得 到重组质粒载体，分别命名为:pPDNA330-ALK6-l和PPDNA330-ALK6-2;
[0015] (2)对重组质粒载体PPDNA330-ALK6-1和PPDNA330-ALK6-2进行敲除效率的筛选验 证、对比，选择ALK6基因敲除效率更高的重组质粒载体转染受体细胞；
[0016] (3)转染不同物种的受体细胞，收集转染之后的受体细胞，并提取细胞基因组进行 测序，根据基因组测序结果合成检测引物进行PCR扩增，扩增产物连接入祀ASY-Tl载体，挑 取单克隆细菌，进行测序，对ALK6基因敲除表达结果进行检测。
[0017]进一步的，所述ALK6-1 的上游序列为，5'-ACCGATGATAGAAGAAGATGACTC-3'，下游序 ^lJ^,5'-AAACGAGTCATCTTCTTCTATCAT-3'；ALK6-2 6^±|5?j1?^!j5'- ACCGGGATCAGGCCTCCCTCTGC-3'，下游序列为，5' -AAACACAGAGGGAGGCCTGATCC-3'。
[001引进一步的，所述PPDNA330质粒构建方法如下：
[0019] (1)优化puro基因，去除其编码区内的酶切位点，但不改变其氨基酸组成：应用 StuI和ClaI酶切puc57-pu;ro，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收获得puro基因；
[0020] (2)应用StuI和bsp 1191酶切PCDNA3.1，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，回 收获得线性化的PCDNA3.1片段；
[0021] (3)用T4连接酶将puro基因和PCDNA3.1片段进行连接得到pPDNA载体；
[0022] (4)人工合成U6-BsmbI-gRNA序列，片段位于PUC57载体中；
[0023] (5)用MluI和NheI酶切puc57-U6-BsmbI-gRNA，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 切胶，回收获得US-Bsmb I-gRNA片段；
[0024] (6)用Mlu巧日化el酶切pPDNA载体，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收获 得线性化的pPDNA载体片段；
[00巧](7)T4连接上述U6-BsmbI-gRNA片段和pPDNA载体片段，得到pPDNA-gRNA载体；
[0026] (8)用XbaI和NotI酶切PX330载体，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收获 得cas9片段；
[0027] (9)用XbaI和NotI酶切pPDNA-gRNA载体，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶， 回收获得线性化的pPDNA-gRNA载体片段；
[002引 （10)T4连接上述cas9片段和线性化的pPDNA-gRNA载体片段得到PPDNA330载体。
[00巧]进一步的，所述MluI和NheI酶的反应溫度为35-40°C，时间为2.5-3.化，酶切体系 为：2-4]ig的卵uc57-pu;ro质粒，3-6化的 10 XhstDigest，2.5-4化的StuI，3化的ClaI加水至 溶液为45-5扣1^;XbaI和NotI酶的反应溫度为35-40°C，时间为2.5-3.化，酶切体系为:2-化邑 的阳330质粒，3-6化的10 X化StDigest，2.5-钮山L XbaI，2.5-4化化NotI加水至溶液为 45-55化。
[0030] 进一步的，所述BsmBI酶切体系反应溫度为50-60°C，时间为2.5-3.化，酶切体系 为：2.5-3.5iig的PPDNA330质粒，1.5-2.5化的 10 X 肥B Buf f er3，0.2-0.祉L的BsmBI，加水至 溶液为15-2^iL。
[0031] 进一步的，所述重组质粒载体PPDNA330-ALK6-巧日PPDNA330-ALK6-2敲除效率的筛 选验证选用巧光蛋白表达法进行验证，具体方法如下：
[0032] (1)利用RGS-CR做为验证报告载体:使用限制性内切酶EcoR巧日BamHI对验证报告 载体RGS-CR进行线性化；
[0033] (2)合成与ALK6祀序列巧日ALK6祀序列2对应的两条带有EcoRI和BamHI粘性末端的 DNA双链，分别命名为：#ALK6-^P#ALK6-2;
[0034] 其中，#ALK6-1 引物的上游序列为：5'-AATTCGATGATAGAAGAAGATGACTCTGGG-3'，
[0035] 下游序列为：5'-6410：0：46461'〔41'(：1'1'(：1'1'口'41'〔41'〔6-3'；
[0036] #ALK6-2引物的上游序列为：5' -AATTCGCGGATCAGGCCTCCCTCTGCTGGG-3'，
[0037] 下游序列为：5' -GATCCCCAGCAGAGGGAGGCCTGATCCGCG-3' ；
[003引 （3)采用T4连接酶将步骤（1)的RGS-CR线性化产物和步骤(2)带有EcoR巧邮amHI粘 性末端的#40(6-1和#40(6-2两对DNA双链进行连接得到重组质粒载体，分别命名为:RGS-# ALK6-1和RGS-#ALK6-2;
[0039] (4)取传代的HEK-293T细胞于4个培养皿中；
[0040] (5)取4个离屯、管编号为1、2、3、4,每个管分别加入含FBS的DMEM;
[0041 ] (6)然后在 1 号管加 PPDNA330-ALK6-1 和 RGS-#ALK6-1，2 号管加 PPDNA330 和 RGS-# ALK6-1，3 号管加 PPDNA330-ALK6-2 和 RGS-#ALK6-2，4 号管加 PPDNA330 和 RGS-#ALK6-2;最后 在每个管中加入罗氏转染试剂，混匀，室溫静置后，将混合液分别加入培养皿，并于培养箱 中培养，培养完成后在巧光显微镜下观察目的基因的巧光表达情况。
[0042] 进一步的，所述限制性内切酶EcoRI和BamHI的酶切体系反应溫度为35-40°C，时间 为2.5-3.5h，酶切体系为：1.5-2.5iig的RGS质粒，1.5-2.5化的 10 X 肥B Buffer3，0.2-0.祉L 的EcoRI，0.2-0.祉L BamHI加水至溶液为 15-2^iL。
[0043] 进一步的，所述受体细胞选用人的化Ia细胞或水牛的成纤维细胞。
[0044] 进一步的，所述的人化Ia细胞和水牛的成纤维细胞的培养条件为:用含FBS的DMEM 的培养基在电转前24小时对人的Hela细胞和水牛的成纤维细胞进行培养，培养条件为35- 40°C，4%-6% 的 C〇2。
[0045] 进一步的，所述检测引物选用人或水牛的ALK6-2基因上下游序列做为检测引物， 人ALK6-2基因检测引物命名为:hALK6，hALK6上游序列为5 ' -TTTACTTGGGAAACCATAACTA-3 '， 下游序列为5 ' -TGGATTGTAACCATACACCTAC-3 '，扩增长度为517bp;水牛的ALK6-2基因检测引 物命名为：bufALK6，bufALK6上游序列为5'-GCATTGGGTTAGAACAGGAT-3'，下游序列为5'- CCTTTGTCCACTGCCCTA-3'，扩增长度为 19化P。
[0046] 进一步的，所述PCR体系为：10化2 XPrimeSTAR?HS(Premix) (Takara),DNA模板化 L，上下游引物各0.5化，水补至20化。反应程序为：95°C预变性Smin，35循环（95 °C变性 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec)，72°C再延伸7min，4°C终止反应。取上述PCR反应的 化L PCR产物，直接进行2 %的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，时间约30min。
[0047] 上述的应用CRISPR-Cas9祀向敲除ALK6基因的方法可用于人或水牛的ALK6基因敲 除。
[004引本发明具有W下有益效果：
[0049] 1、本技术方案发明人通过对多物种的AKL6基因进行分析，进行同源比对，选择同 源性最局的两对基因序列做为勒!序列，进行对ALK6基因的献除，有效的提局了勒!序列的普 适性，使利用该祀序列进行编辑的重组质粒载体能适用于多物种。虽然本发明对多物种的 ALK6基因进行同源对比选择同源性高的祀序列，然而并不是每一个选择的祀序列都能正确 表达，还需要进行表达验证，而且，不同物种的基因组序列是不一样的，如果仅仅利用同源 对比选择祀序列而选用其它编辑技术，例如:ZF化和TALEN编辑技术，由于运两种技术必须 合成DNA序列特异性结合蛋白模块，在进行DNA剪切的时候将会受到化kl核酸酶结构域的限 审IJ，编辑效率大大降低，如果找出的同源比对的ALK6基因上下游没有化kl核酸酶结构域则 不能完成基因的剪切，不能进行基因编辑，同样的，要精确找到有表达效果的祀序列，其检 测手段是必不可少的，检测手段必须要简单、高效、准确，才能提高祀序列的准确性。
[(K)加]2、本技术方案选用的CRISPR/Cas9系统，CRISPR-化s9里面需要两个组件，一个是 gRNA，另外一个是内切酶也就是Cas9. gRNA包括crRNA和tracrRNA，gRNA结合crRNA的祀标特 异性及化acrRNA的脚手架特性(如何翻译scffold)成单一转录子。当gRNA和cas9在细胞内 表达时，基因组的祀标会被修饰或永久性的干扰。使用化s9核酸内切酶只需要提供一个包 含特异的20bp的小片段S排NA(single guide RNA)来决定祀向特异性。SgRNA是由crRNA (CRISPR RNA)与tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)嵌合构成的一个约 100个核巧 酸大小的RNA。crRNA能够与祀向的DNA形成RNA-DNA复合物，运段祀向DNA序列叫做前间隔序 列。crRNA与trancrRNA-起构成的SgRNA与化s9相互作用形成核糖核蛋白。SgRNA的5'端的 约20bp (对应的是crRNA)通过RNA-DNA互补配对指引化s9与祀序列结合进而对祀位点进行 切割，造成DNA双链断裂(doub 1 e S化and break，DSB)。在细胞中，核酸酶造成的DSB在没有 修复模板的情况下，W非同源末端连接(nonhomologous日11(1-扣;[]1；[雌，畑6]")的方式进行修 复。NHEJ能够引起随机长度的碱基插入或缺失，可W破坏编码基因的翻译阅读框架，因此， 本发明使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑不受限制性内切酶的限制，能更简单、高效、多 位点的对基因进行修饰，实现了仅构建一个表达载体就能对多物种的同一祀序列进行基因 编辑的效果，同时方法简单、高效。
[0051] 3、本技术方案用验证报告载体RGS-CR对两对祀基因的敲除效率进行检验，采用巧 光蛋白和目的基因连接，当目的基因被同源替代祀向敲除时，能启动巧光蛋白表达，在绿光 下成像，利用该方法能将基因编辑效果进行体外表达，克服了体内表达周期长的问题，能快 速的对基因的转染效率做出迅速和可靠的评估，有效的提高了对祀序列的定向分析、检测 作用，提高了祀序列选择的准确度。 【【附图说明】】
[0052] 图1为PPDNA330载体结构示意图；
[0053] 图2为ALK6多物种同源比对及祀标1的设计位点图；
[0054] 图3为ALK6多物种同源比对及祀标2的设计位点图；
[0化5] 图4为ALK6打祀效率巧光表达检测图；
[0056] 图5为肥LA细胞ALK6基因突变测序结果图；
[0057] 图6为水牛成纤维细胞ALK6基因突变检测结果图。 【【具体实施方式】】
[0058] 本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥 的特征和/或步骤W外，均可W W任何方式组合。
[0059] 本说明书(包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可 被其他等效或具有类似目的的替代特征加W替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列 等效或类似特征中的一个例子而已。
[0060] 实施例：
[0061 ] 一、PPDNA330载体的制备：
[0062] (一）优化puro基因，去除其编码区内的酶切位点，并人工合成后，连入PCDNA3.1 (-)载体制备成pPDNA载体。puro优化后的序列见序列表。方法如下：
[0063] 1、优化puro基因，去除其编码区内的酶切位点，但不改变其氨基酸组成，于生工生 物工程（上海）股份有限公司进行puro基因人工合成，合成puro基因位于puc57-pu;ro载体 中。
[0064] 2、应用 StuI (Ferments)和 ClaKFe;rmen1:as)酶切 puc57-pu;ro,胶回收获得 puro 基 因，酶切体系为：酶切体系为puc57-pu;ro质粒化g，10 XhstDigest !5化，化L StuI，化L ClaI,加水至50化，37°C解育化;将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约1638bp的目的片段 回收，测定浓度，存于-20°C，备用；
[00化]3、应用5化1巧61'1116]11:日3)和6391191(化1'1116]11:日3)酶切9。0魁3.1(-)，胶回收获得线 性化的PCDNA3.U-)片段，酶切体系为：酶切体系为PCDNA3.U-)质粒化g，10X化StDigest 扣L，化L StuI，化L bspl 191，加水至50化，37°C解育化;将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 将约5427bp的目的片段回收，测定浓度，存于-20°C，备用；
[0066] 4、连接上述2、3两步获得的产物，连接体系：1化T41igase巧ermen化S)，化L 10 X T41igase Buffer(Fermentas)，线性化的pcDNA3.1(-)载体片段30ng，p;ruo基因30ng，加水 至10化，16°C过夜连接。将连接产物导入感受态细胞D册a进行转化，扩大培养，提取质粒并 进行序列测定，得到pPDNA载体。
[0067] (二）从携带CRISPR/Cas9的PX330载体上获得Cas9编码区，人工合成Ue-BsmbI- 曲NA区，克隆至pPDNA载体中制备了含有CRISPR/Cas9的PPDNA330载体，方法如下：
[006引 1、人工合成U6-BsmbI-gRNA序列，序列见序列表，片段位于PUC57载体中。
[0069] 2、应用MluI (Fermentas)和 NheKFermentas)酶切puc57-U6-BsmbI-gRNA，胶回收 获得U6-BsmbI-gRNA片段，酶切体系为：酶切体系为puc57-pim)质粒化g，10 X化StDigest 5 化，化L S化I，化L ClaI，加水至50化，37°C解育化;将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约 1638bp的目的片段回收，测定浓度，存于-20°C，备用；
[0070] 3、应用MluI (Fermentas)和NheI (Fermentas)酶切pPDNA载体，胶回收获得线性化 的pPDNA载体片段，酶切体系为：酶切体系为pPDNA质粒化g，10 X FastDigest扣L，化L MluI，化L NheI，加水至50化，37°C解育化;将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，巧U 定浓度，存于-20°C，备用；
[0071 ] 4、连接上述b、c两步获得的产物，连接体系：1化T41igase巧ermen化S)，化L 10 X T41igase Buffer(F'ermentas)，线性化的pPD NA载体片段30ng，UG-BsmbI-gRNA片段30ng， 加水至10化，16 °C过夜连接。将连接产物导入感受态细胞DH5a进行转化，扩大培养，提取质 粒并进行序列测定，得到pPDNA-gRNA载体。
[0072] 5、应用XbaI (Fermentas)和Not I (Fermentas)酶切pX330载体，胶回收获得cas9片 段，酶切体系为：酶切体系为阳330质粒化g，10 X化StDigest扣L，化L XbaI,化L NotI,加 水至50化，37°C解育化;将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20°C， 备用；
[0073] 6、应用XbaI (Fermen 化 S)和 NotI (Fermentas)酶切 pPDNA-gRNA 载体，胶回收获得线 性化的pPDNA-gRNA载体片段，酶切体系为：酶切体系为pPDNA-gRM质粒化g，10X 化StDigest扣L，化L XbaI，化L NotI，加水至50化，37 °C解育化;将酶切产物进行琼脂糖凝 胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20°C，备用；
[0074] 7、连接上述5、6两步获得的产物，连接体系：1化T41igase巧ermen化S)，化L 10 X T41 igase Buff er(F'ermen^s)，线性化的pPDNA-gRNA载体片段30ng，cas9片段60ng，加水至 1化L，16 °C过夜连接。将连接产物导入感受态细胞D册a进行转化，扩大培养，提取质粒并进 行序列测定，得到PPDNA330载体，载体序列见序列表，载体示意图见说明书附图1。
[0075] 二、祀向敲除基因克隆载体的构建：
[0076] 祀向多物种ALK6的gRNA寡核巧酸的设计及载体构建。从NCBI数据库中下载多物种 ALK6基因的核巧酸序列，并进行同源比对。同源比对结果见说明书附图2和说明书附图3。根 据gRNA的PAM设计原则及同源比对的结果，合成了 ALK6-1和ALK6-2共2对引物，引物序列分 别为，载体构建具体步骤如下：
[0077] 1、合成ALK6祀序列1 :5'-ATGATAGAAGAAGATGACTC-3'，其中上游序列5'- ACCGATGATAGAAGAAGATGACTC-3 '，其互补序列5 ' -AAACGAGTCATCTTCTTCTATCAT-3 ' ；祀序列2: 5 ' -GGATCAGGCCTCCCTCTGC-3 '，其中上游序列5 ' -ACCGGGATCAGGCCTCCCTCTGC-3 '，其互补序 列5 ' -AAACACAGAGGGAGGCCTGATCC-3 '，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。溶解 后，各取4.扣L，再加入化L IOXLA PCR Buffer(^kara)，混匀，95°C加热lOmin，然后置于 室溫化，形成带有BsmBI粘性末端的DNA双链；
[0078] 2、酶切PPDNA330质粒，酶切体系为PPDNA330质粒化g，10X肥B Buffers化L，0.化 L BsmBI，加水至20化，55°C解育化;将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度， 存于-20°C，备用；
[0079] 3、连接上述a、b两步获得的产物，连接体系：1化酶切PPDNA330质粒，酶切体系为 PPDNA330质粒化g，10X肥B Buffers化L，0.化L BsmBI,加水至20化，55°C解育化；将酶切 产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20°C，备用，2化10XT41igase Buffer(Fermentas) ,BsmBI酶切的pPDNA330载体30ng，祀序列及其互补序列形成的双链 DNA化L，加水至20化，16 °C过夜连接。将连接产物导入感受态细胞D册a进行转化，扩大培养， 提取质粒并进行序列测定，得到PPDNA330-ALK6-1和PPDNA330-ALK6-2载体。
[0080] S、基因敲除效率的验证
[0081 ] 1、祀序列敲除效率验证报告载体RGS-CR购自ToolGen,使用限制性内切酶EcoR巧口 Ba恤I对RGS载体进行线性化，酶切体系为：RGS质粒化g，10 X Buf ferK化L，0.化L EcoRI， 0.扣L BamHI，加水至20化，37°C解育化;将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的片段切胶回 收，测定浓度，存于-20°C，备用。
[0082] 2、合成ALK6的2条祀序列对应的RGS-邸报告载体序列#40(6-1和#40(6-2共2对引 物，其中#ALK6-1的上游引物序列为5 ' -AATTCGATGATAGAAGAAGATGACTCTGGG-3 '，下游引物序 列为5 ' -GATCCCCAGAGTCATCTTCTTCTATCATCG-3 '，#ALK6-2的上游引物序列为5 ' - AATTCGCGGATCAGGCCTCCCTCTGCTGGG-3 '，下游引 物序列为5 ' - GATCCCCAGCAGAGGGAGGCCTGATCCGCG-3 '，引物溶解成 1 OOiiM浓度后，经95°C处理 15min，而后 自然降溫过夜退火，分别得到2条带有EcoRI和BamHI粘性末端的DNA双链退火产物。
[0083] 3、T4连接RGS线性化产物和DNA双链退火产物，转化感受态细胞，挑取单菌落培养， 去内毒提取重组质粒，并通过测序验证质粒，获得RGS-#ALK6-1和RGS-#ALK6-2重组质粒。
[0084] 4、转染前一天，传代HEK-293T细胞于4个35mm的培养皿中。
[0085] 5、转染当天，准备4个1.5mL的离屯、管，每个管中分别加入100化的含10%FBS的 DMEM，再添加质粒；其中，1号管中力日500ng的pPDNA330-ALK6-l，100ng的RGS-#ALK6-1;2号管 中加 500ng 的 pPDNA330，100ng 的 RGS-#ALK6-1;3 号管中加 500ng 的 pPDNA330-ALK6-2，100ng 的RGS-#ALK6-2; 4号管中加500ng的PPDNA330，IOOng的RGS-#ALK6-2;最后每个管中加入化L 的罗氏转染试剂，混匀，室溫静止15min后，将混合液分别加入4个35mm的培养皿，并于37 °C、 5%C02培养箱中培养，4化观察巧光表达情况(见说明书附图4)。巧光显示，PPDNA330-ALK6- 2的绿色巧光的表达明显多于阴性对照PPDNA330,表明PPDNA330-ALK6-2能有效地引起 DSBs,造成ALK6基因突变。
[0086] 四、筛选出作用效果更好的表达载体，对人和牛的细胞进行转染，敲除ALK6基因。
[0087] 1、转染前一天，人化Ia细胞培养于35mm的培养皿中，培养基为含10%进口胎牛血 清(FBS)的DMEM，培养条件为37°C，5%的C02，转染当天，按照Life 3000试剂盒说明书导入2 iig的PPDNA330-ALK6-2质粒，转染后4她，膜酶消化收集细胞，并提取细胞基因组。
[008引 2、合成人ALK6基因敲除检测引物hALK6，其中上游引物5 ' -TTTACTTGGGAAACCATAACTA- 3 '，下游引物5 '-TGGATTGTAACCATACACCTAC-3 '，扩增长度为517bp，WpPDNA330-ALK6-2质粒 转染的细胞基因组为模板，进行PCR扩增，PCR体系为：10化2 X於im热书\及@HS (PremiX) (Takara)，DNA模板化L，上下游引物各0.扣L，水补至20化。反应程序:95 °C预变性5min，35循 环(95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec)，72°C再延伸7min，4°C终止反应。取上 述PCR反应的扣L PCR产物，直接进行2%的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，时间约30min。将PCR 产物切胶，回收，连接，转化，挑取单克隆，进行测序，PCR扩增产物连接入pEASY-Tl载体中， 并通过挑取单克隆细菌，测序，对ALK6基因突变进行检测，结果表明PPDNA330-ALK6-2能有 效地对人化Ia细胞ALK6基因进行编辑(检测结果见说明书附图5)。
[0089] 3、水牛成纤维细胞培养于60mm的培养皿中，培养基为含10%进口胎牛血清(FBS) 的DMEM，培养条件为37°C，5 %的C02，电转当天，膜酶消化收集细胞，通过电转导入化g的 PPDNA330-ALK6-2质粒，转染后4她，收集细胞并提取细胞基因组。
[0090] 4、合成水牛ALK6基因敲除检测引物bufALK6，其中上游引物5 ' -GCATTGGGTTAGAACAGGAT- 3 '，下游引物5 ' -CCTTTGTCCACTGCCCTA-3 '，扩增长度为 196bp，WpPDNA330-ALK6-2质粒转染 的细胞基因组为模板，进行P C R扩增，P C R体系为：10化2 X P ri m CS TA R及H S (P r e m i X) (Takara)，DNA模板化L，上下游引物各0.扣L，水补至20化。反应程序:95 °C预变性5min，35循 环(95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec)，72°C再延伸7min，4°C终止反应。取上 述PCR反应的扣L PCR产物，直接进行2%的琼脂糖凝胶电泳，电压120V，时间约30min。将PCR 产物切胶，回收，连接，转化，挑取单克隆，进行测序，PCR扩增产物连接入pEASY-Tl载体中， 并通过挑取单克隆细菌，测序，对ALK6基因突变进行检测，结果表明PPDNA330-ALK6-2能有 效地对人化Ia细胞ALK6基因进行编辑(检测结果见说明书附图6)。
[0091] 综上所述，本发明通过同源对比选择不同物种控制ALK6基因的两对同源性最高的 祀序列，利用CRISPR-Casg编辑系统构建带有祀序列基因的重组质粒，通过巧光蛋白表达法 检测能对敲除试验结果进行精确分析，构建了并选择了能祀向敲除ALK6基因的重组载体， 通过转染人的化Ia细胞和水牛的成纤维细胞，验证了该方法能适用于不同物种，甚至多物 种ALK6基因的敲除。本发明的方法具有打祀率高、准确、简单、高效、具有普适性的特点，有 效的提高了基因敲除效率和准确性。
[0092] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用W限定本发 明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属 于本发明所涵盖专利范围。
【主权项】
1. 一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步 骤： (1) 构建 PPDNA330-ALK6-1 和 pPDNA330-ALK6-2 载体，构建方法如下： A. 从基因数据库中下载多物种ALK6基因的核苷酸序列，并进行同源比对选取两对靶序 列，分别为ALK6靶序列 I : 5 ' -ATGATAGAAGAAGATGACTC-3 ' 和ALK6靶序列2 : 5 ' -GGATCAGGCCTCCCTCTGC-3'； B. 根据同源对比结果和gRNA的PAM设计原则，合成两对与靶序列不同，表达的蛋白相 同，带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链，分别命名为:ALK6-1和ALK6-2; C. 用BsmBI酶切pPDNA330质粒，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶回收； D. 用连接酶将ALK6-1和ALK6-2分别与BsmB頂每切后的pPDNA330质粒进行连接，得到重 组质粒载体，分别命名为:pPDNA330-ALK6-l和pPDNA330-ALK6-2; (2) 对重组质粒载体pPDNA330-ALK6-l和pPDNA330-ALK6-2进行敲除效率的筛选验证、 对比，选择ALK6基因敲除效率更高的重组质粒载体转染受体细胞； (3) 转染不同物种的受体细胞，收集转染之后的受体细胞，并提取细胞基因组进行测 序，根据基因组测序结果合成检测引物进行PCR扩增，扩增产物连接入pEASY-Tl载体，挑取 单克隆细菌，进行测序，对ALK6基因敲除表达结果进行检测。2. 根据权利要求1所述的应用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述ALK6-1 的上游序列为，5 ' -ACCGATGATAGAAGAAGATGACTC-3 '，下游序列为，5 ' -AAACGAGTCATCTTCTTCTATCAT-3 ' ；ALK6-2的上游序列5 ' -ACCGGGATCAGGCCTCCCTCTGC-3 '，下 游序列为，5' -AAACACAGAGGGAGGCCTGATCC-3'。3. 根据权利要求1所述的应用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述PPDNA330质粒构建方法如下： (1) 优化puro基因，去除其编码区内的酶切位点，但不改变其氨基酸组成:应用StuI和 Cla頂每切puc57-pur〇，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，回收获得puro基因； (2) 应用StuI和bspll9頂每切pcDNA3.1，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切凝胶，回收 获得线性化的pcDNA3.1片段； (3) 用T4连接酶将puro基因和pcDNA3.1片段进行连接得到pPDNA载体； (4) 人工合成U6-Bsmb I-gRNA序列，片段位于puc57载体中； (5) 用MluI和NheI酶切puC57-U6-Bsmb I-gRNA，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切凝 胶，回收获得U6-Bsmb I-gRNA片段； (6) 用MluI和NheI酶切pPDNA载体，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶回收 获得线性化的PPDNA载体片段； (7) T4连接上述U6-Bsmb I-gRNA片段和pPDNA载体片段，得到pPDNA-gRNA载体； (8) 用XbaI和NotI酶切pX330载体，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶回收 获得cas9片段； (9) 用XbaI和No?酶切pPDNA-gRNA载体，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶 回收获得线性化的pPDNA-gRNA载体片段； (10 )T4连接上述cas9片段和线性化的pPDNA-gRNA载体片段得到pPDNA330载体。4. 根据权利要求1所述的应用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述重组质粒载体PPDNA330-ALK6-1和pPDNA330-ALK6-2敲除效率的筛选验证选用荧光蛋白 表达法进行验证，具体方法如下： (1) 利用RGS-CR做为验证报告载体:使用限制性内切酶EcoR I和BamH I对验证报告载 体RGS-CR进行线性化； (2) 合成与ALK6靶序列1和ALK6靶序列2对应的两条带有EcoR I和BamH I粘性末端的 DNA双链，分别命名为：#ALK6-0P#ALK6-2; 其中，MLK6-1 引物的上游序列为:5 '-AATTCGATGATAGAAGAAGATGACTCTGGG-3 '， 下游序列为：5 ' -GATCCCCAGAGTCATCTTCTTCTATCATCG-3 ' ； #ALK6-2引物的上游序列为：5 '-AATTCGCGGATCAGGCCTCCCTCTGCTGGG-3 '， 下游序列为:5 ' -GATCCCCAGCAGAGGGAGGCCTGATCCGCG-3 ' ； (3) 采用T4连接酶将步骤（1)的RGS-CR线性化产物和步骤(2)带有EcoR I和BamH I粘性 末端的#ALK6-0P#ALK6-2两对DNA双链进行连接得到重组质粒载体，分别命名为：RGS_# ALK6-1 和 RGS-MLK6-2; (4) 取传代的HEK-293T细胞于4个培养皿中； (5) 取4个离心管编号为1、2、3、4,每个管分别加入含FBS的DMEM; (6) 然后在 1 号管加 pPDNA33〇-ALK6_l和RGS-MLK6-I，2号管加 Pl3DNA33O和RGS-#ALK6_ 1，3号管加 pPDNA330-ALK6-2 和 RGS-#ALK6-2，4 号管加 pPDNA330 和 RGS-#ALK6-2;最后在每个 管中加入罗氏转染试剂，混匀，室温静置后，将混合液分别加入培养皿，并于培养箱中培养， 培养完成后在焚光显微镜下观察目的基因的焚光表达情况。5. 根据权利要求1所述的应用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述受体细胞选用人的Hela细胞或水牛的成纤维细胞。6. 根据权利要求1所述的应用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征在于，所 述检测引物选用人或水牛的ALK6-2基因的上、下游序列做为检测引物，人ALK6-2基因检测 引物命名为：hALK6，hALK6上游序列为5 ' -TTTACTTGGGAAACCATAACTA-3 '，下游序列为5 ' -TGGATTGTAACCATACACCTAC-3 '，扩增长度为517bp ;水牛的ALK6-2基因检测引物命名为： bufALK6，bufALK6上游序列为5 ' -GCATTGGGTTAGAACAGGAT-3 '，下游序列为5 ' -CCTTTGTCCACTGCCCTA-3'，扩增长度为 196bp。7. 根据权利要求1-6所述任意一项应用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法，其特征 在于，所述应用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法可用于人或水牛的ALK6基因敲除。
【文档编号】C12N15/65GK105925608SQ201610471338
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】朱鹏, 梁贤威, 庞春英, 邓廷贤, 段安琴, 陆杏蓉
【申请人】广西壮族自治区水牛研究所